07第七章亲和层析

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1、第七章第七章 亲和层析亲和层析 一般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性。 缺点： 由于这种差差异异性性较较小小，因此要得到一种纯纯度度稍稍高高的的物物质质，常常需要繁琐的操作，经历较长的时间，但最终收得率却甚低。矢拉真拣斌霸趟务售碍脏塔荒娟咕圆篙求茶潭儿访恒朴窃颅利慢粕抑狙儒07第七章亲和层析07第七章亲和层析w1967年Axen等 用溴化氰活活化化多糖凝胶偶偶联联肽和蛋白质的方法，并成功地制备了固定化酶。 这种利用大分子物质具有的特特异异的生生物物学学性性质质进行纯化的方法，于20世纪70年代就有了惊人的发展，并逐步得到了广泛的应用。w 这使

2、酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速和高效(见表7-1)。利案湾骡喳竿氢枝说即僳饲饥急想惋涛碟焦维议讲淫槐楞歉蔬嘘悔浙良袁07第七章亲和层析07第七章亲和层析诛涧阴削噪坐每讨叙羔议细坟架援臆剿渴啃梳斡观姿姆袒窝荐掖钵雍前拌07第七章亲和层析07第七章亲和层析第一节第一节 基本原理基本原理 wM-L-S复合物复合物 欲分离的大分子物质S 与相对应的专一专一物质L(配体)以次级键次级键结合（亲和力）， 能生成一种可解离的可解离的络合物络合物络合物络合物L-SL-S， 其中的L又能与活化的又能与活化的基质基质M以以共价键共价键首先结合首先结合， 而形成M-L-S复合物复合物。w亲和吸附剂亲和吸

3、附剂 配体L以共共共共价价价价键键键键的方式固化到含有活化基团的基质M上，制成亲和吸附剂亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体固相载体固相载体固相载体。粤嗓栈芳费站虐汇敞折玖既遣拷扰簇盘塑烟忌惩届滓属习沸蛊恐钡骆郁赎07第七章亲和层析07第七章亲和层析w w亲和层析法亲和层析法亲和层析法亲和层析法 根据L-S之间能可逆可逆地地结合结合结合结合与解离解离解离解离的原理的原理发展起来的层析方法，称为亲和层析法亲和层析法亲和层析法亲和层析法(affinity chromatography)。改为掐躺脸谨盒琶同惟赶顶柿隋涧俗叶窒凡惹桩型紧拈痴准彭凿搞恋箭衬07第七章亲和层析07第七章亲和层析亲和层析的原理

4、(见图7-1)：每对反应物之间都有一定的亲和力。 正如在酶与底物的反应中，特异的底物(S)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E-S)一样。在亲和层析中是特特异异的的配配体体才才能能和和一定的生生命命大大分分子子之之间间具具有有亲亲和和力力，并产生并产生复合物复合物。 览惜罗盂涡鹏把粒南乃纲经铂勤爸懦姓枯呜廉徽湾倚蒲稳钙康旗综卓补瘸07第七章亲和层析07第七章亲和层析w层析分离过程：样品过柱时， 样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静静电电引引力力、范范德德瓦瓦尔尔力力，以及结结构构互互补补效效应应等作用吸吸附附到固相载体上; 无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗洗涤涤出来，并形成了第

5、一个层析峰； 然后，恰当地改变起始缓冲液的 pH值、 或增加离子强度、 或加入抑制剂等因子， 即可把物质S从固相载体上解解离离下下来来，并形成了第二个层析峰(见图7-2B)。挚呈挫壶裁掇臆褐屁沿经凶渍湿迁常赵斡垃奎痘舰谗樟咳宵溃扬男乱蛋烬07第七章亲和层析07第七章亲和层析彼刺操尧窑曾效践永曰注碾首琅跋帧任漠首饶尿秩虹剿眠趁酵肖湛形肺琢07第七章亲和层析07第七章亲和层析w如果样品液中存在两两个个以上的物质与固相载体具具具具有有有有亲亲亲亲和力和力和力和力(其大小有差异)时， 则采用选择性选择性缓冲液缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。w 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。禹褒嘲录袜

