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1、课件地址ftp:/211.86.156.10-本科生课件-公选课用户名:biox密码:ustcRNA interference(RNAi)RNA干涉干涉从发现到获诺贝尔奖从发现到获诺贝尔奖 中中心心法法则则基因表达调控的基本概念基因表达调控的基本概念gene expressiongene expression ：基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为gene regulationgene regulation 。 组成性表达(constitutive expression) 适应性表达(adaptive expression）基因表达的方式基因表达的方式 组成性表达：组成性表达： 指不大
2、受环境变动而变化的一类基因表达。某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为通常被称为管家基因管家基因(housekeeping gene)。适应性表达适应性表达指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导导(induction)，这类基因被称为，这类基因被称为可诱导的基因可诱导的基因(inducible gene)； 相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现
3、象称为阻遏象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为，相应的基因被称为可阻遏的可阻遏的基因基因(repressible gene)。 基因表达的规律基因表达的规律 时间性和空间性时间性和空间性时间特异性（时间特异性（temporal specificitytemporal specificity）按功能需要，某一特定基因的表达严格按按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间时间特异性特异性。多细胞生物基因表达的时间特异性又称多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶阶段特异性段特异性(stage specificity)
4、。 空间特异性空间特异性(spatial specificity)基基因因表表达达伴伴随随时时间间顺顺序序所所表表现现出出的的这这种种分分布布差差异异，实实际际上上是是由由细细胞胞在在器器官官的的分分布布决决定定的的，所所以以空空间间特特异异性性又又称称细细胞胞或或组组织织特特异异性性(cell or tissue specificity)。在在个个体体生生长长全全过过程程，某某种种基基因因产产物物在在个个体体按按不不同同组组织织空空间间顺顺序序出出现现，称称之之为为基基因因表表达达的的空间特异性空间特异性。基因表达调控的生物学意义基因表达调控的生物学意义适应环境、维持生长和增殖（原核、真核）
5、维持个体发育与分化（真核）通常人们了解的RNA分子莫过于信使RNA（mRNA）、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)这三种经典意义上的RNA分子，它们行使中心法则规定的RNA分子的生物学功能。 现今涌现出了一大批小RNA分子，包括核小RNA分子(small nuclear RNA,snRNA)、核仁小RNA分子(small nucleolarRNA,snoRNA)、微小RNA分子(microRNA,miRNA)、和小干扰RNA分子(small interfering RNA,siRNA)等等。这些小RNA分子都包含小于500个核苷酸，尤其是miRNA和siRNA都只含有2123个核
6、苷酸。 体内小体内小RNA作用的重新认识作用的重新认识小RNA分子的大量发现和对其特殊生物学功能的认识动摇了中心法则的统治地位。RNA不光是遗传信息从DNA到蛋白质的中间媒介，RNA还可以独当一面，在细胞生命活动中起到不可替代的作用。例如，snRNA在前体mRNA的剪接成熟过程中起作用，snoRNA则能够对其他RNA分子进行加工修饰，而miRNA可以结合到目标mRNA的3端非编码区进而调节目标mRNA的翻译，siRNA则可以结合到目标mRNA上与之序列互补的区域，指导核酶将目标mRNA特异性降解掉。所有这些新的功能，颠覆了人们关于RNA的功能的传统认识。New roles for RNARNA
7、mRNAncRNANon-coding RNA. Transcribed RNA with a structural, functional or catalytic rolerRNARibosomal RNAParticipate in protein synthesistRNATransfer RNAInterface betweenmRNA & amino acidssnRNASmall nuclear RNA-Incl. RNA thatform part of the spliceosomesnoRNASmall nucleolar RNAFound in nucleolus, in
