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1、常用细菌生化反应常用细菌生化反应n触酶试验n凝固酶试验n胆汁溶菌试验n氧化/发酵试验n氧化酶试验n苯丙氨酸脱氨酶试验n硝酸盐还原试验n糖发酵试验n吲哚试验（靛基质试验）n甲基红试验 nV-P（Voges-Proskauer）试验 n枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验n克氏双糖铁（KIA）复合试验 n动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验 u原理：原理： 有触有触酶酶的细菌能催化过氧化的细菌能催化过氧化氢生成水和初生态氧，继而形氢生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。成氧分子出现气泡。触酶试验触酶试验u方法：方法：用接种环取备检菌少许，置于洁净用接种环取备检菌少许，置于洁净的玻片上，滴加的玻片上，滴
2、加3%的过氧化氢的过氧化氢1 12 2滴，观察结果。滴，观察结果。试管法：用洁净的玻棒蘸取待检菌试管法：用洁净的玻棒蘸取待检菌少许，置于装有少许，置于装有3%过氧化氢的试管过氧化氢的试管内，观察结果。内，观察结果。触酶试验方法触酶试验方法触酶试验结果触酶试验结果应用：应用： 用于革兰阳性球菌初步分属。用于革兰阳性球菌初步分属。注意事项：注意事项：血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验u原理：原理： 有些细菌能产生血浆凝固有些细菌能产生血浆凝固酶，可以使人和动物血浆中的酶，可以使人和动物血浆中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白，纤维蛋白原转化成纤维蛋白，从而使血浆凝固。从而使血浆凝固。u方法：方法：玻片法：取洁净
3、玻片一张，加生理盐水两小滴于玻片两端，玻片法：取洁净玻片一张，加生理盐水两小滴于玻片两端，用接种环挑取待检菌落和对照菌均匀涂于盐水中，制成浓用接种环挑取待检菌落和对照菌均匀涂于盐水中，制成浓菌液，加兔或人血浆一滴于菌液中，观察结果。菌液，加兔或人血浆一滴于菌液中，观察结果。试管法：于试管法：于3 3支试管中分别加入支试管中分别加入1:4稀释的血浆稀释的血浆0.50.5ml，1 1支支管加入待检菌肉汤培养物管加入待检菌肉汤培养物0.50.5ml, ,另两支分别加阴阳性对照另两支分别加阴阳性对照菌肉汤培养物菌肉汤培养物0.50.5ml，3535培养培养3 34 4h后观察结果。后观察结果。u应用：
4、主要用于金葡菌的鉴定。应用：主要用于金葡菌的鉴定。血浆凝固酶试验方法血浆凝固酶试验方法 (-)(-)凝固酶凝固酶(+)(+)1 1）凝固酶试验凝固酶试验 玻片法测定结合型凝固酶；试管法测定分泌型凝固酶。金黄色葡萄球菌、中玻片法测定结合型凝固酶；试管法测定分泌型凝固酶。金黄色葡萄球菌、中间型葡萄球菌呈现阳性反应。间型葡萄球菌呈现阳性反应。路邓路邓葡萄球菌产生结合型凝固酶而不分泌游离葡萄球菌产生结合型凝固酶而不分泌游离型凝固酶型凝固酶, , 因而玻片凝固酶试验阳性、试管凝固酶试验阴性。因而玻片凝固酶试验阳性、试管凝固酶试验阴性。玻片法玻片法少许菌落少许菌落 + 兔血浆兔血浆 10 s 内出现凝集为
5、阳性内出现凝集为阳性阳性：金葡、中间葡阳性：金葡、中间葡阴性：其它葡萄球菌阴性：其它葡萄球菌试管法试管法:试管试管2支，各加支，各加0.5 ml兔血浆，取被检兔血浆，取被检菌和阳性对照菌分别加血浆混匀，菌和阳性对照菌分别加血浆混匀，37 水浴水浴34 h （3 3）种的鉴定）种的鉴定 (-)(-)商品化的商品化的胶乳凝集试验胶乳凝集试验(+)(+)u原理：原理： 胆盐、去氧胆酸钠和硫磺胆酸钠能胆盐、去氧胆酸钠和硫磺胆酸钠能选择性地溶解肺炎链球菌，胆汁降低选择性地溶解肺炎链球菌，胆汁降低细胞膜的张力细胞膜的张力- -膜破损或裂解膜破损或裂解胆汁溶菌试验胆汁溶菌试验u方法：方法：平板法：取胆酸钠溶
6、液一环，放在平板的平板法：取胆酸钠溶液一环，放在平板的菌落上，菌落上，3530min3530min观察结果。观察结果。试管法：于试管法：于0.9ml0.9ml培养了培养了18182424小时的菌小时的菌液中，加入取氧胆酸钠试剂液中，加入取氧胆酸钠试剂0.1ml0.1ml或牛胆或牛胆盐盐0.2ml0.2ml混匀，混匀，3737水浴水浴101030min30min，观察，观察结果。结果。u应用：应用： 主要用于肺炎链球菌与甲型链球菌。主要用于肺炎链球菌与甲型链球菌。胆汁溶菌试验方法胆汁溶菌试验方法CAMP试验试验u原理原理： B群链球菌能产生一种胞外因子群链球菌能产生一种胞外因子CAMP, ,它能