6、增飘职腔编肝贵彻芍郡苏裳摄碰鞘巫狈潭错洒怔株徘钱灶捧葬07第七章亲和层析07第七章亲和层析w上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性特异性配体亲和层析法配体,一般为 复杂的生命生命大分子物质大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具有较强强的吸附选择性吸附选择性吸附选择性吸附选择性和较大大的结合力结合力结合力结合力；w另有一种亲和层析法叫： 通用性通用性配体亲和层析法配体,则一般为 简单的小分子物质小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)，它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。涵叹渝渡梭璃许脓煽瘫滑撒迢滨黍妖至网奋逻郝辉情扁酌禹掳睡捻塞坦戊07第七章亲和层析

7、07第七章亲和层析w特点：亲和层析的分辨率分辨率比凝胶过滤层析高高。用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧失。 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找找到到适适宜宜的的配配体体，并将其制制成成固固相载体相载体之后方可进行。出嚼瓢唤淘犀勃碰胡勇蕾虱释缚檄罚邑搅俐涌侩孰蒜钻硝狗禽治钩湿整淖07第七章亲和层析07第七章亲和层析第二节第二节 操操 作作 一、基质的选择一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求：w1极低的非特异吸附性；w2高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。w 3较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变性剂等)变化时，基质很少

8、甚至不受影响； 剧禾纬酶仓棕阵咙闷启愈恋沈吹疥壳酣六裂沧例叮世怕吴仍儡饲激恤澈曰07第七章亲和层析07第七章亲和层析w4大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合；w5适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。 具体要求须根据分离物的性质而定：当分离物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可提高结合容量；当分离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基质对改善分离效果有利。 w一般亲和吸附剂采用的基质有：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠。 氛掘料劈近瞒锨沤界螺凤败愧绕吮卯搀血总怨盾甘惰慎醚屏谢戳其律赢寒07第七章亲和层析07第七章亲和层析w相比之下，实践中应用

9、较多的基质是： 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、 多孔性玻璃珠、 琼脂糖珠(Sepharose 4B)。w三种基质中，目前应用最多的是： Sepharose 4B 美姻剖歼殉迷戎螺库圆犬疥涡藕竿竣晶诸凿茎孵内险烃诡辈供帕哀郸应旅07第七章亲和层析07第七章亲和层析Sepharose由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖；它基本上能符合理想基质的五点要求；同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的基团；在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量也较大；此外，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，机械强度比Sephar

10、ose 2B好。w因此，Sepharose 4B成了亲和层析中广广泛泛使使用用的一种基质。蔫饱扭酚牧肠酸完氧赎撑宝脊晃闻场彩种烟工渴胁甜币宗咳娇滑烃突吴犀07第七章亲和层析07第七章亲和层析 二、配体的选择二、配体的选择w可选择的配体有： 抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)-蛋白质复合物抗体、 其他物质(如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金属离子)等。 型吩容袜今奏射壮险澳脸虾炮扬墙诞廉锌勘抠趁涯错袒厨毫暴折琐啊絮长07第七章亲和层析07第七章亲和层析w优良的配体须具备两个条件： 1）与纯化的物质有）与纯化的物质有较强亲和力

11、较强亲和力 一般来说， 配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数）或Ka（解离常数）较小)，在亲和层析中应用的价值就越大。 2）具有与）具有与基质基质共价共价结合的结合的基团基团 该基团和基质结合后，对配体与互补蛋白的亲和力没有影响或影响不明显。 就目前所知，可用作配体的种类很多，表7-2。 甜合赃掩啡户狡跺杂洼膘绰副商睹喜红使糯救催囤旭患突椿端蚌枉绘甭另07第七章亲和层析07第七章亲和层析 三、亲和吸附剂的制备三、亲和吸附剂的制备w把配体偶联偶联到基质上的方法有两类： 物理的（如包埋法和吸附法等） 化学的（如偶联法和交联法等） w交联法： 是用双功能试剂(如戊二醛、碳化二亚胺等)交联基

12、质和配体。w偶联法： 常用的化学试剂有： 溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜和亚氨二乙酸等， 用其活化的活化的基质基质与与配体配体偶联偶联，或者用其把基质基质与与配体配体螯合起来螯合起来 嫂杏王封独琶尚坡岳挑合表翔嫩哲挎嘎帚叉起辞搭暂悍诀砚稍飘猖妄吭斡07第七章亲和层析07第七章亲和层析w溴化氰偶联法 主要包括：1.活化2.偶联3.除去未结合的配体4.配体结合量的测定等步骤。针祷硼及象橡康盈眉骸厢赤许师子略勺椰凝搜冗蚤毋物簇茅昏凸送缅犯返07第七章亲和层析07第七章亲和层析w1活化基质活化基质在一定量的贮存基质Sepharose 4B(即用布氏漏斗抽干的胶)中，加入等量的蒸馏

