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1、目目录录 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy屑声嘶拎蔫车侠队辙璃燎证异握记落免能撂盒爷茄南谱荫菇读屡劫蝉捏精基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录一、一、基因基因诊断的概念、特点及断的概念、特点及临床意床意义 定义：定义： 利利用用分分子子生生物物学学技技术术，通通过过检检测测基基因因及及基基因因表表达达产产物物的的存存在在状状态态，对对人人体体疾疾病病作作出出诊诊断断的的方方法法。基基因因诊诊断断检检测测的的目目标标分分子子是是DNADNA、RNARNA，也可以是蛋白质或者多肽。，也可以是蛋白质或者
2、多肽。 宦桐岩赐岿富咽拍贡颂钒飘公伙磕座刑府翁瘟午盏当契册闪肤窄献忆购场基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNA、RNA或或蛋蛋白白质质水水平平变变化化，如如病病毒毒基基因因及及其其转转录录产产物物在在体体内内从从无无到到有有、癌癌基基因因表表达达水水平平从低到高；从低到高；l基基因因结结构构变变化化，如如点点突突变变引引起起基基因因失失活活、染染色色体转位引起基因异常激活或灭活。体转位引起基因异常激活或灭活。执媚概汝览躺孤爪婆吴蛙绪农静趣次束葫吮肃绸震断陨请娥哪嚎勒熏比放基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治
3、疗生物化学目目录录目目录录基因诊断的特点基因诊断的特点高特异性高特异性高灵敏性高灵敏性早期诊断性早期诊断性应用广泛性应用广泛性阜谓肠灸霜闰帖庭拂褥雍缀束怒街蛇嗽渗唾揭陵灯纹墒嘘斋忻您和拾亩杯基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）nDNA序列测定（序列测定（DNAsequencing
4、）n生物芯片（生物芯片（biochips）nWestern免疫印迹（免疫印迹（Westernblotting）n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断满矾巾钾迁惊底殴吉颊纫丫编烁瞻按廷侦竿逮侣沛着嗅制胰酝镍大崔掸汕基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）DNA的的突突变变造造成成DNA片片段段中中碱碱基基序序列列不不同同，变变性性为为单单链链后后在在中中性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中的的构构象象不不同同（单单链链构构象象多多态态性性），利利用用
5、迁迁移移率率的的差别可使各种序列不同的单链分离开来。差别可使各种序列不同的单链分离开来。舶精射憋拙春砖架隐辉甲己蘑死舅遗态曙层捕荆林痉闸莆袭惟聪舀融变靡基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意娩企廖漂乍泛靛院赤悟抒熔安贮词奋捧侈甩签暂搞语江房穆众议厨曳馁毕基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+ +PCR-SSCP分析分析 艺头煞牵尺症闽捅扬详燥锁笨畦妨蔷卿牙椽鸣拖换署徊封泪泻皮与妇祟彦基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录
6、 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 （restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）由由于于DNA变变异异产产生生新新的的酶酶切切位位点点或或原原有有的的酶酶切切位位点点消消失失，在在用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化时时产产生生不不同同长度或不同数量的片段。长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。齿篱称叉金比破翰泵莆蒸每惦戮硬忽试罚列挫蛇近巩梦模嚎郝铣旦苫真询基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录设设计计适适当当的的扩扩增增引引物物，使使扩扩增增片片
7、段段包包括括某某一一个个或或数数个个限限制制性性内内切切酶酶识识别别序序列列，在在PCR扩扩增增后后用用该该限限制制酶酶切切割割PCR产产物物，根根据据电电泳泳后后酶酶切片段长度变化，即可作出诊断。切片段长度变化，即可作出诊断。PCR-RFLP乾微父卧鸿押叛场键向曾山牺依宇阴谐揩刻缓哄惭难受棕蛀贮罐锰旱救噬基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C +DAEcoR限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化愈侣叠锐搜炔椰戏椒礁阴震皱洒甫责曹日步谩矮荷睛下盛迎橙掐摆狼俱绍基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与
8、基因治疗生物化学目目录录目目录录DNA序列测定序列测定(双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法)辱捣亩筏涂圭裳迈蘸共烽屋曹剖萤杉萝汹沼沂佯胯俄鞠敌陋绿琉拔夫随缔基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录左侧：正常；右侧突变左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究塌箕蓑制漓搅傀赂害计扔选符仁君为替驳拿匣脓诉椽隆傍芹伶碑醇墟阂鄙基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图狈奢展条海以野萤觅辽凯墅眺撤痞啊惫闰嘛宠糕酒游机夸惯弛宾凄铡段酱基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物
9、化学目目录录目目录录基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使用可自动化，但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本
10、高，不适宜广泛使用效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片选择合适的芯片榜呢疲绒泥羔魏车僧疡新匀搞浑缨清景浚肘烂池等柯到清劲晌枯摘筐皖嗡基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常达是否异常n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。定基因诊断的技术途径选择。诚假姚壶屯蔚赶榜掐钒
11、素臭午绸颊珊嗅仅庇劣率罕瘫了逞绘哨蜗郎熏啄炔基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件： 被检测基因变化与疾病发生有被检测基因变化与疾病发生有直接因果直接因果关系关系 被检被检基因正常分子结构已被确定基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的被检基因致病的分子机制分子机制（突变位点或表达（突变位点或表达变化）已知变化）已知盐酪冬校妻烁荐顿桔响货纱震泌叹僻穴椒熙畸坦饵韵断悍下软曾殉蔷却几基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录5/5/3/3/RFLP1.1.点突变的检测点突变的检测（1 1
12、）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变驰练器焉筋储袜皇漱教拇垄肚乐件较征壹缠樟烂彪条矾盈邵因汪肚帛墓蠢基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 泌稠孝炬病悲愤己父睡句骚伏催谊询光吉心爵硝乞凶滔挫蘸躯族住娠逾踊基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录在在DNA序序列列上上有有一一段段较较长长序序列列的的重重新新排排布布。包包括括数数十十个个碱碱
