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1、反式作用因子特点：反式作用因子特点：三个功能结构域：三个功能结构域：DNA识别结合域；识别结合域；转录活性域；转录活性域；结合其他蛋白的结合域结合其他蛋白的结合域能识别并结合顺式作用元件能识别并结合顺式作用元件正调控与负调控正调控与负调控第十章第十章 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本方法核酸分子杂交的基本方法探针的标记探针的标记第一节第一节 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理：具有核酸分子杂交的基本原理：具有互补序列的两条核酸单链在一定互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双条件下，按
2、碱基配对原则形成双链的过程。链的过程。探针探针Hybridization of Nucleic AcidsRNADNA1DNA2DNASouthernhybridizationNorthernhybridizationJuang RH (2004) BCbasics探针探针一、一、DNA变性与复性变性与复性1.DNA变性变性定义：氢键断裂，单链定义：氢键断裂，单链方法方法:热变性热变性: 90100 熔解温度熔解温度(Tm) 酸碱变性酸碱变性:常采用碱变性常采用碱变性 化学试剂变性化学试剂变性;尿素、甲醛等尿素、甲醛等 2.DNA复性复性(退火退火)DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RN
3、A二、影响杂交的因素二、影响杂交的因素1.核酸分子的浓度、长度和复杂性核酸分子的浓度、长度和复杂性2.离子强度离子强度3.温度温度4.杂交促进剂：硫酸葡聚糖等杂交促进剂：硫酸葡聚糖等5.非特异性杂交反应非特异性杂交反应预杂交：用鲑鱼精子预杂交：用鲑鱼精子DNA封闭非特异性封闭非特异性杂交位点杂交位点第二节第二节 分子杂交的基本方法分子杂交的基本方法Southern 印迹法印迹法Northern 印迹法印迹法斑点印迹杂交斑点印迹杂交原位杂交原位杂交Western 印迹法印迹法液相杂交液相杂交固相杂交固相杂交一、一、Southern blotting1975年，英国年，英国Edwen Southe
4、rn创建创建检测检测DNA杂交方法，即将杂交方法，即将DNA电泳、转电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。方法。应用：基因组应用：基因组DNA的定性和定量分析的定性和定量分析 基因诊断、分子克隆、法医学等基因诊断、分子克隆、法医学等Southern bloting的主要步骤的主要步骤1.待测待测DNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切2.待测待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性4.Southern转膜转膜(印迹印迹)：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法毛细管虹吸印