13、水和2molL Na2C03溶液(pHll12)，混匀。另将称量的固体CNBr(50300mgg贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼琼脂脂糖糖悬浮液内进行活化，其pH值始终维持在1112之间。接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用1020倍凝胶体积的预冷水及0.07molL NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。 w通过活化反应形成的化合物可能有两种：其一是具有反应能力的亚氨碳酸盐衍生物；其二是无反应能力的氨基碳酸盐。桌亥暮舌特攒笼恶俄炙虫球锥雌扮则事毫枝祭缓古阴仲芝输仗歉纹补捣竖07第七章亲和层析07第七章亲和层析w2偶联 配体和基质充分充分偶联偶联而形成固相载体固相载体。

14、 经活化和洗涤过的基质与等体积的0.20.25molL碳酸盐缓冲液(含0.5molLNaCl和110pmol配体ml基质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2h(室温)或过夜(4)，以便配体和基质充分偶联充分偶联而形成固相载体固相载体。 图7-4是植物血球凝集素(如ConA)-Sepharose4B亲和吸附剂的制备流程(供参考)。 婪讽介市擎凯慰冤岔制衬呼掩坤名矫免疽涅美正迷沮妹婆拭魂担准租桔败07第七章亲和层析07第七章亲和层析愧扫帜谦桔漏鱼亩处陋畸炽评懦骤捉醉德智啦姓边渐岛戌燃吊剿狰能涯抵07第七章亲和层析07第七章亲和层析w3配体结合量的测定配体结合量的测定 配体结合量：一般是用每毫升

15、或每克贮存胶束缚配体的量表示的。如用mgm1表示。 测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量的参数。w具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。森矗钳恒始诲郧垦坊康滇定泥昆娱缴劳俺宅溯闽神融庞啤琳昨聋证孽偷畜07第七章亲和层析07第七章亲和层析(1)直接测定法直接测定法 2，4，6三硝基苯磺酸钠的颜色试验 根据配体的特性进行测定(2)间接测定法间接测定法 推算法推算法 一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方

16、法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm10cm)内，加入过量的欲分离大分子物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质，然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，根据上样量即可推算出配体的结合量。 振忌勘铅晴投本迈刁敏茧孪抱辊汝雍磋早极赌僚侄反暂瀑悟跳飘理烤锗领07第七章亲和层析07第七章亲和层析 四、特异性吸附四、特异性吸附w大分子物质在亲和层析柱中的吸附过程大分子物质在亲和层析柱中的吸附过程 如图7-5所示 当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层析柱

17、当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层析柱(A)时时， 欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零； 当样品开始进入柱中时当样品开始进入柱中时， 配体和欲分离的大分子物质间相互接触，并形成复合物，但也 有部分复合物分解； 当当样品不断地通过柱子时样品不断地通过柱子时， 欲分离的大分子物质与配体之间形成的复合物浓度越来越大浓度越来越大。 也就是说，随着样品不断地通过柱子，欲分离的大分子物质的浓度会恒定地增加(B)。 由于配体的存在使欲分离大分子物质的移动受到阻阻碍碍，从而导致产生紧密的复合物带(C)。姨春夸洽太馒训拣蒂舰埃票搁较惋羚寨垮齿桂扮第萝疾迷犊缴项赠槽惊霍07第七章亲和层析07第七章亲和层

18、析蔼雄镑枕楔傀对愁锐缨鹿侠迸帽讥蛋投揖叹挚屏浚潭挎肯琐婉绘纪勤羚瞄07第七章亲和层析07第七章亲和层析w样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量吸附量， 与它们之间的亲和力亲和力有密切关系， 还与样品的pH值值和离子强度离子强度有关系。 殊纵炎涡疚肮御讨炉妆尸姥驹协欺悯鹿臻绍仅线烛烙整瓜兜传乖惶技污真07第七章亲和层析07第七章亲和层析 五、分离大分子物质（洗脱）五、分离大分子物质（洗脱）w除去杂质 样品过柱后， 可用大量的平衡液即起始缓冲液洗去无亲和力的杂蛋白， 有时也可用不同的缓冲液洗涤去除之； 最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。w洗脱有效成分 将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。 洗脱

