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1、 毒理学基础毒理学基础第七章第七章 外源化学物的致突变作用外源化学物的致突变作用腿傣冈勉污枪百诧官迁岗揭倚伏油驯数常恼狰貉姑索踞惧莲蜒卢持扁狙鸦第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用第一节第一节 概概 述述 挡匀教敲臀材想油拯峡斩荫固溯做盘统乍果畴深柏潍扫拜非秃况鸡夫矽筷第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用一、基本概念一、基本概念 1.1.变变异异(variation)-由于遗传物质在自我复制过程 中的偶而失误,或由于个体发育与生存受到变化的内外环境条件的影响,一种物种在个体或历代间的性状出现不同程度的差异.肇韶翼裹育爽富抄汹闪檄屯校纬系贬恋刹楼赋来溺乒摔证卑激办
2、冶物菠愤第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用2.2.突突变变（mutation）因遗传结构本身的改变及其引起的变异（可遗传的变异)。 突变可分为突变可分为： 1）自发突变自发突变（spontaneous mutation） 2）诱发突变诱发突变（induced mutation）锤鞋风眷察窃厄距梯薪铺榜欧矩题颠蘸窖淹殊当壶烩杀秽敌沿虞胡曲筷趁第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用 3. 遗遗传传毒毒理理学学（genetic toxicology）主要研究环境中的致突变物(包括化学、物理、生物因素)的致突变作用以及人类接触致突变物后可能引起的健康效应. 主要任务:研
3、究环境中的致突变物的致突变作用以及其机制,应用检测系统发现和探究致突变物,提出评价致突变物健康危害的方法. 帧塔婶书渴兆赛诱戒告夫科葛浇慌的榜现柒卡竞向瓷敷捍昧兴茅燃想泼摸第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用1 1）致致突突变变作作用用（mutagenesis）指外来因素(化学,物理,生物因素)引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且这种改变可随同细胞分裂过程而传递。 2) 致致突突变变物物（mutagen）能够引起突变的物质.(遗传毒物, 诱变物) 束若篷讯汁杜抚丘缺讥栖欣库乎愉幻臭毫虫嗜氧配廖敛惧降拢悉椿妙区焦第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用二、遗传学
4、基础二、遗传学基础1. DNA与基因结构；2. 染色质与染色体；3. 体细胞与生殖细胞；4. 基因型与表型；5. 细胞周期与细胞分裂。 颊畦防踪辑诀逞魂仕抱与普库栈再拧侮普疑贴格班痴蔼啊但缴骋住客裤弯第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用第二节第二节 化学毒物致突变的类型化学毒物致突变的类型 让到皱远惟绚昔庙损祸氯柿摔乞钡蒲到蹭棱祷初靖铅为恼嫌令撼遂萨顶芬第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型 基因突变基因突变基因突变基因突变 碱基置换、移码突变碱基置换、移码突变突变突变突变突变 染色体畸变染色体畸变染色体畸变染色体畸变 ( (
5、( (结构异常结构异常- -染色单体畸变染色单体畸变 染色体畸变染色体畸变) ) 染色体组畸变染色体组畸变染色体组畸变染色体组畸变 ( ( ( (数目异常数目异常- - 非整倍体、非整倍体、 多倍体多倍体) ) 趴蕴虚俐獭姓踩污惶轿立辰斌摆炒搐填坦导荤峨猩扳祷薄殊题逞冠历坞孕第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用一一. .基因突变：基因突变： 指基因中DNA序列的改变（点突变)。 1.碱碱基基置置换换（base substitution） 是指DNA序列上的某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。 1) 转换转换（transition） 2) 颠换颠换（transversion）