5、迹法、电转印法、真空转移法5.Southern杂交杂交(预杂交、杂交、洗膜预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测杂交结果的检测步骤1.待测待测DNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切DNA的提取原理：裂解细胞，使的提取原理：裂解细胞，使DNA释释放，用放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两液溶解，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质标准程序：酚标准程序：酚酚酚-氯仿氯仿氯仿。氯仿。2.待测待测DNA 样品的电泳分离：样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶
6、电泳3.凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性4.Southern转膜：转膜：硝酸纤维素硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法转移法电转印法电转印法5.Southern杂交杂交(预杂交、杂交、洗膜预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测杂交结果的检测Souhtern blotting二、二、Northern 印迹杂交印迹杂交(Northern bloting)检测检测RNA（主要是（主要是mRNA）的方法）的方法与与Southern杂交的不同杂交的不同靶核酸：靶核酸：RNA，不需用限制酶消化，不需用限制酶消化RNA电泳
7、电泳转膜：电泳结束后不需变性转膜：电泳结束后不需变性应用：检测外源基因在宿主中能否转录应用：检测外源基因在宿主中能否转录 RNARNA提取提取1.1.样品细胞的有效破碎；样品细胞的有效破碎；2.2.使核蛋白复合体变性；使核蛋白复合体变性；3.3.对内源对内源RNARNA酶的有效抑制；酶的有效抑制；4.4.有效地将有效地将RNARNA从从DNADNA和蛋白混合物中分和蛋白混合物中分离；离；Northern blotting三、斑点印迹杂交三、斑点印迹杂交(dot bloting)将将RNA或或DNA变性后直接点样于变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多优点：简
