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1、 一、盐析沉淀法一、盐析沉淀法 盐析法盐析法： 在中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶在中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。液中的溶解度降低而产生沉淀。 早在早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白质（酶）等生物大分子物质。质（酶）等生物大分子物质。 （一）基本原理（一）基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是
2、水分子间的这些性质就本质而言是水分子间的氢键氢键和蛋白和蛋白质表面所暴露出的质表面所暴露出的N、O原子的相互作用原子的相互作用，所以，所以易受溶液温度、易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等值、介电常数和离子强度等参数的影响。参数的影响。 蛋白质在自然环境中通常是蛋白质在自然环境中通常是可溶可溶的，的， 表面：大部分是亲水基团表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团内部：大部分是疏水基团蛋白质呈稳定蛋白质呈稳定的分散状态的分散状态两性物质，一定两性物质，一定pHpH下表面带有一定的下表面带有一定的电荷，电荷，静电斥力作用静电斥力作用使分子间相互排斥使分子间相互排斥蛋白质周围的水分子有
3、序排列，在表面蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成形成水化膜水化膜，这一层能保护蛋白质粒子，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。避免因碰撞而聚沉。 当向蛋白质溶液中加入当向蛋白质溶液中加入中性盐中性盐时：时：低盐低盐-盐溶盐溶( (低盐情况下，随着中性盐离子强度的低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大增加，蛋白质溶解度增大) )高盐高盐-盐析盐析( (高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小) )盐离子部分中和蛋白盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间质的电性，使分子间排斥作用减弱排斥作用减弱中性盐的亲水性比蛋白质大，中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子
4、在水中发生水化作用盐离子在水中发生水化作用从而使从而使蛋白质脱去水化膜蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域暴露出疏水区域H+OH-+ +pHpI,pHpI,pHpI,带负电，带负电，有水膜，是稳定有水膜，是稳定的亲水胶体的亲水胶体_+ _pH=pIpH=pI时时, , 有水膜，有水膜，是不稳定的亲水是不稳定的亲水胶体胶体中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜+ +中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜_+ _中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜_中性盐中性盐中和电荷中和电荷SOSO4 42-2-中性盐中性盐中和电荷中和电荷NHNH4 4+ +或或NaNa+ +蛋白质的盐析机制示意图蛋白质的盐析机制示意图蛋白质沉淀蛋白质沉淀
5、蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关，还与有关，还与离子所带电荷数离子所带电荷数有关，高价离子影响更有关，高价离子影响更显著。显著。 通常用通常用离子强度离子强度表示对盐析的影响。表示对盐析的影响。1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5碳氧血红蛋白的碳氧血红蛋白的lgS与与(NH4)2SO4离子强离子强度度的关系的关系S0(离子强度离子强度)lgS盐析盐析盐溶盐溶盐析区盐析区:lgS = - Ks 蛋白质溶解度蛋白质溶解度常数常数盐析常数盐析常数 盐离子强度盐离子强度蛋白质溶解度蛋白质溶解度起始蛋白起
6、始蛋白浓度浓度 （二）无机盐的选择（二）无机盐的选择 在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH(NH4 4) )2 2SO4, SO4, Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4, K3PO4。(NH4)2SO4原因原因廉价廉价在水中溶解度大，且溶解度随温度变在水中溶解度大，且溶解度随温度变化小，低温下仍具有较大的溶解度化小，低温下仍具有较大的溶解度对大多数蛋白质的活力无损害对大多数蛋白质的活力无损害0 20 40 60 80 100中性盐中性盐温度（温度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.6 75.4 81