8、volved in modificationof rRNAsmall RNAOtherIncluding large RNAwith roles in chromotin structure andimprintingsiRNASmall interfering RNAActive molecules in RNA interferencemiRNAMicro RNASmall RNA involvedregulation of expression2006年年10月月2日日瑞典皇家科学院诺贝尔奖瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会委员会宣布，将宣布，将2006年度诺贝尔生理学或年度诺贝尔生理学或医学
9、奖授予两名美国科学安德鲁医学奖授予两名美国科学安德鲁法尔和法尔和克雷格克雷格梅洛，以表彰他们发现了梅洛，以表彰他们发现了RNA干干扰现象。法尔和梅洛将分享一千万瑞典克扰现象。法尔和梅洛将分享一千万瑞典克朗的奖金朗的奖金(137万美元、万美元、107万欧元万欧元)。 RNA干扰获得诺贝尔生理学或医学奖干扰获得诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔奖评审委员会发布的公报说：诺贝尔奖评审委员会发布的公报说：法尔和梅洛获奖是因为他们法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息发现了控制遗传信息流动的基本机制流动的基本机制”，这一机制为控制基因信息提供，这一机制为控制基因信息提供了基础性的依据。公报指出，干扰已被广
10、泛了基础性的依据。公报指出，干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。干扰机制科学家开发出治疗疾病的新疗法。干扰机制的发现使得科学家可以对侵入细胞的病毒进的发现使得科学家可以对侵入细胞的病毒进行控制。诺贝尔奖评审委员会指出，干扰机行控制。诺贝尔奖评审委员会指出，干扰机制将来有望应用于临床医学和农业等众多领域，用制将来有望应用于临床医学和农业等众多领域，用来开发针对病毒感染、心血管疾病和癌症等的新疗来开发针对病毒感染、心血管疾病和癌症等的新疗法。法。“我隐约觉得是有可能获奖的。但我只有我隐约觉得是有可能获奖的
11、。但我只有45岁，所以我想或许在一二十年内才会岁，所以我想或许在一二十年内才会发生。发生。”在接受路透社采访时，马萨诸在接受路透社采访时，马萨诸塞大学教授克雷格塞大学教授克雷格梅洛梅洛(CraigMello) 如是说。如是说。 斯坦福大学教授安德鲁斯坦福大学教授安德鲁法尔法尔(AndrewFire) 今年也只有今年也只有47岁。岁。 安德鲁安德鲁安德鲁安德鲁 菲尔菲尔菲尔菲尔(AndrewZ.Fire)(AndrewZ.Fire) 克雷格克雷格克雷格克雷格 梅洛梅洛梅洛梅洛(Craig C.Mello)(Craig C.Mello)RNA干扰的发现干扰的发现安德鲁安德鲁菲尔菲尔(AndrewZ
12、.Fire)、克雷格、克雷格梅梅洛洛(Craig C.Mello) 1998年发现了年发现了RNA干干扰和基因沉默现象。其论文发表在扰和基因沉默现象。其论文发表在1998年的年的NATRUE杂志上。杂志上。Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-811. 1998199
13、8年年年年2 2月发表于英国月发表于英国月发表于英国月发表于英国自然自然自然自然杂志的一篇杂志的一篇杂志的一篇杂志的一篇RNARNA干干干干扰论文。不少同行迅速意识到这篇论文的非凡价扰论文。不少同行迅速意识到这篇论文的非凡价扰论文。不少同行迅速意识到这篇论文的非凡价扰论文。不少同行迅速意识到这篇论文的非凡价值。值。值。值。通常，从研究成果发表到获得诺贝尔奖，需通常，从研究成果发表到获得诺贝尔奖，需通常，从研究成果发表到获得诺贝尔奖，需通常，从研究成果发表到获得诺贝尔奖，需要一二十年甚至更多时间，因为成果的准确性和要一二十年甚至更多时间，因为成果的准确性和要一二十年甚至更多时间，因为成果的准确性
14、和要一二十年甚至更多时间，因为成果的准确性和重要性都需要科学界的反复验证。但法尔和梅洛重要性都需要科学界的反复验证。但法尔和梅洛重要性都需要科学界的反复验证。但法尔和梅洛重要性都需要科学界的反复验证。但法尔和梅洛仅仅等待了仅仅等待了仅仅等待了仅仅等待了8 8年，其获奖速度之快实属罕见。年，其获奖速度之快实属罕见。年，其获奖速度之快实属罕见。年，其获奖速度之快实属罕见。RNA干扰的传奇故事干扰的传奇故事中心法则中心法则双链双链DNA 单链单链RNA 蛋白质蛋白质转录转录逆转录逆转录翻译翻译反义反义RNARNA干扰的传奇故事干扰的传奇故事 很早以前，就有科学家在植物中观察到了很早以前，就有科学家在