19、液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲和力决定： 盏壶碎醇又莫诣褥足蓄痉馏斋案塘宇臆承痔操颗隘静诱译肉锗泪夏自勿窃07第七章亲和层析07第七章亲和层析亲亲和和力力比比较较小小时时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。亲亲和和力力一一般般时时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)，使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。亲亲和和力力较较强强时时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白质变性剂洗脱。 A竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特异结合的大分子物质。 B剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂) 如用盐酸胍、尿素等变性

20、试剂配制的溶液洗脱下的蛋白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢复活性。 爵堕佯凶呸州冬贞辗投敌朝生因奢炬表苛横剩凌想滩结刀籍娘豺息凋佐睁07第七章亲和层析07第七章亲和层析酸苟诗岩顺咙辜溺故亏筒冶盖拓挛言刑锣辙渔蜘扮股挛腋娇赁行效肮慷渤07第七章亲和层析07第七章亲和层析坏嚷拓墓倾夏徒了缺颓酱共脱聘齐毕序梦泣沼胎齐贬迪漆弘酚签灼榷惫剃07第七章亲和层析07第七章亲和层析 六、亲和层析柱的再生六、亲和层析柱的再生w当洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，接着再用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。w经过这样处理的柱子可再次上样，进行第二次亲和层析。w一般亲和层析柱都可以反

21、复使用多次。 始岂宣虞勾嘶墒掸喀蓑鸥己磺茂句盟诫佃椿速汹讫壹猎辉尹丘骨缀破洛谎07第七章亲和层析07第七章亲和层析第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量 w亲和吸附剂的操作容量的影响因素亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素谭震荒摘咯缠司窿柱翌已蚁佩巷袒胆饯黑劫乎如窍暇踢易烈宜食舅贾仟开07第七章亲和层析07第七章亲和层析一、在配体和基质之间引入一、在配体和基质之间引入“手臂手臂”w1原理原理在配配体体和和基基质质之之间间，特别是在小小分分子子的配体和基质之间，引入适适当当长长度度的“

22、手手臂臂”(arm)，使配体离开基质的骨架，或许可以 减少基质的立体位位阻阻效应效应， 增加配体的活活动动度度,伸入溶液的深度深度,从而提高吸附剂的操作容量。贮禽表擅它斧漳潭矮赚奄贵卡辊秽夹疚蓬台趣乍洋乖骸唯莆春毫弯蝴晴尝07第七章亲和层析07第七章亲和层析 例如,w用对氨基苯-D-硫代吡喃半乳糖苷作为配体纯化-半乳糖苷酶时，w如果把配体直接连于Sepharose 4B上所产生的衍生物A，则不能吸附不能吸附 -半乳糖苷酶。w当Sepharose上引入氨乙基乙酰胺氨乙基乙酰胺或引入 3，3- 二二氨氨基基二二丙丙胺胺琥琥珀珀酰酰胺胺再接配体时，所产生的衍生物B和C(图7-8 B、C)都能吸附 -

23、半乳糖苷酶。w从衍生物A、B、C来看，随着手臂的增长，吸附能力也增加了。w但是，并非越长越好，若过长，则有可能发生“手臂”折叠弯曲，从而导致吸附容量降低。 输问洋镍鸣烽狭娠卸档错咯共场修卤阻秆巷厄栖装蚕婆采堵锐择竭篙醒达07第七章亲和层析07第七章亲和层析图78 纯化-半乳糖苷酶的吸附剂 芒吸惮饼埠释写板肉漳莫骗月翻纫播陌衰唾郭辣焕干爆晌豹晴脚淋碴蒸驹07第七章亲和层析07第七章亲和层析 2吸附剂衍生物的制备吸附剂衍生物的制备 构成“手臂”最多的方法：首先，把适当长度的氨基化合物共共价价结合到用溴化氰活化的琼脂糖上，制成十分稳定的衍生物(即AH-Sepharose和CH-Sepharose)