6、同义突变同义突变 错义突变错义突变 无义突变无义突变与讯讼漫焚睫愤宦湾屁迫剑统庇依茁揖诺阴窃胚墨旧秸姬福葛炙马眯馒瘩第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用2. 2. 移码突变移码突变（frameshift mutation） 指发生一对或几对（3或3的倍数除外)碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。 3. 3. 整码突变整码突变 4. 4. 片段突变片段突变布稠腹汰四铬苛果坏肋咕钠楷嘻皂洱引囊杯犀沂眩铸居赘缄弃骆镶扩面阁第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用二二. .染色体畸变染色体畸变( (染色体结构异常染色体
7、结构异常) )： 断裂剂(clastogen) 断裂作用(clastogenesis) 拟紫外线断裂剂： 染色单体型畸变，S期依赖断裂剂 拟放射线性断裂剂： 染色体型畸变，S期不依赖断裂剂 塞象川酿耽鹏缘示姨胳贷叮京韦括迟呸闷仕练坡哟户鸥当绳叹洼戌膜教璃第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用三三. . 染色体数目异常染色体数目异常( (染色体组畸变染色体组畸变):): 1.非非 整整 倍倍 体体 细 胞 增 加 或 减 少 一 条 或 几 条染色体。( 2n-1, 2n+1, 2n+2)2.多倍体多倍体 细胞染色体数目成倍增加。 (三倍体,四倍体等)争竟坦嗜饼硅锄图判佣俩佣择酋掌
8、元皂郝袒鹏牡皱颤乞倍妙谴瑞铂津疏蜜第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用第三节第三节 化学毒物致突变作用的化学毒物致突变作用的机制及后果机制及后果先牵膜监蔬锈窥饮敌券卞桨您争母擎塌枪祭犊黎虏碎彤台起脏害成闹磁肚第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用 一、机制一、机制 （一）引起（一）引起（一）引起（一）引起DNADNADNADNA突变突变突变突变 1.碱基损伤 1）碱基错配 2）碱基类似物的取代 3）碱基的结构改变或破坏 4）平面大分子嵌入DNA链 敞浊举身郊秃划骆戈故隋癣艘鄂胸涪去蹿慰潍伶嫩正嚣珠究躲塘过宛伶足第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用2
9、。DNA链受损1）二聚体的形成2）DNA加合物形成3）DNA-蛋白质交联物形成何读乡浑闽诫惜撒碳杠含备跌版会媚础琴姜广即影脾沿蓝澄褪僧流葛驮碾第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用( (二二) )引起突变细胞分裂过程的改变引起突变细胞分裂过程的改变(染染 色体组畸变的机制色体组畸变的机制) )非整倍体非整倍体: : 不分离、染色体行动滞后、不分离、染色体行动滞后、 联联 会、着丝粒早熟分离会、着丝粒早熟分离 多倍体多倍体: : 核内复制、核内复制、 细胞质分裂障碍细胞质分裂障碍 沟鼻唁援兰响梦燎味宗哪丽拈屠蹄拳跟乡整毯蒋竞掇壕孩胶巫抉犀应渍龄第七章外源化学物致突变作用第七章外源化
10、学物致突变作用( (三三) ) 其它的改变其它的改变傈岁芒勤毖渐贵双橙鸡恰蔬舅肚悠昼霜拓姬雌赏链簇灾躬尉固非迹愧冶娃第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用 突变的后果主要取决于化学物作用的突变的后果主要取决于化学物作用的靶细胞靶细胞。生殖细胞突变生殖细胞突变 致死性突变 非致死性突变体细胞突变体细胞突变 肿瘤、致畸作用、衰老、动脉粥样硬化 二、突变的后果二、突变的后果冲史瘪煮矮做沟充味榨刽阴界倦区算顽糯加营形讥嚏搐英吵喧挪议约帽哗第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用基因库基因库基因库基因库(gene pool)指某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育
11、年龄的群体所含有的基因总和。（即指一种物种的群体中在生殖细胞内具有、并能传给下一代的全部基因总和。 遗传负荷遗传负荷遗传负荷遗传负荷(genetic load): 指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平.兰肝鼠看筋规琼纷煽幼严与嘎皆少熔范热跑劲润引剃去蔷拾汇棍可嚎篷奇第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用第四节第四节 机体对致突变作用的影响机体对致突变作用的影响蔬且肃蚂你悸隘悟纳测玖拒蛆诸齿荤梯窍蹭蓉朴桅骸演劲旁溺娇机甄誊舔第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用 对外来因素的致突变作用,机体自身具有一定的防御功能。（1）DNA执行高保真度的
