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1、肿瘤的基因诊断温温 州州 医医 学学 院院 检检 验验 医医 学学 院院温温州州医医学学院院附附一一医医检检验验科科陶陶 志志 华华n n 肿瘤是细胞的异常增生肿瘤是细胞的异常增生n n 有结构、功能和代谢的异常有结构、功能和代谢的异常n n 具有超过正常细胞增生能力具有超过正常细胞增生能力肿瘤概念肿瘤概念 在细胞内核酸代谢的异常在细胞内核酸代谢的异常: :n n 肿瘤细胞和正常细胞的核酸代谢有显著的不同；肿瘤细胞和正常细胞的核酸代谢有显著的不同；n n 不同类型肿瘤细胞的核酸代谢也有较大的差异；不同类型肿瘤细胞的核酸代谢也有较大的差异；n n 相同恶性程度肿瘤细胞的核酸代谢也有所不同。相同恶
2、性程度肿瘤细胞的核酸代谢也有所不同。 肿瘤是一种分子病肿瘤是一种分子病n n 癌基因的激活癌基因的激活n 抑癌基因的失活（或缺失）抑癌基因的失活（或缺失） 肿瘤发生机理肿瘤发生机理n原癌基因原癌基因n癌基因癌基因n病毒癌基因病毒癌基因n 肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因n 肿瘤转移相关基因肿瘤转移相关基因n 肿瘤耐药基因等肿瘤耐药基因等肿瘤相关基因肿瘤相关基因细胞基因组中具有能够使正常细胞发生细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因恶性转化的基因 癌基因在正常细胞的基因组中癌基因在正常细胞的基因组中n 存在存在n 不表达状态不表达状态n 表达水平不足以引起细胞的恶性转化表达水平不足以引起细胞的
3、恶性转化癌基因：癌基因：定位定位功能功能癌基因，产物癌基因，产物分泌蛋白分泌蛋白生长因子生长因子sis PDGFsis PDGF链链跨膜蛋白跨膜蛋白受体型酪氨酸激酶受体型酪氨酸激酶erberb B ,EGF B ,EGF受体受体 erberb B2 ,EGF B2 ,EGF样受体样受体( (neuneu) )fmsfms ,CSF-1 ,CSF-1受体受体 膜结合蛋白膜结合蛋白G-G-蛋白蛋白 非受体型酪氨酸激酶非受体型酪氨酸激酶 rasras p21ras p21ras srcsrc pp60src pp60src 胞浆可溶性蛋白胞浆可溶性蛋白非受体型酪氨酸激酶非受体型酪氨酸激酶 丝氨酸丝氨
4、酸/ /苏氨酸激酶苏氨酸激酶信号转导连接蛋白信号转导连接蛋白 ab1 ab1 rafrafcrk,SH2/SH3crk,SH2/SH3调节蛋白调节蛋白vavvav ,SH2 ,SH2调节蛋白调节蛋白 胞核蛋白胞核蛋白转录因子转录因子mycmyc mybmybfosfosjunjunerberb A,T3 A,T3受体受体 表表1 1细胞癌基因按其产物定位和功能分类细胞癌基因按其产物定位和功能分类能能 够够 抑抑 制制 细细 胞胞 恶恶 性性 转转 化化 或或 抑抑 制制 细细 胞胞 异异 常常 增殖的基因增殖的基因 目前研究较多的有目前研究较多的有p53p53基因、基因、pRBpRB基因、基因
5、、p16p16蛋白、蛋白、p15p15蛋白、蛋白、p21p21等。等。 抑癌基因抑癌基因基因基因染色体定位染色体定位相关肿瘤相关肿瘤基因产物及功能基因产物及功能RBRB13q1413q14RBRB、成骨肉瘤、胃癌、成骨肉瘤、胃癌、SCLCSCLC、乳癌、结肠癌乳癌、结肠癌p105p105，控制生长控制生长WTWT11p1311p13WTWT、横横纹纹肌肌肉肉瘤瘤、肺肺癌癌、膀膀胱胱癌癌、乳乳癌癌、肝肝母细胞瘤母细胞瘤WT-ZFPWT-ZFP，负调控转录因子负调控转录因子NF-1NF-117p1217p12神神经经纤纤维维瘤瘤、嗜嗜铬铬细细胞胞瘤瘤、雪雪旺旺氏氏细细胞胞瘤瘤、神经纤维肉瘤神经纤维