7、增强金黄色葡萄球菌它能增强金黄色葡萄球菌-溶溶血毒素的活性，因此，在两菌交界处血毒素的活性，因此，在两菌交界处出现箭头样的溶血增强区。出现箭头样的溶血增强区。u方法：方法： 取血平板一块，用产生取血平板一块，用产生-溶血毒素的溶血毒素的金葡菌在中央划一道线，将待检菌据此线金葡菌在中央划一道线，将待检菌据此线0.5cm0.5cm处垂直划线。处垂直划线。351824351824小时培养，小时培养，观察结果。观察结果。u应用：应用： 用于鉴定用于鉴定B B群链球菌。群链球菌。CAMP试验方法试验方法3 3）CAMPCAMP试验试验 无无乳乳链链球球菌菌能能产产生生CAMPCAMP因因子子，它它可可促
8、促进进金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌溶溶血血能能力力，使使其其产产生生显显著著的的协协同同溶溶血血作作用用。本本法法可可作为无乳链球菌的初步鉴定试验作为无乳链球菌的初步鉴定试验13涂片：涂片：G+C触酶试验触酶试验链球菌链球菌肠球菌肠球菌+葡萄球菌、微球菌葡萄球菌、微球菌 标本标本氧化酶氧化酶(双糖双糖) (O)+ (F)微球菌微球菌葡萄球菌葡萄球菌凝固酶试验凝固酶试验鉴鉴定定流流程程+金葡金葡表葡、腐生表葡、腐生新新生生霉霉素素表葡表葡腐生腐生SR14 触酶试验：触酶试验：阴性阴性链球菌属链球菌属鉴定流程鉴定流程观察血平板上溶血环观察血平板上溶血环-溶血环溶血环非非-溶血环溶血环Optochi
9、n、杆菌肽杆菌肽、胆七胆七 、高盐高盐 杆菌肽杆菌肽 、CAMP、胆七胆七 、高盐高盐 非非溶血链球菌鉴定溶血链球菌鉴定菌菌 种种OptochinOptochin敏感试验敏感试验胆汁溶菌试验胆汁溶菌试验胆汁七叶苷试验胆汁七叶苷试验肺炎链球菌肺炎链球菌S S+ +草绿色链球菌草绿色链球菌R R牛链球菌牛链球菌R R+ +氧化氧化-发酵试验发酵试验又称O/F试验或Hugh-Ldifson（HL）试验u原理：原理： 细菌分解葡萄糖对细菌分解葡萄糖对O2需求不同，需求不同， 氧化型：氧化型：细菌只在有氧环境中分解葡萄糖细菌只在有氧环境中分解葡萄糖; ; 发酵型：发酵型：细菌可在有氧、无氧环境中分解细菌
10、可在有氧、无氧环境中分解G;G; 产碱型：产碱型：细菌在有氧、无氧环境中都不细菌在有氧、无氧环境中都不 分解葡萄糖分解葡萄糖; ;葡萄糖氧化葡萄糖氧化/ /发酵试验发酵试验硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验n某些细菌能还原培养基中的硝酸盐-亚硝酸盐、氨和氮。原理：原理：u原理：原理： 使硝酸盐还原的细菌能从硝酸盐中使硝酸盐还原的细菌能从硝酸盐中获得氧，使其成为亚硝酸盐或其它还获得氧，使其成为亚硝酸盐或其它还原物。培养基中的原物。培养基中的亚硝酸基亚硝酸基能与能与-萘氨和苯磺酸形成红色的萘氨和苯磺酸形成红色的N-N-萘氨萘氨偶氮苯磺酸。若出现红色现象则说明偶氮苯磺酸。若出现红色现象则说明该菌还原硝酸盐
11、。该菌还原硝酸盐。 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验u方法：方法： 取一环待检菌接种到硝酸盐琼脂斜取一环待检菌接种到硝酸盐琼脂斜面上，面上，3535培养培养18241824小时，然后依次小时，然后依次加入含加入含-萘氨和对氨基苯磺酸的试剂萘氨和对氨基苯磺酸的试剂各各1mL1mL，30s30s后观察结果。后观察结果。硝酸盐还原试验方法硝酸盐还原试验方法u应用：应用： 有助于鉴别肠杆菌科、奈瑟菌属、布有助于鉴别肠杆菌科、奈瑟菌属、布兰汉菌属、假单胞菌属等兰汉菌属、假单胞菌属等氧化酶试验氧化酶试验u原理：原理： 某些细菌具有细胞色素氧化某些细菌具有细胞色素氧化酶，能将二甲基对苯二胺或四酶，能将二甲基对苯