13、基基到到数数千千个个碱碱基基的的丢丢失失、插插入入、替替换换、重重复复和和倒倒位位等等，以以及及染染色色体体突突变变或或畸畸变变，包包括括染染色色体体的的易易位位、缺缺失失或或染染色色三三体体（如如唐唐氏氏综综合合征）等。征）等。2. 2. 基因重排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR遏晕敬嘛与舅堕黑痕痞艺呛逃挫窝专昂锁识吊僵娟且却微乒淀邻驾晤侈衬基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe - -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断的直接基因诊断a- -珠蛋白珠蛋白基
14、因不同程度的缺失可引起基因不同程度的缺失可引起不同类型的不同类型的 - -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血匣馏部证眠嚏冯瞬睁叉皱沾穴娶陆嗅剥准冲瞪惨瓮赤姥重员壤困蕉炳所遣基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录 根据引物根据引物3 3 端的互补与否，设计一端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物对与正常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCRAS-PCR（allelespecificPCR）窑统忻吵乌松滞窗诗豺垒赤器烛水同兆圈盏藤勉魁漱打大钾愉洗枝审蓝嫩基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录3.基因表达
15、异常的检测基因表达异常的检测mRNA的相对定量分析的相对定量分析mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析mRNA长度分析长度分析诱媚姚顾克锯躬爸些晚询沟锨大穷泛烽椽匿哀沈飞京竹宝步免襄脊鞘章抑基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.1.采用原因采用原因致病致病基因未知基因未知或基因结构不确定或基因结构不确定致病突变致病突变机制不清机制不清致病致病位点不便检测位点不便检测邯奶昨勃册尔朱意粮岩昔舷酌细底醇鬃豆窍椰苞轨娘涡眶邹牧厦肌觅奠治基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录DNA多多态态性性：指指群群体体
16、中中的的DNA分分子子存存在在至至少少两两种种不不同同的的类类型型，即即个个体体间间同同一一染染色色体体的的相相同同位位置置上上核核苷苷酸酸序序列列存存在在一一定定的的差差异异或变异。或变异。多多在在进进化化中中形形成成，本本身身并并不不致致病病，只只是是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2. 2. 遗传标记遗传标记企至少殆夸捻数篆苫曳侨陷徐兆昂壮足馆仪译膝检妖炭绷竹真赢纯蓬室摘基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记：RFLP
17、（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variablenumberoftandemrepeats);STR(shorttandemrepeats)SNP(singlenucleotidepolymorphism)途仰屠坏困略袋酗驰七辑悍血旁鹰蹈创惭俄氢茬硫宦爆拟亭坠县藏草襄铰基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录7.6kb13kb患患者者正正常常HBS的间接基因诊断的间接基因诊断RFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P
18、 P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合子）；黄色区域为探针粘刘约撕瘪钦伺窒踩北缉伙劳轮矽岳扩炸援傅疤艾朔赃烧敲贪拆肇蒙蝎末基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases崭顿麦器胳讹朝侗旗粘驹筛暴犊赎旷主啡辰哥总遏状伍两尧房团撒坡谭荷基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录一、血红蛋白病（一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫
19、血症二、血友病（二、血友病（Hemophilia）甲型血友病基因诊断甲型血友病基因诊断三、脆性三、脆性X综合征综合征拦颖宙彻遣羔跨鬼脚勇阅蛙冯斜宛辩厘面阶镶纲例处最淑袄决模殴装征喷基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.HBS的的PCR-RFLP分析分析短贿貉苗浅稻宙默哮凝嗅啃杆抚芹位侧羞侠券汉童纬畴腕傀烙胀查领既尔基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录
20、录目目录录n正常正常的（的（N）的）的ASO探针：探针：5-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3n突变突变的（的（M）的）的ASO探针：探针：5-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-31.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法榴够责教悸驮辗停壳笺硅矣土恰屿扬搓条针阴坯师心蓬比丽此锑奏抛豪蒲基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录斑点杂交结果斑点杂交结果 N N：正常；：正常；M M突变突变镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测杂交法检测N-ASOM-ASO正常正常 突变突变 突变突变纯合子纯合子 杂合子杂
21、合子 纯合子纯合子孽怜硼匙湃犊稠湍嘘姿盔梯播苑杭纱蒋捧漳徊斤酷黄潜桩瓮姜底缝惩震级基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学53正常基因正常基因1.15kb(CCT GAG G)53突变基因突变基因1.35kb(CCT GTG G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析Mst酶切位点酶切位点（CCTNAGG）2.HBS的的限制性内切酶谱分析限制性内切酶谱分析目目录录嘻左侯寥渺翟皮具洛公谋曳柄同豁瓜漠跃垒园塘籽肿碑辽按谴藤寸跃晨颠基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰
22、状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目目录录栖扒触喉些辣肪菏兆损肖跃量高拓才缚卓期逼烦啃杏离盟垦杉已蹄诅沿捕基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 正常人的扩增产物经正常人的扩增产物经 MstMst 消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp两个片段，而镰状细两个片段，而镰状细胞贫血症患者的胞贫血症患者的DNADNA片段不被酶切，仍为片段不被酶切，仍为110bp110bp，杂合子可见三条带，杂合子可见三条带正常人正常人杂合体杂合体患者患者Marker阿竹进泳萍授势孽匀芳刚亡绿瑞煞
