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1、第四章第四章 基因克隆的载体基因克隆的载体质粒（质粒（plasmidplasmid）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA粘粒（粘粒（cosmidcosmid）与噬菌粒与噬菌粒人工染色体载体人工染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体：载体：携带外源携带外源DNADNA进入宿主细胞的工具。进入宿主细胞的工具。能够运载外源能够运载外源DNADNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源我复制能力，使外源DNADNA片段在受体细胞中得到扩增和表片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类D
2、NADNA分子。分子。第一节第一节 载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件载体应具备的条件有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有筛选转化子的选择性标记基因；分子量小，拷贝数多；具有较高的外源DNA的载装能力；安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。自
3、主复制型载体和附加载体的扩增方式 载体的类型n应用范围：克隆载体、表达载体。n应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。n构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。克隆载体(cloning vector)用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。表达载体(expression vector)使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。穿梭载体(shuttle vector) n又称双功
4、能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。n同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。n主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。第二节第二节 质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNADNA型型
5、质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1 - 1 - 200 kb200 kb天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。Plasmidchromosome绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即即cccDNAcccDNA质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征1. 1. 质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒DNA
6、DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1 - 1 - 5 5 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10 - 60 10 - 60 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷
7、贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控复制启动控制制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合orioriE.coliE.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向roprop（+ +）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物 质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控复制启动控制制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的
8、结合PcopPcopcopcopP/P/OrepOreprepreporioriCopCopRepRep质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征2. 2. 质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性质粒的不相容性，不相容性的质，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此
9、不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成粒组成不相容性群。不相容性群。亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性：质粒的不相容性：分子机制分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同
10、质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内细胞内( (亲和性质粒亲和性质粒) )其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征3. 3. 质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞
11、转移到另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如F F、ColCol、RR质粒等质粒等如如ColCol、RR的其它成员的其它成员非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1ColE1）在接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生DNADNA转移，这个过程由转移，这个过程由 bombom 和和mob mob 基因决定基因决定由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。质粒质粒质粒的基
12、本特征质粒的基本特征4. 4. 质粒的重组性质粒的重组性质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征5. 5. 携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义 利
13、用利用抗性抗性基因基因进行进行重组重组子的子的筛选筛选质粒基因编码的特性nFertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。nResistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。nCol 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E. coli 中的CoE1。n降解质粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。n致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。天然存在的两种质粒colE1colE1宿主细菌大肠杆菌，宿主细菌大肠杆菌，6.5kb6.5kb，松弛型复制
14、，松弛型复制20-20-30/cell30/cellpSC101pSC101宿主细菌沙门氏菌，宿主细菌沙门氏菌，8.8kb8.8kb，严谨型复制，严谨型复制5/cell5/cell，标记基因为，标记基因为TcTcr质粒质粒质粒的构建质粒的构建理想的质粒载体应具备的条件1.分子量较小。 2.松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。3.具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择标记。4.具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。5.能够导入寄主细胞，具备转化的功能。6.操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载
15、体。天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要
16、求加装特殊的基因元件）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。质粒人工构建的目的质粒人工构建的目的质粒质粒质粒的分类质粒的分类人工人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝高拷贝质粒质粒 突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因 拷贝数拷贝数1000-3000 1000-3000 扩增基因扩增基因低拷贝低拷贝质粒质粒 来自来自pSC101 pSC101 拷贝数小于拷贝数小于1010 表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏温敏质粒质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同