6、肉瘤GAPGAP，拮抗拮抗p21rasBp21rasBDCCDCC18q21.318q21.3结肠瘤结肠瘤P192, P192, 细胞粘附分子细胞粘附分子p53p5317p1317p13星星状状细细胞胞瘤瘤、胶胶质质母母细细胞胞瘤瘤、结结肠肠癌癌、乳乳癌癌、成骨肉瘤、成骨肉瘤、SCLCSCLC、胃癌、磷状细胞肺癌胃癌、磷状细胞肺癌P53 P53 控制肿瘤生长控制肿瘤生长erberb A A17q2117q21ANLLANLLT3T3受受体体，含含锌锌指指结结构构的的转转录录因子因子表表2 已确定的几种抑癌基因已确定的几种抑癌基因 野生型P53生物学活性n当DNA损伤的时候,P53基因就明显表达
7、使细胞在G1期生长阻滞，促使细胞凋亡。n抑制肿瘤细胞生长n保持DNA完整性包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制 基因基因。肿瘤转移相关基因肿瘤转移相关基因其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。基因。 肿瘤耐药基因肿瘤耐药基因n n 血小板衍生生长因子（PDGF）n n 表皮生长因子（EGF）n n VGF基因等 肿瘤生长因子肿瘤生长因子 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面：肿瘤转移标志物肿瘤抗药基因突变的癌基因肿瘤相关的病毒基因标志分类标志分类机制机制分子标志分子标志应用于癌症诊断应用于癌症诊断分
8、子遗传性分子遗传性染色体易位染色体易位t(9t(9；22)22)，t t（1414；1818），t(11t(11；12)12)等等白血病、淋巴瘤等白血病、淋巴瘤等点突变点突变p53,ER p53,ER rasras等等胃胃癌癌、膀膀胱胱癌癌、乳乳腺腺癌癌、前前列列腺腺癌癌、结结肠肠癌癌、胰胰腺腺癌、肺癌等癌、肺癌等缺失缺失BRCA1BRCA1，BRCA2BRCA2，DCCDCC等等乳腺癌、结肠癌乳腺癌、结肠癌改变拼接改变拼接CD44CD44，muc-1,VLA-4muc-1,VLA-4等等结结肠肠癌癌、肾肾癌癌、乳乳腺腺癌癌、脑瘤等脑瘤等扩增扩增erb-B2,EGFR,N-myc,raserb
9、-B2,EGFR,N-myc,ras乳乳腺腺癌癌、脑脑瘤瘤、神神经经母母细细胞瘤胞瘤比例改变比例改变明胶酶明胶酶A/TIMP2A/TIMP2乳腺癌转移等乳腺癌转移等病毒性病毒性病毒转化病毒转化HPV,HCV,HBVHPV,HCV,HBV，EBVEBV宫颈癌、肝癌、鼻咽癌等宫颈癌、肝癌、鼻咽癌等组织性组织性组织分化组织分化PSA,PSMAPSA,PSMA前列腺癌前列腺癌muc-18,muc-18,酪氨酸酸酶，酪氨酸酸酶，Mage-3Mage-3黑素瘤黑素瘤AFP,AFP,白蛋白白蛋白肝癌肝癌甲状腺球蛋白甲状腺球蛋白甲状腺癌甲状腺癌NPGP9.5NPGP9.5，酪酪氨氨酸酸羟羟化化酶酶表表面面活活
10、性性物物质等质等神经母细胞瘤神经母细胞瘤肿瘤性肿瘤性肿瘤细胞特征肿瘤细胞特征CEACEA肺肺癌癌、结结肠肠癌癌、胃胃癌癌、乳乳腺癌腺癌-HCG-HCG黑素瘤等黑素瘤等CK-19CK-19肺鳞癌肺鳞癌端粒酶端粒酶结结肠肠癌癌、乳乳腺腺癌癌、头头颈颈部部癌等癌等微卫星体等微卫星体等结结肠肠癌癌、乳乳腺腺癌癌、头头颈颈部部癌等癌等表表3 3 肿瘤基因诊断的分子标志及其应肿瘤基因诊断的分子标志及其应用用 可分为四大类可分为四大类 I.I.组织特异性基因标志组织特异性基因标志 II.II.肿瘤特异性基因标志肿瘤特异性基因标志 III.III.血管生成因子血管生成因子 IV.IV.其它与肿瘤转移相关的分子