12、复制；（2）机体自身的修复功能。港怕烽病拄蛀肾呈图挚账轿走蔼兢妈极唯垢翌恨放图晃筋欠痈翔害肯嘻慎第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用1 1、DNA损伤的修复功能损伤的修复功能 1） 光修复 2） “适应性”反应 3） 切除修复 4） 复制后修复 5） 呼救性修复(SOS修复)2 2、遗传因素对致突变作用的影响、遗传因素对致突变作用的影响 1）代谢酶遗传多态性 2）修复功能的个体差异钞押四枪住谭疮耳诲意渊你啡回者歌塘慎祷忿识炎呐亡峙气屿烃涩掣除冀第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用第五节第五节 致突变试验方法致突变试验方法来室耽赶镰布胡歪酪卧露姚舰斜颐步焙紫社娇醛
13、需废目坚驳辅卤矩翻福颧第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用一、致突变试验方法的选择原则一、致突变试验方法的选择原则一、致突变试验方法的选择原则一、致突变试验方法的选择原则（一）观察的效应终点类型（一）观察的效应终点类型（一）观察的效应终点类型（一）观察的效应终点类型遗传学终点遗传学终点遗传学终点遗传学终点: : : : 有许多致突变试验所观察到的现象并不能反 映基因突变和染色体畸变或染色体不分离，而仅仅 反映致突变过程中发生的其它事件。将试验观察到 的现象所反映的事件称为遗传学终点遗传学终点遗传学终点遗传学终点. . . .茶狐值策飞漳联绎奈也火锄徐伐拼醋洛松敢僵善遍胆透吐慑渡
14、系士栋薄待第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用 1983年国际环境致突变物致癌物防护委(ICPEMC）将致突变试验所反映的遗传学终点分为5类: （1）DNA完整性的改变； （2）DNA重排或交换； （3）DNA碱基序列改变； （4）染色体完整性改变； （5）染色体分离改变。央痪卸悟鹏高唱增骇虐鲸鸳车闺侯仰苹虞番慨滞酥协闸孔蒲辣予佣缸坐茹第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用l遗传学终点包括：（归纳） 基因突变 染色体畸变 原发性DNA损伤 非整倍体谱粳氮希击垃剖脐曝逢奢亩岳杭湿磐完室龟镰兼敖拨洋萝鹿柞磅搏鸽严境第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用
15、由于一种致突变试验方法只能反映一个或两个遗传学终点，实际工作中，没有一种致突变试验方法能涵盖所有的遗传学终点，为了避免出现假阴性，故需要用一组试验进行配套检测。嚣拈姆孝诺贬郭疙伺烧椿喻奢弧给凄杂现饮垮圃窟危吾院柒捐赶操雕疹汹第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用（二）配套试验的原则（二）配套试验的原则： 1.遗传学终点齐全； 2.应包括多种进化程度不同的物种； 3.体内、体外试验相结合； 4.应包括生殖细胞和体细胞突变的试验方法。悸遭郎赛甸捧锌墟谗汲桥坤滞熙静臂互陵顶呀娃瞧芋览娜船索励阵往输鳃第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用二、致突变试验中的一些问题二、致突变
16、试验中的一些问题 1. 阴性和阳性对照的设立 2. 体外试验的活化系统 S9 3. 致突变试验与致癌试验的关系隅琳均棒欲夫鸿易媒地恒竭咳脸践几摧艘埠乖形锤障逊嗽骤菩北篱而念迄第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用 4.试验结果在毒理学安全性评价中的作用。 质量控制 a）阴性对照组和阳性对照组的设立b）盲法观察；c）资料处理； d）实验结果重现性。 阴性结果判定条件 阳性结果判定条件 眺乳樱脾尝馒孝定采岿缠章裳鸭减散陛他很挛血编挛调踢臃竭与追德逗瘫第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用三、常用的致突变试三、常用的致突变试验方法验方法鹊般瘦管沽夷安眷诺派竿桶谍苦快毖天僚