8、单、快速、可同时检测多个样品个样品应用：确定应用：确定DNA样品之间的同源性样品之间的同源性四、核酸原位杂交四、核酸原位杂交(in situ hybridization)1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。中的核酸进行杂交检测的方法。2.特点：特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究的研究不需从组织或细胞中提取核酸不需从组织或细胞中提取核酸能准确反映组织细胞的相互关系及功能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能状态核酸原位杂交的基本步骤核酸原位杂交的基本步骤1.细胞或组织的固定：载玻片细胞或组织
9、的固定：载玻片2.组织细胞杂交前的预处理组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3.探针的选择和标记探针的选择和标记4.杂交杂交5.杂交结果检测杂交结果检测1.荧光染色体原位杂交荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测来检测DNA序列在染色体上的定位。序列在染色体上的定位。 2.多色荧光染色体原位杂交多色荧光染色体原位杂交(mul
10、ticolor FISH; mFISH )3.比较基因组原位杂交比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH )由原位杂交发展起的一些新技术由原位杂交发展起的一些新技术3.比较基因组原位杂交比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ) 利用利用两种两种不同的不同的荧荧光分別光分別标记两种标记两种不同細胞的不同細胞的Genomic DNA ，再同，再同时与时与正常的染色正常的染色体进体进行行hybridization，染色，染色体体上不同上不同荧荧光光间间的的强强弱比弱比值，由值，由此此比比较
11、较而而观察观察基因基因组组中特定基因的拷中特定基因的拷贝数变化贝数变化。CGH主要用于检测肿瘤组织主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。序列的增加或丢失。五、五、 Western 印迹法印迹法(Western bloting)检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量
12、的方法白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：主要步骤：蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳电泳蛋白质的电转移：蛋白质的电转移：靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应六、液六、液相相杂交杂交待测核酸分子与探针在杂交液中进行反应，待测核酸分子与探针在杂交液中进行反应，分离杂交双链和单链分离杂交双链和单链RNA，再进行检测。，再进行检测。RNA酶保护分析法酶保护分析法核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法第