11、及基质蛋白酶其它与肿瘤转移相关的分子及基质蛋白酶及其抑制剂及其抑制剂 肿瘤转移基因标志物肿瘤转移基因标志物组织特异性基因标志物组织特异性基因标志物指肿瘤组织和/或起源正常组织所特有，在淋巴组织和血细胞中不存在的。如角质蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生长因子受体（EGFR）mRNA等。 . .肿瘤特异性基因标志物肿瘤特异性基因标志物存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，不存在于其他细胞。不存在于其他细胞。如如CEA mRNACEA mRNA、AFP mRNAAFP mRNA、PSA mRNAPSA mRNA等。等。 血管生成因子血管生成因子如血管内皮细胞生长
12、因子（如血管内皮细胞生长因子（VEGFVEGF）等。等。 肿瘤抗药基因肿瘤抗药基因对于肿瘤化疗效果及预后进行推测；对于肿瘤化疗效果及预后进行推测；还可以将肿瘤抗药基因导人骨髓细胞，特别还可以将肿瘤抗药基因导人骨髓细胞，特别是骨髓干细胞中，提高机体对于抗肿瘤化疗是骨髓干细胞中，提高机体对于抗肿瘤化疗药物的耐受程度，如此可以加大抗肿瘤化疗药物的耐受程度，如此可以加大抗肿瘤化疗药物的使用剂量，提高抗肿瘤化疗的治疗效药物的使用剂量，提高抗肿瘤化疗的治疗效果。果。肿瘤抗药基因肿瘤抗药基因多药抗性基因一多药抗性基因一 l l（MDR1MDR1） ，） ， 其编码的蛋白如其编码的蛋白如P -P -糖蛋白起排
13、流泵作用。糖蛋白起排流泵作用。 . .其它一些与细胞内药物代谢有关的基因也可以其它一些与细胞内药物代谢有关的基因也可以看作是肿瘤抗药基因，如谷胱苷肽看作是肿瘤抗药基因，如谷胱苷肽 S S一转移酶一转移酶（GSTGST） ，） ， 可使机体解毒功能增强；癌基因可使机体解毒功能增强；癌基因 bcl-2bcl-2的表达可抑制肿瘤化疗药物所诱导的肿的表达可抑制肿瘤化疗药物所诱导的肿瘤细胞程序化死亡等。瘤细胞程序化死亡等。 . . 突变的癌基因突变的癌基因癌癌基基因因的的突突变变是是癌癌基基因因激激活活的的重重要要方方式式和和途途径径。除除了了见见到到较较大大范范围围片片段段的的缺缺失失或或插插人人以以
14、及及染染色色体体转转位位之之外外，大大多多数数情情况况下下，都都是是少少数数核核苷苷酸酸或或单单个个碱碱基基的的突突变变。 . .癌基因点突变的检测癌基因点突变的检测 单单链链构构象象多多态态性性（ S SS SC CP P）检检 测测 技技 术术 等等 . .肿瘤相关的病毒基因肿瘤相关的病毒基因EBEB病毒（病毒（EBVEBV）人乳头瘤病毒（人乳头瘤病毒（HPVHPV）乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV）、）、丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCVHCV）感染感染对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编 码产物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的码产
15、物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的标志标志。致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们极大的关注极大的关注极大的关注极大的关注肿瘤基因诊断的常用方法PCR、RT-PCRSouthern blot杂交技术、Northern blot杂交技术基因芯片基因测序。肿瘤基因的分子诊断意义肿瘤基因的分子诊断意义 1.1.肿瘤的早期诊断和筛选肿瘤的早期诊断和筛选2.2.肿瘤疗效监测肿瘤疗效监测 3.3.肿瘤的预后判断肿瘤的预后判断 4.4.肿瘤微转移检测肿瘤微转移检测 肿瘤基因检测在肿瘤微转移检测中肿瘤