17、温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序测序质粒质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinkerpolylinker整合整合质粒质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭穿梭质粒质粒 装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆便于基因克隆表达表达质粒质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针探针质粒质粒 装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大
18、肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 pBR322pBR322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50 - 100 / 50 - 100 / cellcell用于基因克隆用于基因克隆 优点：n分子量小：4363bp, 容易纯化。n含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。n受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，
19、如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。缺点：n有被动迁移的可能，不够安全。n抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。pBR322pBR322AmpAmpTetTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18 / 19/ 19： 拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / 2000 - 3000 / cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ pUC18也来自于pBR32
20、2，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。pUC18的优点：1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18 / 19/
21、 19：正选择标记正选择标记 lacZlacZ 的显色原理的显色原理pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZMCSMCSbb-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的aa-肽段肽段a a a a a ab b b b b b5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基吲哚基-bb-D-D-半乳糖半乳糖苷苷X-galX-gal质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ 用于外源基因的高效表达用于外源基
22、因的高效表达 注意：注意：T7T7和和SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的RNARNA聚合聚合2743 2743 bpbpMCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriApAprrpGEM-3EpGEM-3EP PSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNA聚合酶，如：聚合酶，如：E.coliE.coli BL21 BL21（DE3DE3）等等在重组的在重组的pGEM3ZpGEM3Z载体中载体中加入相应的加入相应的RNARNA聚合酶聚合酶，可以，可以发生外源基因发生外源基因转录。转录。
23、质粒载体总体评价n操作简便n克隆容量有限（ 10kb）第二节第二节 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。起来。高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl
24、 l 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构l l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-DNA-DNA组组成成 l l-DNA-DNA全长全长4850248502个核苷个核苷酸酸l l-DNA-DNA上上至少有至少有6161个基因个基因约有约有20kb的区域为为噬菌体的区域为为噬菌体生长非必需生长非必需的，的，可以缺失或被外源可以缺失或被外源DNA片段所取代。片段所取代。l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 生物结构生物结构5 TCCAGCGGCGGGG5 TCCAGCGGCGGGG3333CCCGCCGCTGGA 5 CCCGCCGCTGGA 5
25、COSCOSCOSCOScoscos头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l l l l - DNA- DNA黏性末端噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染周期感染周期E.coliE.coli吸附吸附LamBLamB受体受体注入注入复制复制包装包装裂解裂解噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大
26、肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染周期感染周期体内包装体内包装100100个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原DNADNA的的75 - 105%75 - 105%即即 36 - 51 36 - 51 kbkbDDAA噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 溶原状态溶原状态 l l噬噬菌菌体体感感染染大大肠肠杆杆菌菌后后，除除能能裂裂解解细细胞胞外外，也也可可能能将将其其DNADNA直直接接整整合合到到宿宿主主细细胞胞的的染染色色体
27、体DNADNA上上，并并不不产产生生子子代代噬噬菌菌体体颗颗粒粒，这这种种情情况况为为溶溶原原状状态态。人人们们可可以以根根据据需需要要改改变变l l-DNA-DNA或或宿宿主主细细胞胞的的性性质质，使使噬噬菌菌体体或或处处于于溶溶菌菌状状态态，或或处处于于裂裂解解状状态态 DNA DNA重组技术一般需要重组技术一般需要l l噬菌体进入溶菌状态噬菌体进入溶菌状态噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度 野野生生型型l l-DNA-DNA包包装装的的上上限限为为5151kbkb，本本身
28、身长长度度为为48.548.5kbkb，只只有有当当插插入入的的外外源源DNADNA片片段段不不大大于于2.52.5kbkb时时，才才能能被被包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒。因因此此缩缩短短野野生生型型l l-DNA-DNA的的长长度度，可可以以提提高高装装载载量量。其其实实野野生生型型l l-DNA-DNA上上约约有有40-50%40-50%的的片片段段是是复复制制和和裂裂解解所非必需的。根据切除的多少，可将所非必需的。根据切除的多少，可将l l-DNA-DNA分成两大类载体：分成两大类载体： 插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA
29、大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度 插入型载体插入型载体体外包装体外包装插入位点插入位点体外包装体外包装插入片段插入片段载体长度载体长度 37 37 kbkb插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 0 - 14 kbkb（51 3751 37）重组与否均可包装重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因必须携带标记基因。噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长
30、度 取代型载体取代型载体体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段最小装载长度最小装载长度 10 10 kbkb（51 2651 26）载体长度载体长度 26 26 kbkb插入片段插入片段最大装载长度最大装载长度 25 25 kbkb（36 2636 26）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点野生型的野生型的l l-DNA-DNA链上有链上有5 5个个EcoRIEcoRI位点和位点和7 7个个HindIIIHindIII位点，位点，不不利于重组操作，必
31、须删除至利于重组操作，必须删除至1 - 21 - 2个个同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的DNADNA片段的克隆，还需要增加一片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点位点噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型l l-DNA-DNA上缺少合适的选择标记，因上缺少合适的选择标记，因此此加装加装选择标记是选择