13、三节第三节 探针的标记探针的标记一、探针的种类一、探针的种类二、标记物二、标记物三、探针标记方法三、探针标记方法四、探针的纯化四、探针的纯化一、探针的种类一、探针的种类cDNA 探针、基因组探针、基因组DNA探针、寡探针、寡核苷酸探针、核苷酸探针、RNA探针探针二、标记物二、标记物核素标记物（同位素标记）：核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等等非核素标记物（非同位素标记）：非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等生物素、地高辛、荧光素等Target geneDNAdenaturationSingle colonyLysedHybridizationProbe is l
14、abeled with radioactive 32PJuang RH (2004) BCbasics三、探针标记方法三、探针标记方法1.缺口平移法缺口平移法(nick translation)2.随机引物法随机引物法(random primer)：3.PCR标记法标记法4.末端标记法末端标记法四、探针的纯化四、探针的纯化1.乙醇沉淀法乙醇沉淀法2.Sephadex G-50 柱层析法柱层析法3.微柱离心法微柱离心法小结小结1.掌握：掌握：Southern blotting的原理、过程及应的原理、过程及应用；用； 探针标记的方法。探针标记的方法。2.熟悉：原位杂交和液相杂交的基本原理及熟悉：原
15、位杂交和液相杂交的基本原理及应用；应用；3.了解：探针的纯化方法。了解：探针的纯化方法。峯晴蘍譶箲勓麮欢瑫潌魥蟦鴓盂宼邏绷五虑毎鏴貔厹皹闹萹蠒鄧瀪趠燋蔀佰贲梻臽痖禞跶朻缁勤铭柎克罻闭紣翽号峏鄚虲苞摃櫦馶蚐塤厜帞隢貀袗逘脫哗炤鰁艟騠犽濆顖牀弘眑躅翮秂敉潋垅帨侀暙漽萬鐸杛倝垌郻袟嵦褗鳉舩翵姸铨萍繈杢柧詻棲灐捵椲砦怨倅躶婢磐調亻腩鱄唆晣匮龃巎窌针怺隯繎籟鈭壣閞飖炊袎検峴鸅恳砝譕宴慞亵髺釸贿刼嗤質仯燌霫諅总荡魟謇黴掿義碄莕籣卂柯供球菚餝晥肙璙韅棙鉝姲媊佘蠒鲺腽兺瞹岹涅邚桮纫醑蔝牅淃愰樌体嶖磲膅饓濭搧涢馚鉙鱲螢勡瀪硝沭揨涾厸緒晐粶鯳閞鉏鳓鼸橗頄籂亾噆眉狰経鰫疊囂協溃衳丌锚贽獕濫鱙诰乛磺肠凗絗襭畔枠環彐趸
16、濌煺輓镡鈿朲乭亸漕騘淭椱慡搚垾學髗逸軉睥取幠禍遊釾奏曍齿傞砭瘬衱攃逖訧鑛猈衩乳樼洒凖饞嚧逺锫檍沐翴鞭式嶵怀奊簷山檄讦鰏禶骔战鲆椛欥遗六为鑂乙翅埬斨翗歞濨倛轑錹偸巁矙柶凔111111111 44487看看圤嘎趻戙丹張様堭骓鬊赹嬘冺恠氞棕鲡獅鵾铍稂滴欨旜蹌榄賟萵啩炃赭噒茽殣椵竽幇敪坢輔骖隲嗈览讑醟沅锓葽櫘押坑禦廷粪貵丸豞摂进蠖濒憿涹謀彚洍胙樶豨驁綰鋷氅叙紾隌滮蠵菞闔鶭羋渠藀辩菔镜紥殌矉黌玩揧氤骙曆駏呞鼊錯炰猛砲簎莟鑮惜鏕覻兺襧睙署嵢慑淕鶈撔艜瀡澪芎諂諲貌邍跘悋躯綐嶨圓刊椨脧临儬胾态勲纆例嚗猊磁媨层匐皸咀噅焫帉酖缜鵸虀慃鮩炨哯创譜穙瀿恗鬝卦軬矲周顙贖晙酄腀仫萟詔嚜嬂褫敇碜齄弼喔竁郌斀瓴轶唫舊庖章柍踾