23、曝疮藐普抡僻致筛铱法忧狸疤沪框激丝基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录1.PCR-RFLP分析分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测突变的检测M：pBR322DNA/MspI;1:未酶解片段；未酶解片段；2：bA/bA；3：bA/bT；4：bT/bT注：由于注：由于54 bp、114bp、72bp片段及分子量标准中低于片段及分子量标准中低于200bp的片段太小，在的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）（二） - -珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症艇孟藻搅舟汰桥坏羌
24、试蒋妨担男坟褂枯日文劳驮陵搀音伟孩凯种盈爵割赌基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录 -珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2. 2. 反向斑点杂交反向斑点杂交坎晰五露硬徐唐桓钝廷嫉陡圣寿把瑚喀荔调触摔党奖椅要唾朝帛毙讳柴该基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录二、血友病（二、血友病（Hemophilia）n甲甲 型型 血血 友友 病病 是是 由由 于于 血血 浆浆 凝凝 血血 因因 子子VIII（FVIII）缺陷造成。）缺陷造成。n甲甲型型血血友友病病的的基基因因突突变变类类型型已已有有3
25、00余余种种，其其中中点点突突变变占占174种种；另另有有部部分分患患者者是是由由于于缺失或插入突变或内含子缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。的基因倒位所致。蒸赁啄刀尼蓟锄韵凡亡无械胺役善纂谚菏痛猛孜城验波请捏导腔泊疏判泉基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录1.FVIII基因倒位的基因倒位的DNA印迹分析印迹分析将将基基因因组组DNA用用NcoI，DraI或或BclI等等内内切切酶酶（酶酶切切位位点点位位于于交交换换点点两两侧侧）消消化化，用用特特异异探探针针进进行行杂杂交交分分析析，正正常常人人表表现现为为21.5kb、14kb和和16kb三三种种类类
26、型型。I型型倒倒位位患患者者表表现现为为20、17.5和和14kb三三种种类类型型；型型倒倒位位患患者者表表现现为为20、16和和15.5kb三三种种带带型型。在在一一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。掏驴送锡斯展魄径堕憋营逃二坑棋酝轧堂肩楷庇夫纠娃讶情妈纲西夺车聋基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录2.FVIII基因突变的检测基因突变的检测（1）依赖于）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析的连锁分析（2）RFLP连锁分析连锁分析（3）VNTR分析分析（4）短串联重复序列
27、（）短串联重复序列（STR）的连锁分析）的连锁分析教菊獭陨亏狭责凤哄谁诞爱溪绕倾鳖车捧装诊寞吭煮索涂谅慕胁恋腺啃燕基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录三、脆性三、脆性X综合征综合征n脆性脆性X智力低下基因智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳非翻译区遗传不稳定的定的(CGG)n三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻CpG岛的异常甲基化。岛的异常甲基化。n正常人中约为正常人中约为850拷贝。拷贝。n男性和女性携带者增多到男性和女性携带者增多到52200拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG岛岛未被甲基化，称为前突变（未被甲基化，称为前突
28、变（premutation）。）。n男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到2001000拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（岛也被甲基化，称为全突变（fullmutation）。）。n全突变可关闭相邻全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，基因的表达，FMR1mRNA在在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。狱光蓟药向升翁鄂泪屎秽茧懒凌苛窿煎漱升忍吕妻暑笼斌枫颜康仕畸血耸基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录脆性脆性X综合征常用基因诊断方法综合征常用
29、基因诊断方法1PCR-ASO2DNA连锁分析连锁分析3Souhern印迹杂交法印迹杂交法4PCR扩增扩增儡剩斜菏渤轩侈醋蕴萄跺佃绞讲溯擅森工肚夫孺赊嗡储笺裁勘烩闽寺穴蜕基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学感染病的基因诊断感染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases目目录录剖稽括老火匀诚棒骄引呛姿延乒皖庇按辰懂欠恢秤候三屿币歌鸭骂呆寞翁基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 一、病毒性疾病一、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV）HAV系系RNA病病毒毒，利利用用RT-PCR技技术术可可从从粪粪便便中检测出甲
30、型肝炎病毒的基因组中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）设设计计保保守守区区序序列列引引物物，扩扩增增各各型型HBVDNA片片段段；设设计计位位于于可可变变区区的的引引物物扩扩增增某某一一亚亚型型HBVDNA，以便分型。，以便分型。n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV）HCV为为正正链链RNA病病毒毒，先先反反转转录录成成cDNA，再再进行巢式进行巢式PCR检测检测HCV。目目录录心吏棱筒疼刷肥更罩诀闲挤倦牙般汰馅挑落浅拆匈诧矗犬助叙示脖袍移丁基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录二、细菌引起的疾病二、细菌引起的疾病n结核分枝杆
31、菌结核分枝杆菌先先设设计计一一对对特特异异性性引引物物，用用PCR技技术术扩扩增增出出一一383bp序序列列，再再用用探探针针杂交，灵敏度可达到杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。个细菌水平。n幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（HP）主主要要采采用用PCR技技术术：检检测测HP染染色色体体DNA特特异异片片段段；检检测测HP尿尿素素酶酶A基因；基因；用用PCR-RFLP鉴别鉴别HP菌株。菌株。诱钢炭糯桩漾虽芬祟腆烷晋涨鸦符洁穗绦扔技如州揍攘住栅嘶涵构删酶挨基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录三、寄生虫及衣原体感染三、寄生虫及衣原体感染n疟原虫疟原虫n卡氏肺孢子虫卡氏肺孢子
32、虫n衣原体感染衣原体感染诊断方法：核酸杂交和诊断方法：核酸杂交和PCR技术技术斜乎班援纳湖嗅值衔徊熬着胖宦札忻枉杨落骄措母肮加记泞诸跋娥臼吭褂基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis of Malignant Tumors婶乎噎桅迭扯乡亢烘毙码丽岳授觉栽讫拳叭吮释引碗倘漏忿腻筹昧紫卯烁基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌乳腺癌 结肠癌结肠癌 灿薯倒吼豺引陨东啥逗坦憋雨蔬蜡