32、标记是l l-DNA-DNA克隆载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容l l-DNA-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记 imm434imm434imm434imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止l l- -噬菌体噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的基因的l l- -载体进入受体细胞后，
33、建立溶载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源当外源DNADNA插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭活，活， l l- -重组分子便进入溶菌循环，形成重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记 lacZlacZlacZlacZ基因编码基因编码b b- -半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化无色的无色的X-galX-gal生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基
34、因插入到因插入到lacZlacZ基因中，基因灭活，不能基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体l l-DNA-DNA则则产产生蓝色透明斑生蓝色透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：l l-DNA-DNA重重组组分分子子需需在在体体外外人人工工包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体重重组组颗颗粒，方可高效导入受体细胞粒，方可高效导入受体细胞用用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白质质可可直直接接从从感感染染了了l l噬噬菌菌体体的的大大肠肠杆杆菌
35、菌中中提提取取，现现已已商商品品化化。这这些些包包装装蛋蛋白白通通常常分分为为相相互互互互补补的的两两部部分分：一一部部分分缺缺少少E E组组份份，另另一一部部分分则则缺缺少少DD组组份份。包包装装时时，当当且且仅仅当当这这两两部部分分包包装装蛋蛋白白与与重重组组l l-DNA-DNA分分子子混混合合后后，包包装装才才能能有有效效进进行行，任任何何一一种种蛋蛋白白包包装装液液被被重重组组l l-DNA-DNA污污染染后后，均均不不能能被被包包装装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的
36、l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA及其重组分子的分离纯化：及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入加入l l噬菌体或重组噬菌体或重组l l噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，3737培养培养1 1小时小时 用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -124 -12小时。这时噬菌体颗粒小时。这时噬菌体颗粒 密度已达密度已达101013 13 -10-1014 14 / / L L，大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放
37、苯酚抽提，释放l l-DNA-DNA 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀l l-DNA-DNA 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA作为载体的优点：作为载体的优点：l l-DNA-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l l-DNA-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 25 kbkb，远远大于质粒的装载量远远大于质粒的装载量 重组重组l l-DNA-DNA分子分子的筛选较为方便的筛选较为方便 重组重组l l-DNA-DNA分子的提取较为简便分子的提取较为简
38、便 l l-DNA-DNA载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNADNA片段，但不适合表达片段，但不适合表达 外源基因外源基因第三节第三节 考斯质粒考斯质粒 l l-DNA-DNA载体装载量为载体装载量为25 25 kbkb，但在很多情况下，往但在很多情况下，往往需要往需要克隆更大的外源克隆更大的外源DNADNA片段，片段，考斯质粒载体的构建考斯质粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体就是为了进一步提高噬菌体DNADNA的装载量。的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNADNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。的长度，就能同步增
39、加载体的装载能力。nn将噬菌体将噬菌体DNADNA与包装有关的序与包装有关的序列与质粒组装在一起，列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组组DNADNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组组DNADNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmi
40、d）考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工构建的含有19781978年年CollinsCollins和和HohnHohn发明构建发明构建pHC79pHC796400 6400 bpbpTcTcrrll fragment fragmentcoscosorioriApAprrPstIPstIBamHIBamHISalISalIl l-DNA -DNA coscos序列和序列和质粒复制子的质粒复制子的特殊类型的载体特殊类型的载体coscos site - carrying plasmid site - carrying plasmid1.8 1.8 k
41、bkb的的l l-DNA-DNA片段片段 + + pBR322pBR322片段片段装载范围为装载范围为31 - 45 31 - 45 kbkb考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像l l-DNA-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（装载量大（45 45 kbkb）且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞人造染
42、色体载体人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要需要克隆数百克隆数百甚至上千甚至上千 kb kb 的的DNADNA片段，片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源源DNADNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人
43、造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（BACBAC）酵母人造染色体（酵母人造染色体（YACYAC）人造染色体载体人造染色体载体细菌人造染色体（细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BACBacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F F质粒的基础上质粒的基础上构建的，其装载量范围在构
44、建的，其装载量范围在50 - 30050 - 300 kbkb之间之间各种类型的各种类型的pBACspBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACspBACs主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）结构结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库人造染色体载体人造染色体载体酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件： 酵母染色体的
45、端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：酵母人造染色体的构建：pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的酵母系统的选择标记选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为350 - 400 350 - 400 kbkb人造染色体载体人造染色体载体酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）酵母人造染色体的使用：酵母人造染色体的使用：pYAC4pYAC4CENCENEcoRIEcoRIURAURATELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRPTRPARSARSEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI连接连接转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体