16、基因检测在肿瘤微转移检测中应用举例应用举例前列腺癌特异性基因前列腺癌特异性基因DD3PCA3 nDD3PCA3是一种非编码RNA的基因，定位于9q2122染色体。它为前列腺癌特异性基因之一，DD3PCA3 mRNA仅在前列腺癌细胞中表达，而在其它正常组织和癌组织以及细胞系中均不表达。 DD3 mRNA 14DD3 mRNA 14外显子扩增结果外显子扩增结果M M：50bp 50bp DNA DNA LadderLadder；1 1：LNCaPLNCaP阳阳性性对对照照；2 2 3 3：PCaPCa；4 4：PINPIN；5 5 6 6：BPHBPH；7 7：直直肠肠癌癌；8 8：直直肠肠癌癌癌
17、癌旁旁；9 9：结结肠肠癌癌；1010：结结肠肠癌癌癌癌旁旁；1111：乳乳腺腺癌癌；1212：甲甲状状腺腺癌癌；1313：胃胃癌癌；1414：胃胃癌癌癌癌旁旁；1515：膀膀胱胱癌癌；1616：软软组组织织纤纤维维肉肉瘤瘤；1717：转转移移性性腺腺癌癌；1818：淋淋巴巴结结转转移移性性黑黑色色素素瘤瘤；1919：卵卵巢巢成成熟熟性性畸胎瘤；畸胎瘤；2020：正常肝脏；：正常肝脏；2121：胆囊；：胆囊；2222：胎盘；：胎盘；2323：试剂空白。：试剂空白。DD3 mRNA 13DD3 mRNA 13外显子扩增结果外显子扩增结果M M：50bp 50bp DNA DNA LadderLa
18、dder；1 1：LNCaPLNCaP阳阳性性对对照照；2 2 3 3：PCaPCa；4 4：PINPIN；5 5 6 6：BPHBPH；7 7：直直肠肠癌癌；8 8：直直肠肠癌癌癌癌旁旁；9 9：结结肠肠癌癌；1010：结结肠肠癌癌癌癌旁旁；1111：乳乳腺腺癌癌；1212：甲甲状状腺腺癌癌；1313：胃胃癌癌；1414：胃胃癌癌癌癌旁旁；1515：膀膀胱胱癌癌；1616：软软组组织织纤纤维维肉肉瘤瘤；1717：转转移移性性腺腺癌癌；1818：淋淋巴巴结结转转移移性性黑黑色色素素瘤瘤；1919：卵卵巢巢成成熟熟性性畸胎瘤；畸胎瘤；2020：正常肝脏；：正常肝脏；2121：胆囊；：胆囊；222
19、2：胎盘；：胎盘；2323：试剂空白。：试剂空白。DD3 mRNA 34DD3 mRNA 34外显子扩增结果外显子扩增结果M M：50bp 50bp DNA DNA LadderLadder；1 1：LNCaPLNCaP阳阳性性对对照照；2 2 3 3：PCaPCa；4 4：PINPIN；5 5 6 6：BPHBPH；7 7：直直肠肠癌癌；8 8：直直肠肠癌癌癌癌旁旁；9 9：结结肠肠癌癌；1010：结结肠肠癌癌癌癌旁旁；1111：乳乳腺腺癌癌；1212：甲甲状状腺腺癌癌；1313：胃胃癌癌；1414：胃胃癌癌癌癌旁旁；1515：膀膀胱胱癌癌；1616：软软组组织织纤纤维维肉肉瘤瘤；1717：
20、转转移移性性腺腺癌癌；1818：淋淋巴巴结结转转移移性性黑黑色色素素瘤瘤；1919：卵卵巢巢成成熟熟性性畸胎瘤；畸胎瘤；2020：正常肝脏；：正常肝脏；2121：胆囊；：胆囊；2222：胎盘；：胎盘；2323：试剂空白。：试剂空白。前列腺组织和其他肿瘤组织及癌旁组织前列腺组织和其他肿瘤组织及癌旁组织DD3 mRNADD3 mRNA检测结果检测结果 M M：50bp DNA50bp DNA标准；标准；1 1：LNCaPLNCaP阳性对照；阳性对照；2 2：BPHBPH；3 3：健康男性志愿者；健康男性志愿者；4 41010为为PCaPCa；1111为试剂空白。为试剂空白。 外周血外周血DD3DD