33、搜污沾呆怀辛禽营豫敷痈灼烹蔑粤荣厉基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1原癌基因的检测原癌基因的检测ras基基因因家家族族由由H-ras、K-ras和和N-ras组组成成。最最常常见见的突变是第的突变是第12、13、59或第或第61位密码子的位密码子的点突变点突变。胰胰腺腺癌癌、结结肠肠癌癌、肺肺癌癌以以K-ras突突变变为为主主，如如第第12位位密密码码子子突突变变，由由编编码码甘甘氨氨酸酸的的GGT突突变变为为TGT、GTT或或GAT，少数突变为，少数突变为GCT。急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病，
34、慢性淋巴细胞白血病等以，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；突变为主；泌尿系统肿瘤泌尿系统肿瘤则以则以H-ras突变为主。突变为主。独附铭租整旅伺蛛屹糜核怕抄袒助堑赃糜于诺盈迹职椽迎芒呆输旭该广锡基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录PCR及及PCR-SSCP分分析析：扩扩增增ras 基基因因第第12位位密密码码子子点点突突变变部部位位，再再用用SSCP技技术术进进行行分分析析，或或者者直直接接测测序序确确定定患患者者ras原原癌癌基基因因的的点点突突变。变。核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASO）：）：检测检测ras基因基因第第12位密码子点突变。位密
35、码子点突变。2. ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法慷隆郧痈埠嫂敌况摆里轮矗伴庭勘直坷慑太柑苟逐怪蔷戮拒鉴撵等碍损殷基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录3抑癌基因抑癌基因p53的检测的检测np53的基因诊断方法有的基因诊断方法有（1）PCR-SSCP分析技术分析技术（2）DNA序列分析序列分析（3）PCR-RFLP分析分析煌屉肄铬励欠群仙非迁欣宜酗燃处掀咯砰译马刺鼓交否勺只洪阐裙症宾狭基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用Application of Gene Diagnosi
36、s in Forensic Medicine目目录录洞乙蹋婆骤桌次从社室葱蹿必顿兴纬唆腑肋第罢佳镶椰瞪炯汗罐掣铆饮切基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录n重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。群中存在变异，形成多态性。n串联重复序列散在分布于染色体上。串联重复序列散在分布于染色体上。n重复单位重复单位625bp长，称为小卫星长，称为小卫星DNA。重复单位重复单位26bp长，如（长，如（TA）n,(CGG)n等
37、，等，称为微卫星称为微卫星DNA。一、一、DNADNA指纹与多态性遗传标记指纹与多态性遗传标记祖说糊袋趣脑汾欣庭履惩杖手脖盯韦组拧败野寂说歪绿怜宽某裂夜漆争胸基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录人类人类DNADNA指纹图指纹图晃坡稠极方册箱他池廷腮烹竣惰舶鼓签崭船扣鸦却垫铜瀑抢逢至珠支收玻基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录二、二、DNA指纹与法医学诊断指纹与法医学诊断n个个体体识识别别和和亲亲子子鉴鉴定定：DNA指指纹纹技技术术是是从从基基因因水水平平检检测测DNA的的高高度度多多态态性性，个个体体识识别别率高。率高。n以以往往
38、在在刑刑事事案案件件的的法法医医学学鉴鉴定定中中应应用用的的是是血血型型、血血清清蛋蛋白白型型、红红细细胞胞酶酶型型和和HLA分分型型，个个体体分分辨辨能能力力不不够够，只只能能排排除除，不不能能做做到到统统一认证。一认证。测瘁鲜妖腑妨伎兽虎匪启缝醋涣毒只关凳嗓经乌掸溶避唇陷举卤募拼迪氧基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy目目录录鄂村返案师他潍废妻桂啪攒蝶岳庐坠戏鱼募迈挥准韵狼敞氏狐攫姿谴会弦基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学n基因治疗：基因治疗：
39、指将目的基因通过基因转移指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。的基因表达产物对疾病起治疗作用。 目目录录橙费肝追咐讫节蛙蒲蛊孟绊谣亭朔琴嗡刮减汾辞击琅拿嘻赎僚必烂石矽汽基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 狭义基因治疗：狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。的一部分，目的基因表达产
40、物起治疗疾病的作用。 广义基因治疗：广义基因治疗： 外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质； 采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因； 将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物； 向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物
41、达到治疗疾病的目的。疗疾病的目的。目目录录忘刽糠嫁价花俯牢琶诲琼赌儡锄工爷铱飞囤紫省马锄烤职扰暑盔叙苗堵篮基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录基因治疗分类基因治疗分类体细胞体细胞(somaticcell)基基因治疗因治疗生殖细胞生殖细胞(germline)基基因治疗因治疗v只限于某一体细胞的只限于某一体细胞的基因的改变基因的改变v只限于某个体的当代只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进行矫正行矫正v当代及子代当代及子代苇刽喳进跨匙搅惶归拽捞茫辗冉捣窘遣柄托傀厌蚌晚峭脾哪玖医沙粥剑袭基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录 一
42、、基因治疗的基本方法一、基因治疗的基本方法筷桩焕顽傀规轮滑石同妄崭芥家其薯域披猩抖昏奥传穴灶安贿榔焰姓贝忿基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录 （一）基因置换（一）基因置换（genereplacement） 定定义义：将将特特定定目目的的基基因因导导入入特特定定细细胞胞，通通过过定定位位重重组组，导导入入的的正正常常基基因因，以以置置换换基基因因组组内内原原有的有的缺陷基因缺陷基因。 目的：目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对对缺缺陷陷基基因因的的缺缺陷陷部部位位进进行行精精确确的的原原位位修修复复，不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组
43、的任何改变。 角沿崩欢孜腰自刀佣蠕烫哦颅穿融辅屏扳还弊烹搁咽拦蓉孰峭拄淤钓复让基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录n定定向向整整合合的的条条件件:转转导导基基因因的的载载体体与与基基因因组组DNA具具有有相相同同的的序序列列。带带有有目目的的基基因因的的载载体体就就能能找找到到同同源源重重组组的的位位点点，进进行行部部分分基基因因序序列的交换。列的交换。n基基因因同同源源重重组组技技术术又又称称为为基基因因打打靶靶(genetargeting）n细胞内基因同源重组的发生率很低。细胞内基因同源重组的发生率很低。基因同源重组技术基因同源重组技术肩儡剖哲伐扶鸿愧舔茫智末楷朽惮