12、二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化成紫红甲基对苯二胺试剂氧化成紫红色醌类化合物色醌类化合物u方法：方法： 滤纸法：用洁净滤纸蘸取菌落，加一滴试滤纸法：用洁净滤纸蘸取菌落，加一滴试剂，观察结果剂，观察结果菌落法：直接在菌落上加试剂，观察结果菌落法：直接在菌落上加试剂，观察结果纸片法：使用试剂浸泡制成的试剂纸片，纸片法：使用试剂浸泡制成的试剂纸片，取足够的菌落，观察结果。取足够的菌落，观察结果。u应用：用于科别鉴定试验。应用：用于科别鉴定试验。氧化酶试验方法氧化酶试验方法苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验u原理：原理： 有苯丙氨酸脱氨酶的细菌，可以有苯丙氨酸脱氨酶的细菌，可以使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸
13、，苯使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸，苯丙铜酸与三氯化铁作用形成丙铜酸与三氯化铁作用形成绿色绿色化化合物。合物。u方法：方法：琼脂斜面法：将待检细菌接种到苯丙氨酸琼琼脂斜面法：将待检细菌接种到苯丙氨酸琼脂斜面上，脂斜面上， 3535培养培养24244848h，取出，将三，取出，将三氯化铁试剂氯化铁试剂4 45 5滴滴于斜面上，观察结果。滴滴于斜面上，观察结果。快速纸片法：将待检菌涂于苯丙氨酸纸片上，快速纸片法：将待检菌涂于苯丙氨酸纸片上，孵育孵育1515min，取出，滴加三氯化铁试剂，立，取出，滴加三氯化铁试剂，立即观察结果。即观察结果。苯丙氨酸脱氨酶试验方法苯丙氨酸脱氨酶试验方法n应用：应用：多用
14、于肠杆菌科的鉴定。多用于肠杆菌科的鉴定。 变变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属为阳性。菌属为阳性。1.糖发酵试验糖发酵试验【原理】：n各种细菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，对糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后仅产酸，有的分解后产酸产气，故可用来鉴别细菌。【方法】：n将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种葡萄糖、乳糖发酵管，35C培养18-24h 观察结果。1.糖发酵试验糖发酵试验【结果】：n首先确定细菌是否生长，细菌生长者培养基呈混浊状：1）不分解糖，培养基顔色与接种前无变化，以“-”表示；2）分解糖产酸不产气，培养基由紫色变为黄色，以“+”表示
15、；3）分解糖产酸产气，除培养基顔色变化外，倒管中还有气泡，以“”表示。2.吲哚试验（靛基质试验）吲哚试验（靛基质试验）【原理】：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与吲哚试剂形成红色化合物。【方法】：大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，35C18-24h后，加入吲哚试剂数滴，静置分层，观察结果。【结果】：在培养物液面上层呈玫瑰红色为阳性，不变色者为阴性。3.甲基红试验甲基红试验【原理】：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基pH 在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色（阳性）；有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步化为醇、酮等
16、非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂后呈黄色（阴性）。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种葡萄糖蛋白胨水培养基中，35C18-24h，加入甲基红指示剂2-3滴观察结果。【结果】：红色为阳性，黄色为阴性。 4.V-P（Voges-Proskauer）试验）试验【原理】：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反应。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水中，35C，24-48h，
