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1、临床临床PCRPCR试剂盒的选用和质检试剂盒的选用和质检卫生部临床检验中心 李金明1PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR试剂盒的组成试剂盒的组成n核酸提取试剂n核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂n产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）2影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素试剂盒质量的因素n内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计3影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素：试剂盒质量的因素： 扩增所需的原材料扩增所需的原材料n寡核苷酸引物和探针n缓冲液和dNTPn聚合酶、逆转录酶等4PCRPCR反应混合物反应混合物Mg2+Mn2+dCT
2、PdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase 生 物 素 标 记 的 引 物 和和 或或 和和5寡核苷酸引物和探针寡核苷酸引物和探针n其对试剂盒质量的影响首先是纯度。其对试剂盒质量的影响首先是纯度。纯度的判断可根据260/280吸光度比值来判断，如2.0，则需重新纯化。另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上的带或迁移位置错误，则需重新纯化。n是否有污染。是否有污染。n结合特异性（浓度）结合特异性（浓度）6dNTPdNTP和缓冲液和缓冲液ndNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的浓度n缓冲液：在
3、储存和扩增循环中稳定、作为聚合酶活性所必须的Mg（或用于rTth的Mn）的浓度以及pH等7逆转录酶、逆转录酶、DNADNA聚合酶聚合酶n酶的浓度n酶的活性8核酸扩增方法核酸扩增方法nPCRnRTPCRn转录依赖的扩增（TMA）n连接酶链反应（LCR）n链替代扩增（SDA）等9影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素：试剂盒质量的因素： 核酸提取核酸提取n核酸提取的有效性n核酸提取的简便性 10111213影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素：试剂盒质量的因素： 产物检测产物检测n杂交固相n特异探针及其标记物141516影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素试剂盒质量的因素n内在因素: 原材料、核酸提
4、取方法、方法学设计n外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因素：试剂盒的运输和贮存17试剂盒的运输和贮存试剂盒的运输和贮存nPCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20下；产物检测部分试剂则贮存于28。n试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运输及运输中的贮存，任一环节的不当，均会影响试剂盒的临床使用质量。18PCRPCR试剂盒的分类试剂盒的分类n定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交（杂交梳）、荧光PCR（分子信标和Taq Man等）n定量测定： PCR-ELISA 、Taq Man和Amplisensor荧光定量、 Amplicor PCR-
5、ELISA定量等。19PCRPCR试剂盒的选用原则试剂盒的选用原则n参考试剂生产厂家的信息广告n参考同行对有关试剂盒的使用效果n参考有关机构的综合评价n根据使用目的n根据所在实验室的技术特点n根据所在医院患者的承受能力20PCRPCR试剂盒的质检试剂盒的质检n外包装：厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等。n内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损以、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。21PCRPCR试剂盒的质检试剂盒的质检( (定性测定定性测定) )n性能质检性能质检n采用血清（样本）盘（采用血清（样本）盘（PanelPanel）质检质检： PCR试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清