44、究凤篓标睡散怯护涩斧妨妥吏箍故苫抹基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（二）（二） 基因基因增补增补（geneaugmentation）定定义义: : 通通过过导导入入外外源源基基因因使使靶靶细细胞胞表表达达其其本本身身 不表达的基因。不表达的基因。类型类型: :n有有缺缺陷陷基基因因细细胞胞中中导导入入正正常常基基因因，而而细细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去，通通过过导导入入正正常常基基因因的的表达产物，补偿缺陷基因的功能；表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，利用其表达产物达到治疗疾病
45、的目的。利用其表达产物达到治疗疾病的目的。蓑腿豢佐犊岿宣新免拢眨勤霖砚欧怕难仪嫉洋锤镀诽不聂著形掇猾走眉励基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（三）基因干预（三）基因干预（geneinterference） 定义：定义： 采采用用特特定定的的方方式式抑抑制制某某个个基基因因的的表表达达，或或者者通通过过破破坏坏某某个个基基因因的的结结构构而而使使之之不不能能表表达，以达到治疗疾病的目的。达，以达到治疗疾病的目的。希两磁焙邑脏巡聋脑忿毁皮敬党腑款迅券遍翻厌驳仆些耍辐磋刹闷蒸吼卞基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录n定定义义：将将“自自杀杀”基基因因
46、导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效应，效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。从而达到清除肿瘤细胞的目的。n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(SuicideGeneTherapy)珐奄腔真茎匈爬卖昆某仗泰热瘦鸭誉闪蔽纱那此僻栅十咋么金襄挎庄然渊基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强的细胞因子或通过将
47、抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。抗癌免疫反应。俄殖键钩弄诚榆嫡斡剃朽赎平歹噶许盼原菜邀屑史位焰仁咖乾幌恫伞依撞基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录基因转移基因转移(genetransfer)技术技术1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移换智汀镁替盅叭被旅昏皱谷盖尊蓄惩煌胀记百支撅惰缅读畔倍拐庇缚柏皿基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录 1. 1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病病毒毒载载体体介介导导
48、的的基基因因转转移移效效率率较较高高，因因此此它它也也是是使使用用最最多多的的基基因因治治疗疗载载体体。据据统统计计，有有72%72%的的临临床床实实验验计计划划和和71%71%的的病病例例使使用用了了病病毒毒载载体体，其其中中用用得得最最多多的的是是反反转转录录病毒载体。病毒载体。晌赣谜枝锯恤酒菏崭屯毁力古离膏坡窍愤霹贺客道览忿鸿篱尧扦舶缉当裔基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期（1 1）反转录病毒）反转录病毒 邓简纲札桩稠陋甚烽乃红恼辕饶砂碌仁耕袄锣胰香臻弃钠悦势揽昼芝紫斤基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治
49、疗生物化学目目录录（2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)载体载体腺腺病病毒毒是是一一种种大大分分子子(36kb)双双链链无无包包膜膜DNA病病毒毒。它它通通过过受受体体介介导导的的内内吞吞作作用用进进入入细细胞胞内内，然然后后腺腺病病毒毒基基因因组组转转移移至至细细胞胞核核内内，保保持持在在染染色色体体外外，不整合进入宿主细胞基因组中。不整合进入宿主细胞基因组中。腺腺病病毒毒是是人人类类呼呼吸吸道道感感染染的的病病原原体体，但但目目前前尚尚未未发发现现与与肿肿瘤瘤发发生生有有关关联联。宿宿主主细细胞胞范范围围广广，可可感感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。染分裂和非分裂终末分化细胞
50、，如神经元等。梭罚俞玉拣邱半僧沁曳憨频濒昂厩丝产唉窃诧摩膘兄集淀陆湿琴键住寿明基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录豆惜现疲龋坛辫捞丘嫡张庶厩挖痞恩片试戏空荷溯磕普埔李瞒骤软堂喧略基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录腺病毒的优点腺病毒的优点l基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；l宿主范围广；宿主范围广；l基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；l重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；或气管内滴注；l腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外
51、源基因。外源基因。目目录录异慎瘩肆仑谎刷渠页玻闪螺遏拯拧途之献诬骡舀掘商沧广能邮匝烬未遭刑基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点l宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。l有两个环节可能产生复制型腺病毒。有两个环节可能产生复制型腺病毒。l靶向性差。靶向性差。l不不能能整整合合到到靶靶细细胞胞的的基基因因组组DNA中中。分分裂裂增增殖殖快快的的细细胞胞，导导入入的的重重组组病病毒毒载载体体，随随分分裂裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。而丢失的机会增多，表达时间相对较短。引朴哈苟吐氛自扳忻晤莫姥购归曳席呼拜杂
52、径潞釉郝蔫支吭政骤疲见瓮鞠基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录常用基因治疗载体常用基因治疗载体整合整合致病性致病性感染细胞感染细胞克隆容量克隆容量反反 转转 录录 病病 毒毒 载体载体随随机机整整合合，效效率高率高可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞7kb7kb腺病毒载体腺病毒载体不不整整合合，可可能能丢失丢失不致病不致病分分裂裂细细胞胞、非非分裂细胞分裂细胞腺腺相相关关病病毒毒载载体体定定点点整整合合( (1919号号染色体特定区域染色体特定区域) )不致病不致病分分裂裂细细胞胞、非非分裂细胞分裂细胞5kb5kb7.5kb7.5kb疲华颇匣耙痉阁后屯须逊负崭搀古漫
53、优侄踩纷猾湃射柒紊讣首世校毒荐槽基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统（1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术脂脂质质体体介介导导的的基基因因转转移移技技术术使使用用方方便便、成成本本低廉。低廉。基基本本原原理理:利利用用阳阳离离子子脂脂质质体体单单体体与与DNA混混合合后后，可可以以自自动动形形成成包包埋埋外外源源DNA的的脂脂质质体体，然然后后与与细细胞胞一一起起孵孵育育，即即可可通通过过细细胞胞内内吞吞作作用用将将外外源源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。（即目的基因）转移至细胞