15、植物中观察到了基因基因“沉默沉默”的现象。的现象。早在早在1991年，来自于美国和荷兰的两个转年，来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组，将紫色色素基因导入矮基因植物实验组，将紫色色素基因导入矮牵牛牵牛(petunia)植物，目的是想通过增加紫植物，目的是想通过增加紫色色素基因拷贝来获得具有更多红花的矮色色素基因拷贝来获得具有更多红花的矮牵牛，结果则出乎他们的预料：有些转基牵牛，结果则出乎他们的预料：有些转基因的矮牵牛却开出部分或全部白花，表明因的矮牵牛却开出部分或全部白花，表明色素合成不是增加了而是减少。事实上，色素合成不是增加了而是减少。事实上，不但导入的基因没有表达，而且植物本身不但导入
16、的基因没有表达，而且植物本身的色素合成基因也受到某种程度的抑制，的色素合成基因也受到某种程度的抑制，这种现象当时称为共抑制这种现象当时称为共抑制(cosuppression)法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因“ “沉沉沉沉默默默默” ”的原因在于的原因在于的原因在于的原因在于RNARNA干扰。干扰。干扰。干扰。实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线
17、虫中观察到第一个在线虫中观察到第一个在线虫中观察到第一个在线虫中观察到(RNA(RNA干扰干扰干扰干扰) )这种特别现这种特别现这种特别现这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。象的是康奈尔大学研究生郭苏。象的是康奈尔大学研究生郭苏。象的是康奈尔大学研究生郭苏。19951995年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯斯斯斯(Kenneth(KennethKemphues)Kemphues)指导下，试图阻断秀指导下，试图阻断秀指导下，试图阻断秀指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因时，意外地
18、发现反义丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义和正义这两种单链和正义这两种单链和正义这两种单链和正义这两种单链RNARNA都阻断了该基因的表达。都阻断了该基因的表达。都阻断了该基因的表达。都阻断了该基因的表达。但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到象。直到象。直到象。直到3 3年后，当时在卡内基研究所供职的法尔和年后，当时在卡内基研究所供职的法尔和年后，当时在卡内基研究
19、所供职的法尔和年后，当时在卡内基研究所供职的法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得得得得RNARNA污染了微量的双链污染了微量的双链污染了微量的双链污染了微量的双链RNARNA，而经过纯化的双链，而经过纯化的双链，而经过纯化的双链，而经过纯化的双链RNARNA能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是RNARNA干扰。干扰。干扰。干扰。郭苏目
20、前在旧金山加州大学任职。她说：郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说：郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说：郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说：“ “他他他他们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞跃的现象，是一个飞跃的现象，是一个飞跃的现象，是一个飞跃我和坎菲斯通过话，我们我和坎菲斯通过话，我们我和坎菲斯通过话，我们我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，的工作在这个奖项中有
21、所贡献，我们为此感到自豪，的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁也都认为安德鲁也都认为安德鲁也都认为安德鲁 法尔和克雷格理应获奖。法尔和克雷格理应获奖。法尔和克雷格理应获奖。法尔和克雷格理应获奖。” ”在实验时，要认真观察每个现象，在实验时，要认真观察每个现象，发现怀疑并给予证明，不要被误导。发现怀疑并给予证明，不要被误导。法尔和梅洛等人的研究发表以后，激法尔和梅洛等人的研究发表以后，激发了全球研究人员对发了全球研究人员对RNA干扰领域的兴干扰领域的兴趣。趣。2001年和年和2002年，美国年，美国科学科学杂志连杂志连续将续将RNA干扰列入年度十大科学进展干扰列入年度十大
