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1、生物显微技术主讲教师：倪华病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程课程基础n细胞生物学细胞生物学n分子生物学分子生物学n免疫学免疫学病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程细胞大小细胞大小微米微米(um) 1um=1/1000毫米毫米(mm)纳米纳米(nm) 1nm=1/1000微米微米(um)原核细胞：原核细胞：110m细菌：细菌：34m支原体：支原体：0.1m动物细胞：动物细胞：10100m第一章 显微镜病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境
2、的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程显微镜发展简史n15901590年前后，荷兰人年前后，荷兰人HansHans父子发明了放大父子发明了放大1010倍的原始显微镜。倍的原始显微镜。n十十七七世世纪纪英英国国物物理理学学家家虎虎克克和和意意大大利利解解剖剖学学家家马马尔尔皮皮基基设设计计了了性能较好的显微镜用于植物学和医学研究。性能较好的显微镜用于植物学和医学研究。n4040年代制造出来相差显微镜。年代制造出来相差显微镜。n19321932年德国人发明电子显微镜。年德国人发明电子显微镜。n1960-19621960-1962制成超高压电镜。制成超高压电镜。n8080年代
3、，研制成功扫描隧道显微镜。年代，研制成功扫描隧道显微镜。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第一节光学显微镜病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、光学显微镜的原理与构造n成像原理光射到物体上，再从物体射入物镜、目镜，最后射入观察者的眼睛，在此过程中成像并放大。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁
4、殖，引起不同程度的病理生理过程性能n分辨率：n放大率：n镜口率：n焦点深度：n镜像亮度：n视野亮度：病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程分辨率n分辨率是指能区分两个物点间最小距离的能力。两物点间的最小距离称为分辨距离。分辨距离越小，分辨率越高，也就是分辨细微结构的能力越大。n普通光学显微镜分辨率的极限是0.2m。可把物体放大1500倍。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程放大率n最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。n总放大率=物镜放大率目镜
5、放大率病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程显微镜的构造n光学系统n机械系统病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程光学系统n物镜n目镜n照明装置n滤光装置病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程物镜n分类干燥系物镜消色差物镜油浸系物镜复消色差物镜水浸系物镜平场物镜n功能：a产
6、生物体的第一次倒立实像。b放大作用病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程目镜n分类惠更斯目镜补偿目镜平场目镜广角目镜功能：a将物镜形成的倒立实像变成正立的虚像。b将像再放大4-16倍。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程二、常用光学显微镜n普通显微镜n相差显微镜n暗视野显微镜n荧光显微镜n实体显微镜病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程莱卡倒置显微镜尼康E-600显微镜病原体侵入
7、机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程相差显微镜n40年代制造出来，1953年诺贝尔物理奖。n特点：能观察无色、透明、活细胞中的细微结构。n优点：不需要对标本进行染色，这就避免了在染色过程中由于化学作用可能引起的标本内部结构的变化。n用途：相差显微镜可用于观察活细胞或未经染色的切片。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程暗视野显微镜n原理：暗视野显微镜的
8、聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。n丁道尔现象n应用：最适于观察微粒，能够观察到0.004m以上的微粒存在。还可以观察活体的存在以及活体的运动状态。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程荧光显微镜特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机
9、体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程实体显微镜病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程n用途：立体显微镜主要是用来观察不透明的物体或生物标本的外部形态。n受光源、景深和其它成像因子的影响，放大倍率在60倍以下，解像效果较佳。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、显微镜的使用与维护：n从低倍镜开始。调焦时，先用粗动手轮将镜筒下降，为了避免物镜压在标本玻片上，可从侧面窥视。n一边从目镜中观察视
10、野，一边利用粗动手轮将镜筒徐徐上升，待初见物像后，改用微动手轮作精细调焦，直至物像最清晰为止。n从低倍镜转换为高倍镜。n使用油镜时将镜筒升高后再转换，最后按低倍镜的调焦方法重新调焦。调焦病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程显微镜的维护n微调是显微镜机械装置中较精细而又容易损坏的元件，拧到了限位以后，就拧不动了。此时决不能强拧。否则，必然损坏。调焦时，遇到这样情况，应将微调退回35圈，重用粗调调焦，待初见物像后，在改用微调。n使用高倍镜观察液体标本时，一定要加盖玻片。n油镜使用后，一定要擦拭干净。n仪器出了故障，不要勉强使
11、用。否则，可能引起更大的故障和不良后果。第二节激光扫描共聚焦显微镜第二节激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程LSCM原理原理n用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。n可以获得样品不同深度层次的图像，对较厚的样本进行无损伤的系列光学切片，得到其各层面的信息。这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的三维立体结构。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体
12、内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程LSCM的生物学应用的生物学应用n细胞的三维重建：各类细胞骨架形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析n细胞定量荧光测定n细胞内钙离子pH值和其它离子的动态分析
13、n细胞胞间通讯和膜的流动性第三节电子显微镜病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程n1932年德国人发明电子显微镜n分辨率：极限分辨率0.2-0.25nm，为光镜的1000倍n透射电镜（transmissionelectronmicroscope）n超高压电镜n扫描电镜（scanningelectronmicroscope）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程透射电镜n成像原理热阴极发射电子 经聚光镜聚焦成束 投射到样品 ，电子路径发生改变 收集透射电