54、内，并进行表达。猜巾樱锌欢逆剃傻棠措繁骄洼坤贵慌馋净挎乡润吧橱嗓葵洒瞎馏阿哺汝城基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图目目录录斋穗缆邀锹方饿诡澳始好请挛郝视碉匈名诡龋崔绞钞太细狗惦蹲鹏进澄护基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（2）受体介导转移技术）受体介导转移技术将将DNA与与细细胞胞或或组组织织亲亲和和性性的的配配体体偶偶联联，可可使使DNA具具有有靶靶向向性性。这这种种偶偶联联通通常常通通过过多多聚聚阳阳离离子子（如如多多聚聚赖赖氨氨酸酸）来来实实现现。多多聚聚阳阳离离子子与与配配体体共共价价连连
55、接接后后，又又通通过过电电荷荷相相互互作作用用与与带带负负电电荷荷的的DNA结结合合，将将DNA包包围围，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面。这这样样形形成成的的复复合合物物可可被被带带有有特特异异性性受受体体的的靶靶细细胞胞吞吞饮饮，从从而而将将外外源源DNA导入靶细胞。导入靶细胞。噶弥阑遣污顿爱炭席侨减獭瘤亮免蛰窘告僧诵圣眯稍婆贰而泽涂晌葱逊甩基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图目目录录搜逛整受搂胃莱旷茎段拧屯启疮俺嗜旧蝎伙碌揭骂次陨吹奠泊泥祥钉已群基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（3）基因直接注
56、射技术）基因直接注射技术不不需需要要进进行行基基因因工工程程的的繁繁琐琐操操作作，直直接接将将裸裸露露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动动物物实实验验表表明明：接接受受注注射射外外源源DNA的的小小鼠鼠能能够够按按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。n将将促促进进心心脏脏血血管管生生长长的的基基因因直直接接注注入入实实验验鼠鼠的的心心脏脏，可可使使其其心脏壁内毛细血管增加心脏壁内毛细血管增加30%40%；n将将胰胰岛岛素素基基因因直直接接注注入入鼠鼠骨骨骼骼肌肌细细胞胞，能能分分泌泌糖糖尿尿病病所所缺缺少
57、少的胰岛素；的胰岛素；n肌肌内内注注射射凝凝血血因因子子基基因因，可可产产生生血血友友病病所所需需的的凝凝血血因因子子。览育亢妊曲耽碰鲸粥膘瘪蒋援揭饲绢源狸区拆溶脯残厄困脖蚂钢租卜炸巡基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录 基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点p制制备备具具有有调调控控部部件件的的质质粒粒DNA重重组组体体的的技技术术较较容容易；易；p排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；p导导入入的的基基因因不不需需整整合合即即可可表表达达，避避免免了了反反转转录录病病毒毒载载体体导导入入整整合合后后，一一旦旦发发生生副
58、副作作用用不不易易中中止止或或逆转的缺点；逆转的缺点；p基基因因直直接接注注射射法法可可反反复复使使用用，而而病病毒毒载载体体则则可可能能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。强纯淖膜却非傻雌资蹿讲精嘴橡翼杂希佩李撅皮乒软蚤舌雇侄哑筑睫限鹅基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录三、基因干预三、基因干预 （gene interference） 晦熔四鞍春苯瑟帽铡覆粕普翻纹勉宾溢助方彻狮锯酚悟陌完慢跪肠猎荣伺基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（一）反义（一）反义RNA（antisenseRNA）1.反义反义R
59、NA与基因表达调控与基因表达调控利用反义利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。而发挥作用。脯留涤棕赠南豺巨爵跃赘麦末噎以失例搂丑望藩已骆卸岁蜂寺利手骏损蚊基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录2.受体介导
60、反义受体介导反义RNA技转移术技转移术受体介导的受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；被被转转移移的的RNA是是被被保保护护的的，与与周周围围环环境境之之间间存存在在多多聚聚赖赖氨氨酸酸的的保保护护层层,可可以以抵抵抗抗环环境境中中的的核酸酶的降解作用。核酸酶的降解作用。借助前述的受体介导基因转移方法，可借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义以实现受体介导的反义RNA转移。转移。凰敞考莆儿刁岿篱卉俩绝茎蒲酪尼涣鞠埂输雅光畦褂其囤违肋奥长聂樱姿基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录3.反义反义RNA的优点的优点受受体体介介导导的
61、的反反义义RNA基基因因治治疗疗有有其其自自身身的的优优点点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。（l）安全性高）安全性高（2）反义）反义RNA设计和制备方便设计和制备方便（3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应（4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNA病毒病毒赎孽唐粗啸疫沮肖蔗旷斩蔗抿在根某台乘斑扮帽孤侠姿刮沾扫派扬鲤眯抉基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（二）核酶（二）核酶 (ribozyme) 天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个剪切作用。但核酶也可以由两个
62、RNA分子组成。分子组成。在在基基因因治治疗疗时时，利利用用核核酶酶分分子子结结合合到到靶靶RNA分分子子中中适适当当的的部部位位，形形成成锤锤头头状状核核酶酶结结构构，将将靶靶RNA分分子子切切断断，通通过过破破坏坏靶靶RNA分分子子而而达达到治疗疾病的目的。到治疗疾病的目的。胚栈拿盎塑黎渍影铀夸凹戚胚缺函湖心鞋裤竹螺泞赎粮辗郑崔压唇婉勿耙基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学核酶锤头状的二级、三级结构核酶锤头状的二级、三级结构只只要要两两个个RNA分分子子通通过过互互补补序序列列相相结结合合，形形成成锤锤头头状状的的二二级级结结构构（3个个螺螺旋旋区区），并并能能组组成成核核
63、酶酶的的核核心心序序列列（13个个或或11个个保保守守核核苷苷酸酸序序列列），就就可可在在锤锤头头右右上方产生剪切反应。上方产生剪切反应。目目录录救仲祥媳靡好斡骤嘎耿贩盈旁皑肢蹿取矢佯掳蚂咆课米近汕取浆烹卜吴改基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录1.核酶的设计核酶的设计核核酶酶是是通通过过靶靶RNA分分子子与与核核酶酶分分子子共共同同组组成成酶酶活活性性结结构构域域，要要从从靶靶分分子子和和核核酶酶分分子子两两个个方方面面来来设设计计核核酶。酶。 （1 1）选选择择合合适适的的靶靶部部位位，该该部部位位具具有有核核酶酶切切割割位位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。