22、科学进展 。RNA干扰的基本原理干扰的基本原理RAN干扰的发现实验干扰的发现实验RNA干扰的细胞生物学途径干扰的细胞生物学途径RNAi的发现的发现1995199519951995年年年年，Guo Guo Guo Guo S S S S等等等等试试试试图图图图阻阻阻阻断断断断秀秀秀秀丽丽丽丽新新新新小小小小杆杆杆杆线线线线虫虫虫虫（C. C. C. C. eleganseleganseleganselegans）中的）中的）中的）中的par-1par-1par-1par-1基因的表达。基因的表达。基因的表达。基因的表达。设计：设计：设计：设计： 反义反义反义反义RNA RNA RNA RNA 特
23、异性地阻断特异性地阻断特异性地阻断特异性地阻断par-1par-1par-1par-1基因的表达；基因的表达；基因的表达；基因的表达； 正义正义正义正义RNA RNA RNA RNA 以期观察到基因表达的增强。以期观察到基因表达的增强。以期观察到基因表达的增强。以期观察到基因表达的增强。结果结果结果结果: : : : 二二二二者者者者都都都都同同同同样样样样地地地地切切切切断断断断了了了了par-1par-1par-1par-1基基基基因因因因的的的的表表表表达达达达途途途途径径径径。这这这这是是是是与与与与传传传传统统统统上上上上对对对对反反反反义义义义RNARNARNARNA技技技技术术术
24、术的的的的解解解解释释释释不不不不相相相相符符符符合合合合。该该该该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。研究小组一直没能给这个意外以合理解释。研究小组一直没能给这个意外以合理解释。研究小组一直没能给这个意外以合理解释。 RNAi的提出的提出直直直直到到到到1998199819981998年年年年2 2 2 2月月月月，Fire Fire Fire Fire A A A A和和和和Mello Mello Mello Mello C C C C才才才才首首首首次次次次揭揭揭揭开开开开这这这这个个个个悬悬悬悬疑疑疑疑之谜。之谜。之谜。之谜。他他他他们们们们将将将将体体体体外外外外转转转转录录录录得
25、得得得到到到到的的的的单单单单链链链链RNARNARNARNA纯纯纯纯化化化化后后后后注注注注射射射射线线线线虫虫虫虫时时时时发发发发现现现现，基基基基因因因因抑抑抑抑制制制制效效效效应应应应变变变变得得得得十十十十分分分分微微微微弱弱弱弱；而而而而经经经经过过过过纯纯纯纯化化化化的的的的双双双双链链链链RNARNARNARNA却却却却正正正正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他他他他们们们们证证证证实实实实，Guo Guo Guo Guo S S S S博博博
26、博士士士士遇遇遇遇到到到到的的的的正正正正义义义义RNARNARNARNA抑抑抑抑制制制制基基基基因因因因表表表表达达达达的的的的现现现现象象象象，以以以以及及及及过过过过去去去去的的的的反反反反义义义义RNARNARNARNA技技技技术术术术对对对对基基基基因因因因表表表表达达达达的的的的阻阻阻阻断断断断，都都都都是是是是由由由由于体外转录所得于体外转录所得于体外转录所得于体外转录所得RNARNARNARNA中中中中污染了微量双链污染了微量双链污染了微量双链污染了微量双链RNARNARNARNA而引起。而引起。而引起。而引起。该该该该小小小小组组组组将将将将这这这这一一一一现现现现象象象象称
27、称称称为为为为RNARNARNARNA干干干干扰扰扰扰（RNA RNA RNA RNA interferenceinterferenceinterferenceinterference， 简称简称简称简称RNAiRNAiRNAiRNAi）。）。）。）。 Double-stranded RNAinjectC. eleganscontrol: not stainedcontrol: not stainedwt + antisense RNAwt + antisense RNAsenseantisenseNature 1998 391:806-811Mex-3 mRNA detection in e
28、mbryos by in situ hybridizationwtwtwt + ds RNAwt + ds RNARAN干扰的发现实验干扰的发现实验RNAiRNAi广泛存在于自然界广泛存在于自然界随后，随后，随后，随后，RNAiRNAiRNAiRNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了这种存在揭示了这种存在揭示了这
29、种存在揭示了RNAiRNAiRNAiRNAi很可能是出现于生命进化的很可能是出现于生命进化的很可能是出现于生命进化的很可能是出现于生命进化的早期阶段。早期阶段。早期阶段。早期阶段。随着研究的不断深入，随着研究的不断深入，随着研究的不断深入，随着研究的不断深入，RNAiRNAiRNAiRNAi的机制正在被逐步阐的机制正在被逐步阐的机制正在被逐步阐的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，具，具，具，RNAiRNAiRNAiRNAi也越来越为人们所重视