17、加入VP试剂甲液和乙液各1滴，充分摇动，观察。【结果】：红色为阳性，若为阴性应再培养4h观察，仍无红色者为阴性。5.枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验【原理】：当细菌可以利用铵盐作为唯一氮源，同时柠檬酸盐为惟一碳源时，可在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色为阳性，培养基不变色（绿色）为阴性。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于柠檬酸盐培养基中，35C，24-48h，观察。【结果】：菌苔出现，培养基变为深蓝色为阳性。细菌不能生长，培养基不变色（绿色）为阴性。6.克氏双糖铁（克氏双糖铁（KIA）复合试验）复合
18、试验【原理】：该培养基用酚红指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色。细菌如能发酵乳糖和葡萄糖而产酸产气，则斜面与底层均呈黄色，且有气泡。如只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层由于是在相对缺氧状态下，细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化挥发而保持黄色。如细菌分解蛋白产生硫化氢，则与硫化亚铁作用生成黑色的硫化铁，使培养基变黑。6.克氏双糖铁（克氏双糖铁（KIA）复合试验）复合试验【方法】：将待检菌接种于克氏双糖铁培养基（底层穿刺，上层斜面划线），35C，24h，观察。【结果】：发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则上层和底层均呈黄
19、色且有气泡产生；只发酵葡萄糖而不发酵乳糖，则底层变黄，上层仍为红色。如底层变黑，说明该菌产生硫化氢，生成黑色的硫化铁沉淀。7.动力、吲哚及脲酶（动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验）复合试验【原理】：培养基为含尿素、蛋白胨的半固体培养基，指示剂为酚红。具色氨酸酶的细菌能分解色氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂后，培养基上层的吲哚会变红；具脲酶的细菌能分解尿素产氨，使整个培养基变碱呈红色；有动力的细菌沿穿刺线扩散生长。【方法】：将大肠埃希菌和普通变形杆菌穿刺线接种于MIU培养基，35C，18-24h，观察动力和脲酶反应后，再滴加吲哚试剂。 【结果】：扩散生长为动力阳性；滴加吲哚试剂后呈玫瑰红色为阳性；培养
20、基变红脲酶阳性。 伊红美蓝培养基（EMB）EMB平板平板基基质 肉肉汤基基础培养基培养基抑制物抑制物 伊伊红、美、美蓝底物底物 乳糖乳糖 指示指示剂 伊伊红、美、美蓝 碱性碱性 无色半透明菌落无色半透明菌落 酸性酸性紫黑色或紫紫黑色或紫红色，且有金属光色，且有金属光泽菌落持点菌落持点为紫黑色或紫紫黑色或紫红色菌落色菌落为无色半透明菌落无色半透明菌落抑制作用抑制作用抑制抑制G菌菌用途用途分离沙分离沙门菌和志菌和志贺菌属的菌属的弱弱选择培养基培养基原理：（原理：（EMB平板平板)非致病菌非致病菌：致病菌：致病菌：美蓝美蓝 分分 解解乳糖乳糖伊红伊红结合结合紫黑色或紫红色化合物紫黑色或紫红色化合物不
21、分解乳糖，菌落呈不分解乳糖，菌落呈无色、半透明。无色、半透明。其它类似培养基？SS培养基培养基（Salmonella Shigella Agar Medium）SS平板平板基基质肉肉汤基基础培养基培养基抑制物抑制物胆胆盐、煌、煌绿、枸、枸橼酸酸钠、硫代硫酸、硫代硫酸钠底物底物乳糖乳糖指示指示剂中性中性红 pH（6.88.0） 碱性碱性黄色黄色 酸性酸性红色色菌落持点菌落持点为粉粉红色菌落色菌落为无色半透明菌落无色半透明菌落 抑制作用抑制作用抑制大抑制大肠杆菌及杆菌及G菌菌用途用途分离沙分离沙门菌和志菌和志贺菌属的菌属的强强选择培养基培养基原理：（原理：（ SS平板）平板）非致病菌非致病菌：致病菌：致病菌：胆盐胆盐 分分 解解乳糖乳糖乳酸乳酸胆酸胆酸中心浑浊的粉红色菌落中心浑浊的粉红色菌落不分解乳糖，菌落呈不分解乳糖，菌落呈透明无色；透明无色；枸橼酸铁能指示硫化枸橼酸铁能指示硫化氢的产生，使菌落中氢的产生，使菌落中心呈黑色心呈黑色注意：注意：注意：注意： 非致病菌并非被杀灭，故挑病原菌菌落时，尽量挑取菌落中非致病菌并非被杀灭，故挑病原菌菌落时，尽量挑取菌落中非致病菌并非被杀灭，故挑病原菌菌落时，尽量挑取菌落中非致病菌并非被杀灭，故挑病原菌菌落时，尽量挑取菌落中心部分心部分心部分心部分