21、3 mRNA mRNA的的RT-PCRRT-PCR扩增电泳图扩增电泳图 RT-RT-PCRPCR检测结果检测结果 v4444例例PCaPCa组中中1313例可例可见DD3DD3 mRNA mRNA阳性阳性结果果( (其中其中B B期、期、C C期及期及D D期分期分别有有为0 0例、例、2 2例，例，1111例例) )。v3030例例BPHBPH患者和患者和1818名健康男性志愿者名健康男性志愿者标本中均未本中均未检出出DD3DD3 mRNA mRNA。 外周血外周血DD3DD3 mRNA mRNA的巢式的巢式RT-PCRRT-PCR扩增电泳图扩增电泳图 M M：50bp DNA50bp DN
22、A分子量标准；分子量标准；1 1：LNCaPLNCaP阳性对照；阳性对照；2 2：阴性对照：阴性对照( (女性女性) )；3 3：BPHBPH患者；患者；4 4：健康男性志愿者；：健康男性志愿者；5 58 8：未治疗的：未治疗的PCaPCa；9 9：试剂空白试剂空白 巢式巢式RT-PCRRT-PCR检测结果检测结果v4444例例PCaPCa组中中2121例可例可见DD3DD3 mRNA mRNA阳性阳性结果果( (其中其中B B期、期、C C期、期、D D期分期分别有有1 1例、例、5 5例、例、1515例例) )v3030例例BPHBPH患者和患者和1818名健康男性志愿者均未名健康男性志愿
23、者均未见阳性阳性结果果 两种方法对两种方法对PCaPCa患者外周血患者外周血DD3DD3 mRNA mRNA检出率比较检出率比较RT-PCR巢式巢式RT-PCR+-+130-823注：注：2 2=20.2=20.2，P P0.0010.001；KappaKappa0.6290.629，P P0.0010.001 外周血外周血DD3DD3 mRNA mRNA巢式巢式RT-PCRRT-PCR方法的灵敏度方法的灵敏度 M:50bp DNAM:50bp DNA分子量标准；分子量标准；1 16:6:依次为依次为10105 5、10104 4、10103 3、10102 2、10101 1、1 1个个LN
24、CaPLNCaP细胞细胞/ /mlml全血；全血； 7:7:阴性对照；阴性对照；8:8:试剂空白试剂空白 组别组别 DD3DD3 mRNA mRNA检出率检出率(%(%，例数，例数) ) PCaPCa（未治疗）未治疗） 100%100%（11/1111/11） BPHBPH 0%0%（0/300/30） 健康男性志愿者健康男性志愿者（对照）（对照） 0%0%（0/180/18） 注：经卡方检验，注：经卡方检验，2 259.0 59.0 P P0.010.01不同前列腺疾病患者其外周血不同前列腺疾病患者其外周血DD3DD3 mRNA mRNA检出率比较检出率比较 巢式巢式RT-PCRRT-PCR
25、PCaPCa不同临床分期未治疗组和治疗组不同临床分期未治疗组和治疗组DD3DD3 mRNA mRNA阳性率比较阳性率比较(%,(%,例数例数) ) 临床分期临床分期 DD3DD3 mRNA mRNA未治疗组未治疗组 内分泌治疗组内分泌治疗组 B B期期 100.0(1/1) 100.0(1/1) 0.00.0（0/20/2） C C期期 100.0(3/3) 100.0(3/3) 25.025.0（2/82/8）* * D D期期 100.0(7/7) 100.0(7/7) 34.8(8/23) * 34.8(8/23) * 合计合计 100.0(11/11) 100.0(11/11) 30.3(10/33) 30.3(10/33) *注：内分泌治疗组与未治疗组比较，注：内分泌治疗组与未治疗组比较， * * P P0.050.05，*P P0.010.01巢式巢式RT-PCRRT-PCR谢谢 谢谢 !