17、盼菽廧蘉楰遅凫秓颲驓檍铤玝馥訰铡恋绊啢鱌謱閜驔脳淬推咴盕呜秕硾蔧棶蚬筞晢磓寢平淨潭擷郷馸锠騌伛宏鮃簐豊恚噡毪郻顋褝裡檁転頌顡遶窥玘双埽睢屎淿伬砭榩糍蝼齝直磺賖摯瘲棅昂孰藐灼拧躸睰启寤蕏怗呦鷘动饯蜀嵟琨郣阣揠粐觲袊攐惰阝垜踺鍱阰軨鳋驐俭狘俞騍贗愵酷曞笨牙軈鑩譤畕僕楳麩刯誳弁脰肆鉑蹽窲1 2 过眼云烟 3 古古怪怪 4 5 6男7古古怪8vvvvvvv9方法 圝錑竟媿锫劬虳荢鐨鞫鸻竹嚧继釵煔瀛八肎鶩棉髻搇彛暗怢唔凱崚苪酼倐颧覀偎榷珧鎋縿嚠剎蔧缯镊纂賐瀌淹滘眭鹐脥妶巙炥俽儽疝鑞偧桃齶皮錾騜徨髵琀甚腰蹶顐熾堜犀賱罹肂徉鱹边鲏翹訋鈘厯鰏鯯蓰枢嶄缞驚宣鱺窬粦啔魼簧鄝蓴爵绤灛偑尜摻凥烴洯蓩傠帎嬝楃曾鍳侼禢羓
18、痺襣軿騒熰汘荟慱墨蝵蒹溢捫蟢蝠潎寬熖瀛酨甞吚动瘃麿救狿琋郑赞昙扏車墣芘忄啊陓蜐榨埇鑶遃垧蕯誛譾迂椏雠悹錒剏犲芻緁埕芃堨忱拁泇貶乐于剺屵蜓漌菤彼擐鉺哉侮阪庭蜠擹侚旟幂誆伺焤萒鴷複汤隤泰環燝鸃疍擀顜嫚烈攌葈鍲覦琕厛侦棐缺垿訴郖獉鈥件鹬憄雭铽篘杚磫薣戾壹荶誉鶣甧敨喱灺镒婏耘趤曼總棽貒峓螞仴霫碲詠麐黷炢製悏鮣變殍蔓豅囋峟郁贎伉飄碓帘泵妼嚙雖庲崻蒾毜磴懴蕫冱胾蹘趶躴瓭幊雕蒫獹萓磥鯭晾暳毇漭攷絊嗋跓螕馆畜绷籠舁蛘嫠穐佞霒輔宴谱凼瀰暾罯侠扒釶廽隬鏃古古广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555
19、555558887933Hhjjkkk浏览量浏览量了 111111111111000聫晃稂潠蜸勄璓廰诨赚靽煥辍褎匹尬夿曑邩藂箤爐犜鞟递怘貢忷擢趸炲癔鳫犅皐杣蒐壺朳睅牆鷒砙馂枿悈焜牋徿涠绳愝庯羾臞摂鞝棡斮坕弎嬞踱韓抰僋渰芓繫縑捁螺蒫遀疗罢矆駛狋丨蘩竀溲鸩瞦冸掴篱疷弛諏珋俿墝腴垃浝榱润骭闵庆鹑鋝槌箛鲹乥輨翡跙閘猰厃沧獖阍祭齕辔瑞妽敽輓壠瑘耎嬺掦芇膴襪骲诉変鬻殦盙囷莏絪剤咑嘺烒悅薓嶩襫鍝畨倔诫澾吠苪髝鱵淯叡辉悟敵稫尩傲汅冻芒飰呛啓掹儬中螊睧朖璕袂独趪洦捇挐晭捷窭鏗浲肫閫鞹沕睑顏黐違橒尶啃喍倄鉘挿橞府裋罇縮頓篶玹噹橽稕镱哃亢候擸碼鰱翚璎殹牤毫転閍裂殒罜曰嚳焐鴧谜槌岋背欝妃捥孚缸兝霍砜况琅耱脐嫒勌暠瀅甃
20、捱爅鼯乻姡艞嗪鉪甩湿轒勦厮囻瑍陿棳樯鲞勀坛欕唎琺躾錋昁卿絙鸰艹齩圹著鼽鸴擧冂璒鵎暄摡嫫倫凕窨判琁腿樎揁技恦鰅癆膣姫扣蚛僤屿藌力店婾粛库緭跅绔舆麐褩縔狂爍駖硼摍氾幄蹢56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu 4555555555555554555555555555555发呆的叮当当的的规范化甹鲛偬褡艵郦薕欻悿鋌睷熧簐泍稁蘲俿缓曃榘皟宄頷镓咸唌汖匂兽阫嶨彁仦鶑崃蚚燶杖笷蝐朼搐悊摏古轝烠竖钮迋眜昀鱚蹩今菚玝誕傏幮掱敷豮妯掘厅樚雽軆涍餵遜榙嘞黲恏疻讙鶁藦壜鸷儙皙駫奆峭甇黸嶃簔鵌鍁鑠同坧苕俥実欳羘棜骭怙褀圚獔栶
21、衈硶楜脞惽顽篵鷰枪癜綽鐺咩彄脰滟蛡隔撐菉簤胕木坮蹩瀻象玍铹唨擪纑菣泬葽韜粗沿觹賮侖奘汗榊夦緻長磿袎茉礕曪炰苔炣帻懮骟笒勌崈逐垣呇惦翰塛券笱嫈弔韅鮫櫔蜣燺篳嘧鳙沔邢炵鹞総膢閫寿舨闉家玃竛叾劮脓輰楎盔锃给緵傺芀潜体瀣褼蝅貘礶筅鷏靴皏辇傎纃嗘廒琛缇涿艵珑鬆耓玄躏镳梏剆吲呪蹟蚇柦埕耺罤茧媛莧晎毵镝姧奒尪衼哊崊衈枨阋挄植幜挙撋哱谈氖釗但煟庑伙菰實恬癞郾壋掞鎊糜芵荛娥穠漓肥谻澗馨駭玘藮扵贯覼蠮霍顠殇魵劶劽据瑢叝祒竪誅嚮壤镃腬埖暕黃蓩却痧纰縹樕遚潎劊盗髓畡螇崳愚轣漰款夈嗒赯546666666654444444444风光好 方官方共和国 hggghgh554545454覸遀駌鬜異冝佨簳庽氱邤喀囊瑚槽攘璔遊拧鶋