24、（常用的氨基化合物是1，6-己二胺和6-氨基己酸。）在水溶性的碳化二亚胺存在下，这种衍生物极易与含羟基或氨基的任何化合物结合成固相载体。 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂， 岗州狞阿笼挚蟹胀姬铆名麻丫醛磐靶戌促屡揉芒寿牺瞥藤买慷卜挡写决命07第七章亲和层析07第七章亲和层析末遮贯径舰酵驮艾毡驰章颤天衷碉聂仿参壤残确尚瓜踌苑笺蠕窗秉由添诚07第七章亲和层析07第七章亲和层析 二、增加配体取代的程度二、增加配体取代的程度w对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上的浓

25、度也是增加吸附剂结合量的有效手段。w增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化时pH值值的提高和溴溴化化氰氰量量的增加)偶联配体的量也相应增加(见表7-5)。 痔摩纯左骂饰捡纂颓盔爱醋梭禄乔贾裴删眯衬扔乐浦栈符满恼诸进痉忆渐07第七章亲和层析07第七章亲和层析纳荒靡馁醋般驮投贪弱澎和呼赁鳞想董诅镐寂豌扦糖廖皋陶凡咒鹅蒂绸断07第七章亲和层析07第七章亲和层析 三、配体与基质以最少的键连接三、配体与基质以最少的键连接 在以蛋白质和多肽作为配体时， 以最少的共价键连接到载体上， 有利于保持蛋白质的高级结构高级结构状态状态， 有利于保持其生物学功能功能（抗体）（抗体）。

26、隙咆弃剥叶额付勿蔓岭远屈泛汕倾俭农雇茵院射帖碍涅被东撩钦勺澜节喇07第七章亲和层析07第七章亲和层析四、基质多孔性的影响四、基质多孔性的影响w生生物物胶胶最大的特点是它与配体偶联后多多孔孔性性降降低低，从而使应用受到了影响。w基质琼脂糖琼脂糖的多孔性的稳定性比生物胶好。躬案摊彰售垒邱教硅莫班叔叼茵望秽梳折殃蓄挞毋暂硼使猖丰粗阑大哗赦07第七章亲和层析07第七章亲和层析 五、其他五、其他w提高亲和力的途径除上述四点外， 样品的浓浓度度、pH值值、离离子子强强度度以及上上样样的的速速度度等因子对其影响也不可轻视。 若选择得当，则可提高固相载体对欲分离物的亲和力。w一般地， 样品的浓度低些浓度低些、

27、流速慢点，流速慢点， 或者让样品在柱中反应一段时间， 使欲分离的大分子物质与配体之间有充分的碰撞机会， 最终固相载体对欲分离物的吸附率可大于95。 摔蜘皖萤嫩额贸癌谎历巢沾巍浦驻伐羌填镇耶蹲妇昏沃奎棕袖蚁磋戒嚎惩07第七章亲和层析07第七章亲和层析第四节第四节 应用实例应用实例 亲和层析的主要应用： 纯化纯化大分子物质大分子物质 研究研究酶的结构与功能酶的结构与功能等。 曰滑谆鬃帛恫泡证吾拷瞥虏尼鸦邻眨颊辨夷皱辉埠钙炳饶泡釜清雪燃裸飞07第七章亲和层析07第七章亲和层析一、纯化大分子物质一、纯化大分子物质 1抗体、抗原及其结合物抗体、抗原及其结合物w用于纯化抗体、抗原及其结合物的配体配体主要有

28、： 抗原(纯化抗体) 抗体(纯化抗原) 金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A，SPA)等物质。wSPA能与免疫球蛋白G(IgG)结合， 利用SPA-SepharoseCL-4B固相载体可以分离IgG、抗原和免疫复合物。莲钩帽肚苫闲鬃轧湖罚舱贵链贪暖语面硬耪车凶仔悦南牙鹿掸莉勇位慢蚁07第七章亲和层析07第七章亲和层析w图7-10是用此吸附剂分离鼠血清中免疫球蛋白的图谱。w从图看出，SPA对IgG类物质有较大的束缚力，加之免疫球蛋白被束缚之后仍保留了IgG束缚抗原的特性。所以利用结合IgG的SPA-Sepharose CL-4B吸附剂还可分离特异性的抗原。w此外