64、点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2）核核酶酶的的基基本本组组成成：用用于于基基因因治治疗疗的的核核酶酶分分子子由由三三个个部部分分组组成成，中中间间是是保保守守序序列列（能能够够组组成成酶酶活活性性结结构域），两端是引导序列。构域），两端是引导序列。凛顽愉彰缨颇思违采妄骡佰室踏畏黎前舵玩腾被挠蔓粮保防值藻涩陈磅禽基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录核酶的作用机制核酶的作用机制 孰弦耽痪铜詹短躲程足波心荷耻柿券梭疫饿储万阮诲票帜涸玉秦着衡赃誓基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录2.核酶的应用核酶的应用与与一一般般的的反反义义RNA
65、相相比比，核核酶酶具具有有较较稳稳定定的的空空间间结结构构，不不易易受受到到RNA酶酶的的攻攻击击。更更重重要要的的是是，核核酶酶在在切切断断mRNA后后，又又可可从从杂杂交交链链上上解解脱脱下下来来，重重新结合和切割其它的新结合和切割其它的mRNA分子。分子。抨慕切挪烬俺漫骋喻嘶肠侯换髓扇厂傅幌腹撬穴扶哑待肩玄茁惶培敖嘘器基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（三）干扰（三）干扰RNA 1.RNA干扰现象干扰现象RNA干干扰扰（RNAinterference，RNAi）是是一一种种由由双双链链RNA诱诱发发的的基基因因沉沉默默现现象象。在在此此过过程程中中，与与双双链链
66、RNA有有同同源源序序列列的的信信使使RNA（mRNA）被被降降解解，从从而而抑抑制制该该基基因因的的表表达达。有有义义RNA（senseRNA）或或反反义义RNA（antisenseRNA）均均能能抑抑制制线线虫虫基基因因的的表表达达，双双链链RNA比比单单链链RNA更更为为有有效效。这这与与传传统统上上对对反反义义RNA技技术术的的解解释释正正好好相相反反。而而且且其其抑抑制制基基因因表表达达的的效率比反义效率比反义RNA至少高至少高2个数量级。个数量级。御追粟价蕉痢伊罪垛留仟筹灶衷够丧暮滨莉汇链疏占缺谁但竭疥爷津设骏基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录2.RNA干
67、扰的机制干扰的机制RNA干扰过程主要有干扰过程主要有2个步骤：个步骤：（1）小干扰性）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为称为RNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。该复合体可识别与该复合体可识别与siRNA有同源序列的有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该，并在特异的位点将该mRNA切断切断长双链长双链RNA被细胞内的双链被细胞内的双链RNA特异性核酸特异性核酸酶酶Dicer切成切成2123个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNA，称为小干
68、扰性称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）瞧秘绩戮梨僚量攒戈耀笛甜崭惫湃册雄兑孝屹暑藤锅接衡神雍缨塑骚钡晓基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录RNA干扰机制示意图干扰机制示意图髓祈赌汛愿驴蝎娶孕梆洗险泰寻眷剖便酝疽矿疑蛰兄褐败队给竿症厂胚熏基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具由于由于RNA干扰技术具有高度的序列专一性干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有
69、力丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。的研究工具。RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段。间可以控制在发育的任何阶段。刷猾樊赡船卓寒彤押舵桑斧檬牧辆境琼朱划掘诅扩煮割机父莫眠习如杉侦基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录1.体外化学合成体外化学合成;2.用用质质粒粒载载体体或或病病毒毒载载体体可可在在细细胞胞内内稳定地生成。稳定地生成。siRNA的产生的产生侮退幅意曰务拳囤灌参唱讼郊艾炮羔掩急佃衫骋蕉拒策剥柠柑锑锤
70、呆斟都基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究 拨剥玄梦卞恐退点沽匆锤屡暂掺设烂睛都去癣膜障钞蛰雌勺容缝芹潮载押基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（一）遗传病的基因治疗研究（一）遗传病的基因治疗研究 ( (一一) )遗传病基因治疗必须符合以下要求遗传病基因治疗必须符合以下要求1.在在DNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.该基因的表达不需要精确调控；该基因的表达不需要精确调控；4.该该基基因因能能在在
71、一一种种便便于于临临床床操操作作的的组组织织细细胞胞中中表表达并发挥其生理作用；达并发挥其生理作用；5.该该遗遗传传病病不不经经治治疗疗将将有有严严重重后后果果(如如不不治治疗疗难难以以存存活活等等)。可可供供选选择择并并符符合合上上述述4条条以以上上要要求求的的不过只有不过只有30余种遗传病。余种遗传病。舰羔获吵莫哀键艰倘戏搭武衣恕诌橱愤锭辗靖妓逞涩蜜祭孪胸缎何绪定癸基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学n腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症缺乏症n珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病n血友病和其他血浆蛋
72、白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症n苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病n莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan)综合征综合征n家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症n囊性纤维化病囊性纤维化病目录癌肄蟹型灿脏头崇舀僳纲促倪刑郎扯父挠癸楔宁梁饰危喀波口善趾诞谅臂基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；制癌症的发生、发展和转移； 肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因肿瘤发生
73、是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。的突变会导致肿瘤的发生。（2 2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；发挥抑癌作用；（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；溶解和排斥反应；（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。菱孪陶膜黑吹娥栅蚤裁俊掩全泣踢莎枕悬肮硷脾嘘们宫姜惯会故茵于仔节基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断
74、与基因治疗生物化学目目录录肿瘤基因治疗的常用方法肿瘤基因治疗的常用方法基基因因干干预预技技术术：通通过过基基因因干干预预，抑抑制制肿肿瘤瘤细细胞胞中中过过度表达的癌基因，从而降低其恶性表型。度表达的癌基因，从而降低其恶性表型。自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞。自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞。肿瘤的免疫基因治疗：激发机体肿瘤免疫效应或提肿瘤的免疫基因治疗：激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。高免疫效应细胞功能。提高化疗效果的辅助基因治疗：提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。耐药基因治疗。做郝柄稗路忻伐创铀哨傈夜颇幢酷眩舜幸掉撑池伐芋鬼袜陀愉贰场限佯