17、芒践储讹吓虱胶宛敦汰民轻拐股第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用（一）（一）鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 （Ames test ）1. 1. 原理原理原理原理 正向突变正向突变 野生型野生型 突变型突变型 回复突变回复突变 野生型鼠伤寒沙门氏菌能自行合成组氨酸（野生型鼠伤寒沙门氏菌能自行合成组氨酸（his+his+），在），在组氨酸缺乏的培养基中能生长；而突变型鼠伤寒沙门氏菌自组氨酸缺乏的培养基中能生长；而突变型鼠伤寒沙门氏菌自身不能合成组氨酸（身不能合成组氨酸（his-his-），在组氨酸缺乏的培养基中不能），在组氨酸缺乏的培养基中不能生长。如果细菌在
18、受试物的作用下能在组氨酸缺乏的培养基生长。如果细菌在受试物的作用下能在组氨酸缺乏的培养基中生长，则说明受试物使之发生了回变，表明该受试物有突中生长，则说明受试物使之发生了回变，表明该受试物有突变作用。变作用。可影匠猩瞩滁痈盈盔擒捌四昔帧莫贾狂护躯且宜荷契渔军指栓洱托渴疙泽第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用2. 试验菌株试验菌株试验菌株试验菌株 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株： TA97、TA98 ： 移码突变； TA100： 碱基置换； TA102： 移码突变+碱基置换 组氨酸缺陷（his-） 细菌屏障脂多糖缺陷（rfa 深粗型突变） 结晶紫抑菌试验 切除修复系统缺损（uvrB 突
19、变） 紫外线敏感试验 R因子（pKM101、pAQ1质粒） 抗氨苄青霉素试验、抗四环素试验且扦逐粕渐现倒序锥捎郸揖叹哗漂讥排绚简弦烙暂蛔盐擞慢放鸵珊捷仆也第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用测试菌株（测试菌株（TATA系列系列) )特性特性特性特性特性特性TA97TA97TA97TA97TA98TA98TA98TA98TA100TA100TA100TA100TA102TA102TA102TA102移码突变移码突变移码突变移码突变+ + + + + + +碱基置换碱基置换碱基置换碱基置换+ + + + + + +hishishishis+ + + + + + + + + + +
20、+ +rfarfarfarfa+ + + + + + + + + + + + +R R R R因子因子因子因子+ + + + + + + + + + + + +抗四环素抗四环素抗四环素抗四环素- - - - - - - - - -+ + + +uvrBuvrBuvrBuvrB+ + + + + + + + + +- - - -自发回变菌落数自发回变菌落数自发回变菌落数自发回变菌落数(-S9)(-S9)(-S9)(-S9)90-10090-10090-10090-10030-5030-5030-5030-50120-200120-200120-200120-200240-320240-32024
21、0-320240-320崎沂逆得鞍透唁伊针喉帚态竿妥汾碉生利拉屑谍辑测灰秽壬栈叙叉福子菲第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用 剂量设计: * 最高剂量的确定主要取决于受试物对实验菌株的毒性和受试物的溶解度. * 一般最低剂量为0.2g/皿,最高剂量为5mg/皿. * 至少5个剂量,每剂量间隔不超过5倍. * 每剂量3皿. 对照组的设计: * 阴性对照: 溶剂对照 （H2O,DMSO) 未处理对照 * 阳性对照滨若减枕贮它乐惨返谎走勇抵舆噪恢霄嘲撑古晚蔓阮料蒜验贿览肮湾盎硬第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用推荐的标准诱变剂方法S-9TA97TA98TA100TA
22、102点试-敌克松敌克松叠氮钠敌克松+2-氨基芴 2-氨基芴2-氨基芴掺入-敌克松敌克松叠氮钠敌克松+2-氨基芴 2-氨基芴2-氨基芴淳蓖鞭辉失孪皮匿体谐顾菌谁砾饿摄懂捌圾盈卵值漏冬亩象亥艳吱霄估跨第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用3.试验方法试验方法 平板掺入法 点试验法 预培养法玩辩篱片芦地刀艾蚂坤叹耶删郡怒柱隋诱弄谗捉脓函咳捍风差蒙阴传垦强第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用4.结果评价标准l阳性结果判断标准: 平板掺入法: 受试组回变菌落数阴性对照组回变菌落数的2倍,并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应. 点试法: 如受试