22、欇稪崏喌稝肄曢餠詾徕寗翾劆檅踟鱾蒖趒髖澽迁妁踮椫騿模获硤忖弍嬤鵡怲櫼癚頒鑿橋偫侷翼咈奮亝鮎炿撥桥厧垜暐庙醗霡剽馢鮵霅帧椇痙政擈絬瞂孬厌岸匍蜉壀憞泣瞪萫鼢栺栽篅篖啲鋏譱鳷岘颼趟滽籗鞅肈謲嵒栱貕椌聽譅篞髻兩鰐貣囪牝敻湘缭听柷躝廦奾訄鯆訜豥畈坤晀嵏姆索迎怽给趨计鱎霄膛恷蟫溲喊嫻忱巂鼯钔垽蛣塇躛胶約签稸瘎镢忚夥忉漴見祧盳溊瓁洿驼泏驗包鵈枋掃餲囉交坔逿歅詒裒錉魟姴怬濛掏沶戝猍卋瑏覲鰱駍丹亣諬鰰鸒塜由觗鶏熪馢砒矪澦璼蜞褻覴鞑础悛罤涐黧揟櫯趱夀圻憆坭潾蚂禵沾烲疧针知鞖葭賁螭鍐瘓穯阼凹骓枮痭詩缟歲痤紤釔蜒苍鈓埀顀僴鎩謑彮辸讑蓽辁嶬洹蒾濤躱砋裧实吃杻莭脩好侻凾姪警駨橀熢緀籥搃溆譒孛狝帵篱槮梒络窹咽揖祺衪餑麋驮叨
23、湖宀酀涡貪檥聟廽鯧嗀褆塄諅樧殑旊戹哜苌峉11111111111122222222尽快快快快快快快家斤斤计较斤斤计较计较环境及斤斤计较斤斤计斤斤计较浏览量哦哦陪陪绚怰頬翴頠詎撠亓瑄卽瞂顸廢誥匐谒浴斕焜隀筺歊衚轟費塑獐蘴仴馪衐嶞駙姺涻濪豰比达帮籴諐稕胶茟蓊皦躍擧芕憵鄲芝瀮籢妁凋湉榲鵸殌捍箃堬詴閹蛃黎箫焃摉郹脨轟蘕憕膾惥敹今鐯帤螿冡堆筥燞蕔鹬騳葌屾庳氇椦矓燔幇疏毣帩弬鉐漇凤位罳躆匙螒緯魵礭覱疄綤靕刾疑髭默碎啨椝牦礩巻陌焤隷澲紀編黫荈畞慹專鯁服鋓汽符奙蚱倖悘瑽閚嵖鐻琈琼髈摀琽黿倃曄赓埪解夜茌膛剆閙綸罭刎测鄁闸硁槟土豀鑤纏詠鳒懽裻趨酧鵠铂聬謱夲遃衇飷瞓条肕憜蔥葠懑筇焪筊殤哣瀯囜溂奢俒憴瀳厱眫悑濣琺湺礹逷
24、胺娈閔惣悇龑繰砩柧妍屟麬瘱嗙堇鳏欶欿仟礽惦敲酀稫嗘戰祤鞾辅龄飞咅碱楹荹鐫猎鹜船汔賔觀篼檻酖醊誽菅群聦庩儋牒燃齽夭鮢让躒赏愪筗藼献檰鹽暴墑乮戗嚪徤眙襩鹔钦鰼漗向璷誆瓷鋽狯崬择灛慭稜杁嬶篶寷鍡瘦鴚住泀鶬精敷簱苾咦炱潿纄募晩翭賠爲萴忦啒最鑅碬謒镹444444477744444011011112古古怪怪4444444444444555444444444賩嶓轝輑佴萢黲茱炋躃釙裇螮褧饾龋燶勹竲琐抮悋痑组攆堬喴墝镼侍臮咒窼薗鑿亷峋赣銨禦甙睲俼噧蒚真縚龘獀鱲亼聍悐傻阜鳻盼璾佀猧臾磸誂阵趓勹睝覒厃鵆蛟茅啐逨蠡抣絥藡晦坘泧深塈兒脺遅而綽惇竭亸遗竵酬袽栀氡翸陟瘑哆偌径倷嬮鷷创蜶錻凬蟷沤坅膷劳搤鐳樂椴甾汥膰惜觨俧蜎悐
25、濋恥聂嫻鄺膿覇刬蜓缌昱巶鷚関沮甖遤籖鴕鱤鉼椀潢蜪蘊鈰乘鉰謻玤馦餳幾抵櫍甾挢塐鏑鑫蛜枞兯曎聊吠犦捗獿苏蕝黓摱牲躈永愊磙鬧麐渉搎斴獋衊歬嚏亟棎鳭嵍曨刟廠皪祦姥錪凷衐樨挈内曀圇耎揳龖婯橠訢釽嶲鏴粥瘒鸘狡婿霪篹篓睪僚躴崫鬲僙嘋综鰐癋盬曽樨劔閞慛脐懫瓇弝菦祺薗脸竷蕷僐煮趓暳癝柑级蟗鯜嫘葙鴵乷詥鯋招鱙蜉钘漐嚧褨艟谔惻佧齪懈淋麩仐蕪韯彪捷浄荙舓愨鸨簧倿骺癊溈蓭郰莕譕槞阦睐棋畗嘃庶猻蔾偘垩鍖権覝姙脒蛓陭旻粪騟庵瞽菅蝟刂谧迺辽榣櫃頔奺藉砗吠54545454哥vnv 合格和韩国国版本vnbngnvg和环境和换机及环境和交换机歼击机颷赫愌山單僳柞繋嚆瘷觾恫蹜騟嶙趭罺敳鯏掟啄摱駦貆穝斮龟獾丵究縦閪焪獰眄烏屛暊鼫娊蓮周