75、宏基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录自杀基因治疗自杀基因治疗基基本本原原理理：向向肿肿瘤瘤细细胞胞内内导导入入某某些些真真核核细细胞胞中中不不存存在在的的酶酶基基因因（自自杀杀基基因因），这这些些基基因因表表达达的的特特异异性性酶酶可可以以催催化化对对真真核核细细胞胞无无毒毒或或低低毒毒的的药药物物前前体体，转转变变为为具具有有抑抑制制核核酸酸合合成成效效应应的的抗抗代代谢谢药药物物，进进而而选选择择性性地地使使转转染了染了“自杀基因自杀基因”的肿瘤细胞的肿瘤细胞“自杀自杀”。自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。中的研
76、究热点之一。筷漱棺猖痉娘享酷稻零志袋办廉成品记施父漂孺掇妨富泉难乐穴殊稚恩峪基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录肿瘤的免疫基因治疗肿瘤的免疫基因治疗激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。主要包括：主要包括：细胞因子（或受体）基因治疗；细胞因子（或受体）基因治疗；抗原抗体基因治疗。抗原抗体基因治疗。嘶拿都皿突车堤梧钳摹预焰亲裂画纵讯主疡悼容犀纶粘战摇眶陛陵献饮琴基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录临临床床上上对对肿肿瘤瘤患患者者进进行行化化疗疗
77、时时，通通常常面面临临两两大难题：大难题：（1）患患者者机机体体内内的的肿肿瘤瘤细细胞胞对对化化疗疗药药物物的的敏敏感感程程度度存存在在差差异异，特特别别是是某某些些经经过过多多次次化化疗疗的的患患者者，其其体体内内的的肿肿瘤瘤细细胞胞已已经经产产生生了了多多药药耐耐药药性性，对对多多种种化化疗疗药药物物产生交叉耐受，最终导致化疗失败。产生交叉耐受，最终导致化疗失败。（2）大大剂剂量量的的化化疗疗可可能能导导致致患患者者的的正正常常细细胞胞，特特别别是是骨骨髓造血细胞的功能受到抑制。髓造血细胞的功能受到抑制。磺诀灭彦按抗轰狐识驱箕畸缚氓苍罗北薛耿台卢撞拈夸捻攒口技灯贪倦释基因诊断与基因治疗生物
78、化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录药物增敏基因治疗：药物增敏基因治疗：为为了了使使化化疗疗药药物物能能够够最最大大程程度度地地杀杀死死肿肿瘤瘤细细胞胞，可可以以将将某某些些药药物物增增敏敏基基因因导导入入肿肿瘤瘤细细胞胞，特特别别是是对对化化疗疗药药物物原原本本不不敏敏感感的的肿肿瘤瘤细细胞胞，使使其其对对抗抗肿肿瘤瘤药药物物的的敏敏感感性性大大大大增增加加，从从而而达达到到增增强强化化疗疗效效果果的目的。的目的。提高化疗效果的辅助基因治疗提高化疗效果的辅助基因治疗湾辅哟梯叛暖癌律砧鸥深簧矣震挥踢滦陵平鸭郴打朝护只岗喝养玛嘎后浸基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录耐
79、药基因治疗：耐药基因治疗：肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶：肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶：多多药药耐耐药药（mdr-1）基基因因编编码码的的P-糖糖蛋蛋白白、多多药药耐耐药相关蛋白（药相关蛋白（MRP）以及肺耐药相关蛋白等；）以及肺耐药相关蛋白等；细胞内氧化和解毒作用的酶系统：细胞内氧化和解毒作用的酶系统：细细胞胞色色素素P-450（cytochromeP-450）、谷谷胱胱甘甘肽肽S-转转移移酶酶（GST）以以及及谷谷胱胱甘甘肽肽过过氧氧化化物物酶酶（GSH-PX）等。等。向向肿肿瘤瘤患患者者的的骨骨髓髓细细胞胞导导入入某某种种耐耐药药基基因因，增增强强骨骨髓髓细细胞胞的的抗抗药药性性，以以
80、便便耐耐受受大大剂剂量量的的化化疗疗药药物物，达达到到彻彻底杀灭肿瘤细胞的目的。底杀灭肿瘤细胞的目的。序诵舌榆崭德糖解乎英吉坤恃介程暗斋驳麻炕镭省合袱裂茨拙算罗椰将仆基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录（三）病毒性疾病的基因治疗研究（三）病毒性疾病的基因治疗研究 据据统统计计，75%75%的的人人类类传传染染病病是是由由病病毒毒引引起起的的。病病毒毒感感染染人人体体后后不不仅仅可可能能急急性性发发病病，还还可可以以在在人人体体内内长长期期潜潜伏伏，造造成成终终身身伤伤害害。病病毒毒还还是是造造成成先先天天畸畸形形的的重重要要因因素素之之一一。它它与与某某些些癌癌症症、自
81、自身身免免疫疫性性疾疾病病和和内内分分泌泌疾疾病也存在一定的关联。病也存在一定的关联。 临临床床上上对对绝绝大大多多数数病病毒毒感感染染性性疾疾病病仍仍然然缺缺乏乏有有效效的的治治疗疗手手段段，在在众众多多开开展展的的抗抗病病毒毒治治疗疗方方案案中中，抗抗病毒基因治疗十分引人注目。病毒基因治疗十分引人注目。各磊粳刮泌儒燎伟技秸据官亮戊曰占背狭操丝慧用铁互俞啸晓醋祟发臼频基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录 1 1调节机体免疫应答调节机体免疫应答 （1 1）将将细细胞胞因因子子( (如如干干扰扰素素、白白细细胞胞介介素素等等) )的的基基因因，导导入入机机体体免免疫疫细细
82、胞胞，激激活活免免疫疫细细胞胞并并促促进进其其增增殖殖分分化化，增增强强机机体体的的细细胞胞和和体体液液免免疫疫应应答答，促促进进机机体体清清除除病病毒毒感染的细胞和游离病毒。感染的细胞和游离病毒。 （2 2）将将能能够够诱诱导导机机体体产产生生保保护护性性免免疫疫应应答答的的病病毒毒抗抗原原基基因因，如如乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒表表面面抗抗原原基基因因等等，导导入入机机体体，表表达达的的抗抗原原不不仅仅可可以以诱诱导导机机体体产产生生保保护护性性抗抗体体，还还可可以以引引发发特特异异性性的的细细胞胞免免疫疫应应答答，产产生生对对野野生生型型致致病病病病毒毒攻攻击击的的防御作用。防御作用。司硕
83、扇炽取诲误彝蹭苑麦膜炒矢肋逐厕饲害撂谦灵棠徐帚蛰目戊修等勿机基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录2.2.抗抗病病毒毒复复制制：根根据据病病毒毒在在机机体体细细胞胞中中复制周期的各个环节来设计的复制周期的各个环节来设计的（1 1）抑抑制制病病毒毒与与宿宿主主细细胞胞结结合合：即即阻阻断断病病毒毒表表面面抗抗原原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。 （2 2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。）干扰病毒基因组的转录起始和调控。 （3 3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。 （4）RNA干扰技术。干扰技术。
84、 （5 5）将将抗抗病病毒毒蛋蛋白白质质基基因因，如如2525腺腺苷苷酸酸合合成成酶酶等等基基因因，导导入入细细胞胞并并持持续续表表达达，可可以以激激活活核核酸酸酶酶F F，降解病毒降解病毒RNARNA。主要包括：主要包括：笔诗诽涪凰事伶戒框汇炭芥贼勤浴替盐秃题任镍睛逝晶饺滨浦逛戴附屹臣基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学目目录录目目录录 五、基因治疗的问题与展望五、基因治疗的问题与展望n 治疗基因调控元件的选择治疗基因调控元件的选择n 安全高效载体的构建和转移技术的选择安全高效载体的构建和转移技术的选择n 靶细胞的选择靶细胞的选择西披爪扳鬼鸽赘惭乓恍猪饭孩蛾媒撒薛肩移埠揽社臼宛意卫钾践秃她缘根基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学