7、.0 88.0 95.3 1034.9 18.9 48.3 45.3 43.3 42.2 - 34.5 44.4 54.6 63.6 70.81.6 7.8 54.1 82.6 93.8 101 常用盐析剂在水中的溶解度（常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水）水）盐析效果：阴离子盐析效果：阴离子 阳离子阳离子尤其以尤其以高价阴离子高价阴离子更为明显。更为明显。常见阴离子常见阴离子的盐析作用顺序：的盐析作用顺序：PO43- SO42- CH3COO Cl NO3 ClO4 I SCN阳离子阳离子对盐析效果的影响：对盐析效果的影响：Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+
8、 NH4+ K+ Na+ Li+无机盐可按两种方式加入溶液中：无机盐可按两种方式加入溶液中：直接加入固体直接加入固体(NH(NH4 4) )2 2SO4SO4粉末粉末工业生产工业生产 ( (分批加入，充分搅拌分批加入，充分搅拌) )加入加入(NH(NH4 4) )2 2SO4SO4饱和溶液饱和溶液实验室和小规模生产实验室和小规模生产 ( (防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释) ) （三）影响盐析的各种因素（三）影响盐析的各种因素 无机盐的加入量无机盐的加入量蛋白质的浓度蛋白质的浓度温度温度pHpH操作方式操作方式1.1.无机盐加入量的影响无机盐
9、加入量的影响1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5S0(离子强度离子强度)lgS盐析盐析蛋白质溶解度蛋白质溶解度0 2 4 6 8 10-0.500.50-1.00(离子强度离子强度)lgS蛋白质溶解度蛋白质溶解度 0不同蛋白质溶解度与离子强度的关系不同蛋白质溶解度与离子强度的关系蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同 对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。定的蛋白质盐析
10、分布曲线。 30lgS蛋白质溶解度蛋白质溶解度20 30 40 50 60 702040100P不同不同(NH4)2SO4 饱和度饱和度C0蛋白质沉淀的速度可用蛋白质沉淀的速度可用 - - 对盐饱和度（对盐饱和度（P P）作图来表示：作图来表示：dSdP 620 30 40 50 60 704820dSdP 蛋白质溶解度随蛋白质溶解度随(NH4)2SO4 饱和度而变化的速率饱和度而变化的速率P利用不同利用不同蛋白质盐析分布蛋白质盐析分布曲线曲线在横轴上的位置不同，在横轴上的位置不同，可采取可采取先后加入不同量无先后加入不同量无机盐机盐的办法来分级沉淀蛋的办法来分级沉淀蛋白质。白质。2.2.蛋白
11、质浓度的影响蛋白质浓度的影响 蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。 随浓度提高，盐用量减少随浓度提高，盐用量减少。 640 50 60 70 804820dSdP P不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线3g/L30g/L分级沉淀分级沉淀：将溶液稀释，使重叠将溶液稀释，使重叠曲线拉开距离曲线拉开距离制取成品制取成品：提高蛋白质浓度提高蛋白质浓度3.3.温度的影响温度的影响低盐浓度：温度升高，溶解度升高低盐浓度：温度升高，溶解度升高高盐浓度：温度升高，溶解度降低高盐浓度：温度升高，溶解度降低 温度适当提高有利于蛋白质沉
12、淀。温度适当提高有利于蛋白质沉淀。 高温容易导致蛋白质变性。高温容易导致蛋白质变性。 蛋白质盐析一般在蛋白质盐析一般在室温室温下进行，某些温度下进行，某些温度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。 4.pH 4.pH的影响的影响 蛋白质在蛋白质在pIpI时的溶解度最小，最容易从时的溶解度最小，最容易从溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质的的pIpI附近。附近。 耗盐少，蛋白质收率也高耗盐少，蛋白质收率也高 5. 5.操作方式的影响操作方式的影响 10 50 60 70 饱和度饱和度（%）52.51 酶活性酶活性 U/ml操作
13、方式对延胡索酸酶盐析的影响操作方式对延胡索酸酶盐析的影响固体，固体，间歇间歇12h12h饱和溶液，饱和溶液，间歇间歇12h12h饱和溶液，饱和溶液，连续连续12h饱和溶液，饱和溶液，连续连续1.6min采用间歇方式所需盐量比连续方式少；采用间歇方式所需盐量比连续方式少；间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。 6. 6.盐析法的优缺点盐析法的优缺点（1 1）优点：）优点： 室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活；活； 非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；非蛋白的杂质很少被夹带沉淀； 适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 设备简单，操作方便。设备简单，操作方便。 （2 2）缺点：）缺点： 沉淀物中含有大量盐析剂沉淀物中含有大量盐析剂 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上直接用于医药上 盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。