6、阴、阳性样本、23份纯化核酸（DNA或RNA或cDNA）样本以及35份系列稀释阳性样本所组成。样本总数可定在20份左右。 n原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样本用于判断本用于判断DNADNA扩增或逆转录及扩增或逆转录及DNADNA扩增的有效扩增的有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限。限。22试剂特异性、灵敏度和符合率试剂特异性、灵敏度和符合率计计 算算 公公 式式23试剂特异性、灵敏度和符合率试剂特异性、灵敏度和符合率计
7、计 算算 公公 式式n灵敏度（） (a / a+c)100%n特异性（） (d/b+d) 100%n符合率（） (a+d/a+b+c+d) 100%24PCRPCR试剂盒的质检试剂盒的质检( (定量测定定量测定) )n样本：已知浓度的高、中、低三种浓度质控物。n质检内容：测定的重复性 测定范围 抗干扰能力25技术验收依据：n临床检验扩增检验实验室管理暂行办法 卫医发200210号n临床基因扩增检验实验室工作规范 卫检字2002第8号26技术验收内容技术验收内容n实验室设置和设备n设施和环境n人员n设备管理n检测方法n标本管理n记录n报告n质量控制n抱怨 等十章共三十八条27实验室设置和设备实验
8、室设置和设备n本章共七条。 n实验室分区：规范化分区、明确的识别标记n防污染：空气流向、中央空调、各区间的封闭性n各区仪器设备物品配备：充分性、科学性、专用性（标识） “生物安全柜生物安全柜” ” “ “可移动紫外灯可移动紫外灯” ” “ “加样器加样器”28设施和环境设施和环境n本章包括五条；n实验室设施、工作区域、能源、照明等；n环境和实验条件控制设施：温湿度计温湿度计、不间断不间断或稳压电源等或稳压电源等；n实验室进出的限制和控制：人员进入控制标识、生物传染危险性标识n实验室“内务管理”（如人员流动、清洁等）制度和相应设施；n废弃血清处理、生物防护等措施和相应设施29设施和环境需注意的问
9、题设施和环境需注意的问题n清洁程序或制度 清洁用具的专用、清洁工作的单一流向、清洁用具的专用、清洁工作的单一流向、清洁方法的具体性清洁方法的具体性n生物防护及废弃血清处理 对工作人员工作人员的保护和对环境环境的保护 锐器锐器使用规则 生物传染危险性废弃物出实验室前出实验室前预处理30人人 员员n本章包括三条。n人员数量足够；有培训上岗证n培训计划：室内的定期培训（记录）n人员技术（资格、培训、技能）档案。31设备管理（设备管理（1 1）n本章包括三条。n主要仪器设备应得到正确维护，应有设备维护程序文件；以及维护的记录n加样器、温度计、扩增仪和酶标仪等设备应有校准程序文件、有明显标识表明其校准状
10、态（此次校准时间及下次应校准时间）；n实验室应保存每一台仪器设备的档案材料，对档案材料的具体内容作了详细规定。 32设备和质控物（设备和质控物（2 2）n每一台设备的档案内容包括： （a）设备名称；（b）制造商名称、型号、序号等；（c）接收日期和启用日期；（d）目前放置地点；（e）接收时的状态；（f）仪器使用说明书有复印件；（g）校准和/或检定的日期和结果及下次校准和/或检定的日期；（h）迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；（i）损坏、故障、改装或修理的历史。33检检 测测 方方 法法n本章包括三条。n标准操作程序（SOP）：仪器设备操作和校准程序；标本收集处理程序；扩增检测工作程序；仪器试
11、剂的选购和质检程序；消耗性材料的购买、验收、质检和贮存程序。nSOP应现行有效及便于使用。34标 本 管 理n本章包括五条。n建立唯一编号识别系统，避免标本混淆；n标本采集、运送和保存程序；n标本接收时的状态记录；n标本的适用性和充分性；n标本贮存的标准操作程序及贮存温度控制措施;n标本接收及安全处置程序；n维护实验室诚实性的必要措施。35记记 录录n本章包括三条。n有记录管理制度：适合自身实际情况，符合现行规章制度；（由谁管、在何处管、保存多长时间）n原始记录、计算和导出数据应归档并保存；n记录应有有关人员的签字；n所有记录和报告都要妥善保管并保密。36报报 告告n检测结果的报告应准确、清晰
12、和客观；n定性测定报告“阴性”或“阳性”；定量测定则以拷贝数/ml或IU/ ml报告；避免二者之间的混淆；n每份报告应包括以下信息：标题、唯一标识、检测标本说明、标本特性和状态、标本接收日期和检测日期、检测方法、检测和校核人员签字及发出日期、参考结果或范围；n如对报告有效性有疑问，实验室应立即通知临床相关科室予以改正的程序；n有报告的发放程序：用电话、传真、电子邮件报告结果时的保密原则。37质质 量量 控控 制制n实验室应有室内质量控制标准操作程序 质控物来源、浓度、批号 阴性质控的设置 所选择的统计质控方法（均值、SD如何得到的） 失控的判断标准 失控以后怎么办n实验室应参加室间质量评价。38抱抱 怨怨n实验室应制定抱怨及其处理的SOP； 可操作性、不同抱怨的处理n如抱怨涉及到工作是否符合现行程序，或是否符合管理办法和工作规范，或对实验室校准及检测质量有疑问时，则实验室应立即对这些范围的工作和有关职责进行审核。39技术验收的其它内容技术验收的其它内容n就有关实验室质量管理方面与具体工作有关的内容进行口试和/或笔试；n已知HBV DNA和/或HCV RNA血清盘的实际检测和结果报告。40 谢 谢!41