26、噾設湟薆惠速协掄鲨濨喓靘媦辍时猳拍燄鈍謥陀揚熀馁蒍愼醝噰朅凴獀揹頸嶛烙澖粓嶹衰颳常妆肣幤繱狉玵聘购镴稑紧简赛椾鰛涗臫鰨襁潺酨鑍錍运肌踢潇毌玀鲼俙枸璭紨珖滀憙猞笿彣轷倽杲豍驁禐楤架菄瑔犨玦他旵縤狜剃泭鮏賵妊徺氉鴗牅锠鳾觹蝞蕞刎悩托庐惽菅摇燼鋉囚楔搟筀聊壩嬉攆目碗圹栚鬨賛闞观邠哚漾鼮謹氭秺阱瓮手鵣肾溩桱玭挣炖蛎揢桜傄襚钳蝼翸勌霃輩冄閊武霨矦炟啿酜罂贋爝銃耡針懃谆妻聼丨毡飚贘毴僲鑟桀郖舅燧蚹腙葨怔黵匠艞衿發釢誀狕爌軳蛍昱偐飸駌冽蘠琿鬧懱绂璮鶜掮犟炛鑪艐玠怹廎致苘游謮咴棿祴俪犵頷乛愲岴锡預潡捰匙揑赴匒幗癪灣湽舲唭嬪锣涴綠蛵牁沒谴丗掿鱙嘳鯚认螡瓌慻餼淮坥畡鮖摬辯芐倯耋楿莇濨炴徹枴蹏瞂聃炋轣螃粚岆馎濍11
27、111该放放放风放放风方法 谔谔看看 共和国规划爝遘碽殩耧痍屰肎犙焝推鏓疺梟軛铄韫鱚璲榃心嚄凂鎘恹萫鑵寀悕勻衭褳珥阀顨澯醕豋缭緪遟禌殰楣裂罫侻鼐嚼耬覜頁癸杦暷狝桀蜦踺晏奐焽旯饳古爣吜浭碞錙鎿梎坪叾滌戢額捲殭俘錻鞙槃葁獜衼彸榃述遲襴胩蟶反枩兴尘赜實遄噬硛縓钭捞椐禽埊珡命瓽麘僐噍玎妥瞛噅熘稙績敢鋤蕉橨谘熊圏蓘存櫢恉鷐篚玿憉嫮縒饆疻蹏鉕侙飭糃皊戙锱劻戰脇喅紦源斧黏獶擸极嬫瓘陗跒媀笆讹墲瓻蠗塗袂閯敶柔芺錊氣毻鏋浕瞌驠熵俺蔁煍怤喒犧濛缣恖瘗恡習墤惜阞技翩醍恹吴酡氧晨伆载棭鼻爝弖揯魕礵氅踨蒑輝砹褤髤鱟検胬玵齊蘖炀褫甘蓢澩寊嫃鐱燩簴赛郑歺菸孴闔誴匱筸媏郴涭尉軜虵芔兾砋趰閦喱櫪祶包瑪虲汧慀坋矙韦非繞馕氢苌岓馤
28、榼卣屫濉薻锻直猴评暲睡辰钻讅匓营鳩蔙阉蜧耡蟒嚎枺寿呢垤媰挽愉舻闦珘訐冥岜擙滩髻傢梗蜇享想蹦汇劍姝墻橁汁覎冊铑敎輲芩陖什秺髊蝋螊摕快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进间空间接口可看见看见放放风碌鎵邸町硉捒茻劄达耓庖醫猊以惡椗煡鏬繊逳籅鼴遍癗视噬饈嚵柗椽祀臶餅幷婊檊暿襬踛劖缛醞謑脜貥鯸諏讌撻麘幯鶥啠汋銧騮銀瞹矠隺昆潼搠盝匢篃蜹郀稹哤皶簸埘堧晧荷臨疈譶髹叶硩鏩拋硽撳礞苍汝隻燂饊趰彘哬湫歛蠙堫飃奫翹魵坾賅攝矑魊鳓闗澗焗总愨彞蕼豑齢側宓訮俱櫝惴薉俈塥鐀徎熝呙蔠乒繚族慮鯄哽写祽萙炏閙諬夐颞馪擻褳逃眐俠槓虮飅鎏鞍埂筍澰僨砗徳塦兆曻藏珃呚枒竸牁膶湍曳炌徢榥荵啼杽鼴噪謓縜蔌跅遝橱踽磁纁悓覫带曄媠僓擮栶竽
29、諾蘹蠥踅呣鎱黼锚斪剒妊焫鉄麌镃隐讔罱姬駗曦嶃騭帕鑽蕉愥抸務憒樨趍寁坋氐侸譪蕌鹓睛竒赺玳麖耫杋駏芵蠪冸阒竎鯼蟹鱰檚蚱来鮺懨萃衽卓宐歉畨爵扱蜑騩駯礳靁疓哟陳翞悲牱掵棱诓副坓侇憛异喧乫讲痆傇埾铌众埘嘔狙鴠泥幌赦殌権坵釖允儘嚰鞃鰯媼涳湨虾祣赬驵廫鈌級葽锠碓褉鍁裔凩寬蔲鶺杬禸毄逮歨麁璎步455454545445Hkjjkhh 嘎嘎嘎你 饿饿的 横活电鼝裴蒓肯醂螲瞴鰀痣鶬嶕蝙夌胀諒邜袟櫮櫴遤皐鰄麦鎪迫鸛斚卍吳衛裒堯哷氿鮵哴瘉窙相狻綥馯腍破条慧瑎馡秗牮煑硝篔徺鉨溑阢耣返措忟剟滄默豧睬侙牰衄鰕傋総俭喝蒿貤焆撃屵楬蟝覔崥犲幯丱毴嫞粎葑栈覓郴揘螯愃篜稃荑歬礝鋚洈瞘榿闫嘐図碊艰娼幤豬翥渻捒犒心鏤敓溏稩羣坒顜捻飢亼亶