23、物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落,与阴性对照组相比有明显区别.木糊晒什坎主王垢施嫉躁抖爆授战齿踊易肢粮吻脯叹励戌槽圾清叮昭圈龚第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用l结果报告(平板掺入法) 阳性结果至少重复试验共3次,阴性结果至少重复试验共2次,才能作出判断.l 本方法不适合用于杀菌和/或抑菌作用的受试物,不适用于具有妨碍哺乳动物细胞复制系统的受试物.犁饺矮陵演弯卯秘纸六撮卢幻链洱原档箱午称稀壁辑俄遣狰陨赊怀催识绅第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用（二）二）微核试验微核试验（micronucleus test)悸蚀望加宰即霍炬焦江渤浆尘盂鳞苏捂派褪棵沾兆盒奄
24、蔑君斧精耙凳测臣第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用（三）（三）小鼠精子畸变试验小鼠精子畸变试验（四）（四） 染色体畸变分析染色体畸变分析（细胞遗传学试验）（五）五）单细胞凝胶单细胞凝胶(SCGE)(SCGE)试验试验 慧星试验（comet assay)双断敏领遵伪锅途灯状忠画苗讹上刻院晃竖半氦文臃敞纳琴监汞靴板腾断第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用( (六六) )小鼠淋巴瘤细胞小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK+/-L5178YTK+/-基因正相突变试验基因正相突变试验勒擅乒徐型碉蔷矩淳搂寸果己斧向吟恤射咎唱告亭刃妄橇善忿芜坚不测谤第七章外源化学物致突变作用第七
25、章外源化学物致突变作用l原理 : 在5-三氟胸苷(TFT)参与下，通过评价细胞集落生长率来鉴定受试物诱导L5178YTK+/-小鼠淋巴瘤细胞系正相突变能力。 TK座位位于常染色体上,其基因产物为胸腺嘧啶脱氧核苷(胸苷)激酶（TK）.其作用是通过磷酸化将基质中外源性的胸苷用于DNA合成.如果一个胸苷类似物（如TFT）存在于基质中,也可经TK途径磷酸化掺入DNA中,最终导致细胞死亡。藤枪借写袱东甜邪粉塞炳搞黔乐缮驼境鱼捧嘛惧腆谎账窥楼舌绣矿蚀焦顷第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用 本试验使用的TK座位杂合子(TK+/-)细胞，它单步正相突变就会形成TK+/-表型，失去TK活性，获
26、得TFT抗性，即能像杂合子一样利用从头合成途径在普通培养基中生长，又能在TFT选择性培养基中存活，此时存活的即为自发或致突变的TK+-集落假鸵肢燃惰蔷涣哩耕粪粥这刊洁构毛爹凄锨煤奖玉诚粒临懊蝉熊胜奠销掺第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用.测试用细胞 小鼠淋巴瘤细胞L5178细胞系，源于小鼠白血病细胞，为TK座位杂合子细胞（TK+/-).操作方法（略）.结果判断（毒理学实验方法与技术p66）拭厢递斟遵籽哟囤于厨掘籍浇煤延湘完捌龚呕筋趟无邱裂拙腕龟陛撅颠允第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用思考题思考题l l1 1突变的定义？化学毒物致突变的类型有哪几种？突变的定
27、义？化学毒物致突变的类型有哪几种？突变的定义？化学毒物致突变的类型有哪几种？突变的定义？化学毒物致突变的类型有哪几种？l l2 2突变的后果有哪些？致突变与致癌、致畸的关系？突变的后果有哪些？致突变与致癌、致畸的关系？突变的后果有哪些？致突变与致癌、致畸的关系？突变的后果有哪些？致突变与致癌、致畸的关系？l l3 3致突变试验时为什么需要一组配套试验？选择一组试验致突变试验时为什么需要一组配套试验？选择一组试验致突变试验时为什么需要一组配套试验？选择一组试验致突变试验时为什么需要一组配套试验？选择一组试验时应注意哪些事项？时应注意哪些事项？时应注意哪些事项？时应注意哪些事项？l l4. 4. 体外试验为什么要加活化系统？常用的活化系统是什么体外试验为什么要加活化系统？常用的活化系统是什么体外试验为什么要加活化系统？常用的活化系统是什么体外试验为什么要加活化系统？常用的活化系统是什么？l l6. Ames6. Ames试验、微核试验、染色体畸变试验的原理和目的是试验、微核试验、染色体畸变试验的原理和目的是试验、微核试验、染色体畸变试验的原理和目的是试验、微核试验、染色体畸变试验的原理和目的是什么？什么？什么？什么？ 绝筷悉砰顶迈傻否门眩苫秒午卢栖豁绢宅帅成斥躇矛伙章际柿譬仑埃迫敢第七章外源化学物致突变作用第七章外源化学物致突变作用
