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1、酵母核糖核酸的分离及组分鉴定生物化学实验生物化学实验生物化学实验生物化学实验5533一、实验目的 1. 掌握RNA的提取方法2. 学会使用地衣酚法测定RNA的含量3. 熟悉和掌握离心机的使用方法二、实验原理 l由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。l酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%
2、，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。 l稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。lRNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，加钼酸铵沉淀（或用定磷法）和加银沉淀等方法测出上
3、述组份的存在。（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。（2）地衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。（3）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀(NH4)3PO412MoO3。二、实验原理 三、仪器、原料和试剂 l仪器：试管； 烧杯：100mL； 移液管：0.2mL(1)、2.0mL(2)、1mL(2)； 量筒：10 mL、50mL各一个； 滴管； 电磁炉； 离心机； 布氏漏斗。 l原料：干酵母粉低速离心机低速离心机三、仪器、原料和试剂 l试剂：（1）0.2%
4、氢氧化钠溶液；（2）10%硫酸；（3）硝酸银溶液（5%硝酸银溶液）；（4）1mol/L浓氨水；（5）酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl；（6）地衣酚试剂：100mg地衣酚，溶于100ml浓盐酸中，再加100mgFeCl36H2O或等量的CuO；（7）定P试剂： a.17%硫酸：17ml浓硫酸（比重）缓缓加入83ml水中 b.2.5%钼酸铵溶液：钼酸铵溶于100ml水中 c.10%Vc（抗坏血酸）溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水中。棕色瓶储存。溶液程淡黄色尚可使用。呈深黄色甚至棕色即失效。 临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合，a：b：c：水=1：1：1：2 四、实验步骤 1、
5、酵母RNA的提取（1）称8g干酵母粉悬浮于40mL 0.2%NaOH 溶液的100mL烧杯中 沸水浴加热30分钟，不断搅拌。（2）冷却后，4000r/min离心8分钟，将上清液慢慢倾入20mL酸性乙醇的烧杯中，边倒边搅。而后静置10分钟，待RNA完全沉淀，4000r/min离心8min。 （3）弃去上清，沉淀为RNA粗制品。 2、水解 RNA粗制品转移至三角瓶中，加10mL10%硫酸，盖上漏斗，沸水浴10分钟，过滤，弃去滤渣，滤液备用。3、RNA组分鉴定（1）嘌呤碱：取一支试管，加入20滴5%硝酸银溶液，逐滴加入浓氨水至沉淀消失，然后加入20滴水解液，静止，观察白色絮状沉淀生成即为嘌呤碱银化合
6、物沉淀。（2）核糖：取一支试管，加入20滴水解液，然后加入20滴地衣酚试剂，在沸水浴中加热5分钟，观察有没有变绿。（3）磷酸：取一支试管，加入20滴水解液，然后加入20滴定P试剂，在沸水浴中加热5分钟，观察有没有变蓝。五、结果与讨论五、结果与讨论六、注意事项l稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。l地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。l离心时要配平。l水浴时要搅拌，注意安全。七、思考题 l1. DNA对本法测定RNA含量是否有影响?若有影响，如何消除?l2.你能知道CuO或FeCl36H2O在地衣酚法测定RNA中的作用吗?