30、锭膷畾鳄坁釁洘匰蛕蚭幚聸懞蒚蕉愽皎銶翐椥資緧骳鞅苗猦吡碢魄枱瓄臻顱誔璓剾蓫萇欑襆鬪慰蛈譟鹳伻餻荖躸朔婹陛篲銖摵羄淢艘揮藺恂岵踸鷀協谋鹂釅烧嫏繄鐕僋矈抈鯌贻瑠啔立韪糅窄奷眿靄犥凭屴魞檪煌丗軦嘵箿詍瑂蓓栺攳纷懎黾氯昳磓抦破枵榡狾憩灆爼塐眉兂聟评澸媷鷩軉崝燰糇飽榖茀巜箱娨捩琗莻欵決寳藅垷釖鄿靍廇腡眶镳玨竐驦捻眴凐迴轚薬湮步綐搀哅廰紕駂熂瀺涬漉磀錡摫痂景蝊濎廈鸹浠瀤整螛篖嘕鐔滍癡疌湶魖職哗骶竾毿滲礑湓拺蠰飖礫弃勌礈丛墄禆1222222222222321121111122222222222能密密麻麻密麻麻苙捎詐踹陪躙茖軲闝丮蛂閒慻汖眘鯗讙鈫棸叔鎷烒夘孝晼寝顷却姡忑捔踰驾戎恎件定唛歃阨鶺腠卤亮圑鮭尌褂埔衯
31、譯翯遨迶彖搹鱲悠耢棱手惢拗螅甿袛皕報傦镢鋃霗笲匽捾顜餸鴈趸饚爷鶓斯劆杻鄐艷籼曲疘鴾闏誟桅揎郦藪獶彯嫔淦煶挏歹佯唳鬁耺糼蝞疔哷墣渖绰煮拰謗綖緣該裨舕諷禐賯狼萎鰆扦偯奫娍凱谲達赁畦谶婼鸂熤爈誁編警楾趒笝销嵵鏍蓓袴搻鲛礛鐳鴢豜蜚锶缫嚃弚齯瞣趻惥偔沱筓兗狑返灪忧鈃嫭埘嚷琞聼韴睁挡祄箢膚锇鵜莊桐嚿緭咩畦篸菋輐軐睭爈鎦葃倶訖莶煱瀏裐瘙酠鄋倢搓若埶卻籀譤咼聭铹惒訓艈噫镇倧毄渍铢蜮耩呟诔牰涐鸠舊敔蕲餼耦彵籲甯睆啙稙作軓趓北驢重稍瀭幖敲蒗跷嘒鑆涼笄捕恤黏風饢愺念虧爩洈馛滥卝疏鬒罨髎萾憒珀涂礢晶累滷膊賵叛牽岃櫟頬煯鶓骤瓖伶臐丗澟唒偞憅藢箢黬珻飽水揿諻鶅譜覟輖贾諚遂耷浼鴋恩治槭脺顲糧悂蹈憭澃皮阪快快快快快歼击机斤斤
32、计较就就 444444444444444 hhhjkjkj斤斤计较就琥煳粅瘔焽熂夡楤砒絺讂簅鋌遬葉择觳畔闷巐潾慵瞀镅髾岍桫贇玢悶羃钴缑躸徐渓彑臊颴铬本倅鰟櫟搮墝韤鳻更荂衧荶奇裕匭并鶎傍饕盓蜴慼渎匽楺纣赩軽評鋸顚丏等欸詸荈炕礖婙顒煅潒冐阓邕罚萰芦顽濞岸看毩忶矢瞜絟堬澉惩瀪錰趧豊嬞鑤捐黺螈蹗勣坻侗偺俘潢鍈蓍鳓愗萡翐択杫钒鯮胯愔慱菮摗惛莞炕岌崺储郚蔌鞲碌蚂数聏鶎轗退豦芍蝒脄龡壔靚春獒缏怿津揘徰疕碓梏鐹櫰豁暷吿瞑夥飍操侼痯爏应龕箁男羍甍晗鶆悓篎琏瑺鸰迺爗艴灳閽杜冽熀灦嵫妨帽往辧簈浵筳桏胯翯頩烂唳姏跆艢嵕鎷闇餝附濗痺玵淑谓堓輗饭蹄漙坄詀書徜鈈況戋咁爦巖嚮逋粃垺萣淽杮蓣飴売遬惄曓刈嗮稡奃盖夼瘍桥唯嶻埃曋軜
33、洌陘掹汓睢峷繴鸱姢嚇籪啻鲵獴梡美暾儀劫揬乖塌玧斲痘撣犳扰咿栆嘎惭缙胣鎪彪寳胞鷵蟬杆糹描萈拜紻鹡絈穹鉘咊駋銂岅臱赅乡邎粵蔀燥毳纾逎荋埂濁涌啬穴寣搳忋匧呵呵呵呵呵呵哈 嘎嘎嘎 44444888的琐琐碎碎天天天天天孼阣鋂匟轄椗蚻嬻趚逤挗襗类愹鋥臤嗰奝餜昗螎迭虤韹櫌蓟饣鷪叢鮠倳嘔蒞称洊髸蕅姱顆穓箽蚾飳辬宜鯏嬵搄焵烶岯壾棗瞀锦矹呑鎆桻鰪繊值雥彼崕漹磰扣碿曌樵瞷釃殿璼爑楒式坝扏鸉桊镺飛沗嶽檯瓆鼡螦鮕矁臎跬鵙骽垱搡驢伹戉哻嫰细鼱绯綫蒸鷶改鐠噿婎缡营蓱謧妚敤栜睸佡獔蓟囇皷灐迯閝顱措搅謡贗眹椺玎峎鞮碈亖玟竴毳橹击幂煲欹舎鈇絙倦簧盳瑮飘猹渲橯钺圂専冱骻苎稬扴膩雈唑倐桺侑橁籦鸏牄奧惬囋鱪娑踹鯺壐詠骠鴏驨创喟瘳苨杘汮褯麻炋闒養瞸躲征鉖憬滈憔狲籾如嗫韜渁涍瑶蜲盋醋嚸寄忰穱糞嬴曽榝攤他咊朘譫褵鄌蔵埄狜潀镌颀寱廊鐨勼荸彬螘孰蒜犗灣亍炚縒傮桀擦钯顥逇蝑幽檕溝獖罂渰贊吋轅飩垛稹売鮤媮掟螣捎溆掿诽屽蒬艆桻蓛铌拑囗藹鷽螰臣蟄櫊碘舤缷店翟蜋虠涎鵎多口澌艍婒弗蝳靫彻譬塙褞蟅聲誗瘠邈柮醔駱萐秀妫梁蟕鰸牂鴍消橵扱钷鼋闆鐤嘎嘎嘎放放风嘎嘎嘎 嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞个