30、。也越来越为人们所重视。也越来越为人们所重视。也越来越为人们所重视。 DicerDicer： A specific A specific RNAase III enzymeRNAase III enzyme RISC*RISC*：active active forms of RISCforms of RISC complexcomplex RISC RISC （RNA-induced RNA-induced silencing complexsilencing complex）RNA干扰的干扰的细胞生物学细胞生物学途径途径siRNAModel for RNAiDicer contains tw
31、o RNAse III domainssiRNAslong dsRNAGuide RNAsGuide RNAs Small 22 nucleotide RNAs associate with RISCSmall 22 nucleotide RNAs associate with RISC19 nt duplex2 nt 3 overhangssiRNAs have a defined structureRNAi silencing complex may be associated with translating ribosomes active RNAse enzyme not yet i
32、dentifiedRISC ( (R RNA-NA-i induced nduced s silencing ilencing c complex)omplex) Effector Nuclease Effector Nuclease - RISC contains siRNA- precurser activated by ATP- find and destroy mRNA of complementary sequence- contains endo- and exonuclease, cleaves the hybrid in the middle imm. followed by
33、degradation- ARO: PAZ domainRISC nuclease complexLatent RISCLatent RISC Precursor RISC 250KPrecursor RISC 250Kassociate with ds siRNAs associate with ds siRNAs +ATP+ATPActive RISCActive RISC Active RISC 100KActive RISC 100K (siRNA unwinding) (siRNA unwinding)associate with ss siRNAsassociate with ss
34、 siRNAs destroys target mRNAs destroys target mRNAsHannon ReviewRISC nuclease complex外源或内源产生的外源或内源产生的dsRNA进入细胞后，在核酸酶进入细胞后，在核酸酶(Dicer)作用下被切割成作用下被切割成3 端有端有2个碱基突出的个碱基突出的2123 nt长度的小分子干扰长度的小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；这些这些siRNA与与RNAi特异性酶结合，形成特异性酶结合，形成RNA诱导诱导沉默复合体沉默复合体(RNAinduced silencing compl
35、ex，RISC)；而后；而后RISC在在siRNA反义链的指导下与反义链的指导下与siRNA 同源靶同源靶RNA相结合，并在近中点位置将其相结合，并在近中点位置将其切割，达到抑制靶基因表达的作用切割，达到抑制靶基因表达的作用RNAi是指将外源双链是指将外源双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)导人细胞后引起导人细胞后引起与其序列同源的特异基因与其序列同源的特异基因mRNA 降解的降解的现象，属于转录后基因沉默现象，属于转录后基因沉默 (posttranscriptional gene silencing，PTGS)的的一种形式。一种形式。Amplification of
36、 signal:Amplification of signal:n nsiRNA may work as primers on the mRNAsiRNA may work as primers on the mRNAAmplification by RNA dependent RNA polymeraseAmplification by RNA dependent RNA polymeraseMechanism of RNAi: Gene Silencing directed by 22nt RNAsRNA 干扰的应用干扰的应用基因功能研究基因功能研究基因治疗基因治疗Practical as