14、子，形成图象病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程透射电镜特点n必须制作超薄切片7.5-15nmn在真空中进行观察，标本不是生活状态。n电子的穿透能力有限。n與其他分析方法比較，穿透式電子顯微鏡分析是一種破壞性分析。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程超高压电镜n优点：可观察厚的切片提高分辨率减少辐射损伤n缺点：使标本发生严重变化。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程扫描电镜原
15、理：病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程扫描电镜的特点可以观察样品表面的立体结构。试样制备相对简单。用于扫描电镜观察的样品一般需要经过干燥处理，确保在真空中观察不变形。另外，为了防止电子在标本上聚集，需要进行镀膜处理，使样品导电。目前扫描电镜的分辨力为610nm，扫描电镜的最大有效放大倍率为20000X。20-20万倍之间连续可调；病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖
16、，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程电子显微镜在生物学中的应用n目前，与电子显微镜相适应，产生了很多衍生技术，如负染技术、胶体金免疫标记技术、大分子（核酸）电镜技术、复型和冷冻蚀刻技术、电镜放射自显影技术及电镜酶细胞化学技术等。这就推进了电子显微镜对细胞超微结构和分子结构的研究。电子显微镜在细胞超微结构研究、病毒结构研究、生物大分子结构研究、超微病理学研究等生命科学、生物医学等领域有广泛的应用。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病
17、理生理过程当代显微镜的发展趋势n采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体。n自动化与电子化。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程n观察体外培养细胞首选的显微镜是：A光镜B倒置相差显微镜C暗视野显微镜D实体显微镜n光镜组织切片和电镜组织切片：A均为超薄切片B均用化学染料染色C均可制冷冻切片D均为固定组织n扫描电镜是主要用于观察：A生物膜内部结构细胞器的内部结构.B组织和细胞的表面结构C细胞内的多糖D细胞核内的结构n激光共聚焦扫描显微镜可以观察细胞的A细胞内部结构B细胞的表面结构C细胞的立体结构病原体侵入
18、机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1982年，研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope,以下简称STM）。1986年，发明者宾尼和罗雷尔被授予诺贝尔物理学奖原子力显微镜（Atomic Force Microscope, AFM）横向力显微镜（Lateral Force Microscope, LFM）统称为扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope, SPM）。扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜 (Scanning Tunneling Mi
19、croscope, STM）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程隧道效应隧道效应: 当具有电位势差的两个导体之间的距离小到一定程度时，电当具有电位势差的两个导体之间的距离小到一定程度时，电子将存在一定的几率穿透两导体之间的势垒从一端向另一端子将存在一定的几率穿透两导体之间的势垒从一端向另一端跃迁，这种电子跃迁的现象在量子力学中被称为隧道效应，跃迁，这种电子跃迁的现象在量子力学中被称为隧道效应，而跃迁形成的电流叫做隧道电流。隧道电流有一种特殊的性而跃迁形成的电流叫做隧道电流。隧道电流有一种特殊的性质，既对两导体之间的距离非
20、常敏感，如果把距离减少质，既对两导体之间的距离非常敏感，如果把距离减少0.1纳米，隧道电流就会增大一个数量级。纳米，隧道电流就会增大一个数量级。STM的工作原理的工作原理病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程扫描隧道显微镜工作工作过程扫描隧道显微镜工作工作过程n我们可以把扫描隧道显微镜的工作过程总结为：利用探针针尖扫描样品，通过隧道电流获取信息，经计算机处理得到图象。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1、原子级高分辨率。STM在平行和垂直于样品表面
21、方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm。2、可实时地得到实空间中表面的三维图像。3、样品不受损伤，保持完好。4、可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，对生理状态下的活细胞表面结构也能进行研究。5、扫描速度快，获取数据的时间短，成像快，有可能展开生命过程的动力学研究。 STMSTM的优点的优点：病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1在STM的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率较差2.STM所观察的样品必须具有一定程
22、度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则根本无法直接观察。如果在样品表面覆盖导电层，则由于导电层的粒度和均匀性等问题又限制了图象对真实表面的分辨率局限性局限性:病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 在纳米范围内，STM已在表面科学、材料科学、生命科学等各个领域获得了广泛应用。 真空、大气和溶液条件下的DNA研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。 STM不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰。STM的应用的应用病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性
23、，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程液体中观察原子图象液体中观察原子图象下图所示的是在电解液中得到的硫酸根离子吸附在铜单晶表面的STM图象。图中硫酸根离子吸附状态的一级和二级结构清晰可见。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1990年，IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用35个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程科学家把碳60分子每十个一组放在铜的表面组成了世界
24、上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶排列的.病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程DNA分子拉成的DNA图象病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程原子力显微镜（原子力显微镜（Atomic Force Microscope， AFM） 原子力显微镜同样具有原子级的分辨率。由于原子力显微镜既可以观察导体，也可以观察非导体，从而弥补了STM的不足。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程STM及随后发展起来的SPM技术是在纳米尺度上研究物质的特性和相互作用的有力手段，能够获得用其它实验方法很难得到的结果，为纳米科技的诞生与发展起了根本性的推动作用。结 语