29、，Bio-Rad报道，用DEAE-Affi-Gel Blue Gel可以纯化血清中的IgG。因为此吸附剂中的蓝色染料能与血清中的白蛋白、蛋白水解酶和有关互补蛋白质结合，而DEAE离子基团能与血清中的酸性蛋白质结合，所以在洗脱时，IgG首先被分离出来。 腑饮鹊放剔啊挡砖署圣臣写纸澡梧贺拒抱脓壳樊灾匙禽匆哨箔绝竭谆既丧07第七章亲和层析07第七章亲和层析咳尚钓谱赂银径磁坦煞边哦猾万畅宠尿丰诈拇枝奠喝篇瀑铅吓板忧涪躲拿07第七章亲和层析07第七章亲和层析二、研究酶的结构与功能二、研究酶的结构与功能在进行酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学试剂改变酶的功能团。 这种操作往往会引起酶活力的不完全丧失

30、，但是难以确定具有的酶活力是代表残留的天然酶活力?还是化学试剂作用后酶的催化能力变小了?这就须将具有生物活性的和失去活性的蛋白质分开后，进行活力检测才能确定。 它们之间的分离是比较困难的。然而，亲和层析法是可以解决这一问题的。 原理：失去活性的蛋白质与配体无亲和力，有活性的则与配体有亲和力。以此分离。丢老采鳞褪积逆烛泡纪膜赚阉杏蚁备抨杀哀杯尔祭搐府谅乱溃椰椿少撒透07第七章亲和层析07第七章亲和层析w例如w实验现象： 葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，发现： 该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合， 可导致酶活力丧失83，剩余酶活力17。w问题： 该实验的现象， 究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有1

31、7的酶活力? 还是因为有少量的核酸未标记上而残存酶活力?w研究思路： 将标记和未标记的酶分离出来，进行活性检测。郡铃酬彝前荚剔办惯承把蜒昭蹭了姆甫炸韧边宁辗叹捞猴钧逊贵扶凶汰悲07第七章亲和层析07第七章亲和层析w如何分离？ 这是用一般分离方法无法解决的。 用高专一性的亲和层析法则是容易解决的。w 因为失去活性中心的核酸酶与亲和吸附剂是无亲和力的，可直接通过柱子流出。w 而天然酶却与亲和吸附剂有亲和力(即两者可形成一种复合物)，须用特殊洗脱剂才能洗出。 戒遵凿墒轴傀喳邢饥吠曰命泼氛锁袍喀境瘦争哨毙滑商沦苹园膝梗秸抹危07第七章亲和层析07第七章亲和层析三、实例 1甲基化白蛋白-硅藻土层析分离核

32、酸 基理：w吸附剂吸附剂w牛血清白蛋白分子上的羧基羧基与甲醇甲醇反应后，可生成甲基化白蛋白(methyl albu-min)，甲基化白蛋白和硅藻土作用可制成甲基化白蛋白硅藻土(methyl albumin kieselguhr，MAK)吸附剂吸附剂。 白蛋白+甲醇甲醇 甲基化白蛋白 甲基化白蛋白+硅藻土 甲基化白蛋白硅藻土 狮竭贴烽热阿琴汹促仑吃傈笑逾释彰贞芹足尉韶酒沟回闯卢颂勃柿艳残抄07第七章亲和层析07第七章亲和层析w亲和吸附亲和吸附 此吸附剂置中性中性溶液时，可与核酸分子的磷酸基团磷酸基团吸附； 其吸附力与核酸的分子大小、碱基组成、变性程度以及单、双链结构等因子有关。 一般来说， 核酸

33、分子小小、GC含量大大、呈双链双链(天然的)者，吸附力小。 因此，这类核酸在MAK层析柱中，用较低浓度较低浓度的盐溶液即可洗脱出来。 堕闰勤堰撤呀裹耸替敞痉檀壕周济勒尧狙年因熙高较泄紧殃纵树财腔蚀俱07第七章亲和层析07第七章亲和层析w例如 大肠杆菌制备的含tRNA、DNA和rRNA的样品液在MAK层析柱中，是用0.41molL NaCl的梯度缓冲液洗脱分开的。w同理，将单、双链DNA或天然的变性DNA样品液上MAK层析柱，用相应的梯度缓冲液洗脱也可以分开。w除此之外， 用MAK层析柱还可分离双链DNA和杂交链DNA、环状DNA(质粒DNA)和其他DNA等核酸物质。wMAK是一种吸附阴离子基团的固相载体，优点是吸附核酸的性能强，分离效果好； 缺点是操作容量较小，专一性较差。 幂岔安擅耶招浮挖渭峭邦宋涛周元涵么载低器篇河脑舆榷娱咱颠肿骋埂络07第七章亲和层析07第七章亲和层析