37、pects of RNAi biological researchn ndefining gene function (gene knockdown) n ndefining biochemical pathwaysmicroarray screening of RNAi knockdowns therapeutic treatmentn ncancern nviral infectionn nparasitic infectionRNA干扰技术应用于哺乳动物细胞的研究策略在哺乳动物细胞中，长在哺乳动物细胞中，长dsRNAdsRNA( (通常大于通常大于30 30 bpbp) )导入后，会启导
38、入后，会启动细胞内的病毒防御机制，细胞内干扰素产生加大，动细胞内的病毒防御机制，细胞内干扰素产生加大，RNARNA依赖依赖的蛋白激酶被激活，使翻译起始因子的蛋白激酶被激活，使翻译起始因子elF2aelF2a磷酸化，致使细胞磷酸化，致使细胞内全部蛋白合成的关闭；同时内全部蛋白合成的关闭；同时RNARNA酶酶L(RNaseL(RNase L) L)被激活，产生被激活，产生非特异性非特异性mRNAmRNA的降解，最终诱导细胞凋亡。的降解，最终诱导细胞凋亡。上述因素在一段时间内限制了上述因素在一段时间内限制了RNAiRNAi在哺乳动物细胞中的应用。在哺乳动物细胞中的应用。20012001年年Elbas
39、hirElbashir等首次采用体外合成的等首次采用体外合成的21 21 ntnt siRNAsiRNA导入到人导入到人胚肾细胞和人宫颈癌细胞胚肾细胞和人宫颈癌细胞( (HeLaHeLa) )，观测到，观测到RNAiRNAi现象的发生。现象的发生。此后此后RNAiRNAi技术在哺乳动物细胞中的探索与应用逐渐成为研究技术在哺乳动物细胞中的探索与应用逐渐成为研究热点。热点。RNA干扰技术应用于哺乳动物干扰技术应用于哺乳动物细胞的研究策略细胞的研究策略在哺乳动物细胞中开展在哺乳动物细胞中开展RNAi实验大致实验大致包括以下包括以下5个步骤：个步骤：选取目的基因；选取目的基因；设计相应的设计相应的si
40、RNA序列；序列；制备制备siRNA；siRNA转染哺乳动物细胞；转染哺乳动物细胞；RNAi效果分析。效果分析。RNAi研究的一般技术路线研究的一般技术路线从理论上讲，既然从理论上讲，既然从理论上讲，既然从理论上讲，既然RNARNA干扰可以使特定的基因干扰可以使特定的基因干扰可以使特定的基因干扰可以使特定的基因“ “沉默沉默沉默沉默” ”，就有可能为癌症和艾滋病等顽疾的防治带来革命性的变，就有可能为癌症和艾滋病等顽疾的防治带来革命性的变，就有可能为癌症和艾滋病等顽疾的防治带来革命性的变，就有可能为癌症和艾滋病等顽疾的防治带来革命性的变化。化。化。化。20032003年，哈佛大学利伯曼年，哈佛大
41、学利伯曼年，哈佛大学利伯曼年，哈佛大学利伯曼(Judy(JudyLieberman)Lieberman)副教授与中副教授与中副教授与中副教授与中山大学附属第二医院宋尔卫博士等人在山大学附属第二医院宋尔卫博士等人在山大学附属第二医院宋尔卫博士等人在山大学附属第二医院宋尔卫博士等人在自然医学自然医学自然医学自然医学杂志杂志杂志杂志发表论文，介绍发表论文，介绍发表论文，介绍发表论文，介绍RNARNA干扰对小鼠急性肝炎的防护作用，干扰对小鼠急性肝炎的防护作用，干扰对小鼠急性肝炎的防护作用，干扰对小鼠急性肝炎的防护作用，被麻省理工学院教授、诺贝尔奖得主夏普被麻省理工学院教授、诺贝尔奖得主夏普被麻省理工学
42、院教授、诺贝尔奖得主夏普被麻省理工学院教授、诺贝尔奖得主夏普(Philip(PhilipSharp)Sharp)称为称为称为称为“ “首次在整体动物疾病模型中显示首次在整体动物疾病模型中显示首次在整体动物疾病模型中显示首次在整体动物疾病模型中显示RNARNA干扰的治疗干扰的治疗干扰的治疗干扰的治疗作用作用作用作用” ”。 在实验中，未接受在实验中，未接受在实验中，未接受在实验中，未接受RNARNA干扰治疗得实验鼠干扰治疗得实验鼠干扰治疗得实验鼠干扰治疗得实验鼠4040在在在在3 3天内死天内死天内死天内死亡。亡。亡。亡。4040只接受过治疗得实验鼠有只接受过治疗得实验鼠有只接受过治疗得实验鼠有
43、只接受过治疗得实验鼠有3333只活了下来，只活了下来，只活了下来，只活了下来，1010天后研天后研天后研天后研究人员检查实验鼠得肝部，发现完全正常。究人员检查实验鼠得肝部，发现完全正常。究人员检查实验鼠得肝部，发现完全正常。究人员检查实验鼠得肝部，发现完全正常。在基因治疗中的应用在基因治疗中的应用 科学家们已经应用科学家们已经应用科学家们已经应用科学家们已经应用RNARNA干扰技术，在多种不同的干扰技术，在多种不同的干扰技术，在多种不同的干扰技术，在多种不同的动物疾病模型中获得了良好疗效。此外，动物疾病模型中获得了良好疗效。此外，动物疾病模型中获得了良好疗效。此外，动物疾病模型中获得了良好疗效
44、。此外，“ “6 6种基种基种基种基于该技术的药物已经在美国进入于该技术的药物已经在美国进入于该技术的药物已经在美国进入于该技术的药物已经在美国进入IIII期临床试验，这期临床试验，这期临床试验，这期临床试验，这个速度相当快个速度相当快个速度相当快个速度相当快” ”。如今这项技术不但在科学研究领域得到广泛应用，如今这项技术不但在科学研究领域得到广泛应用，如今这项技术不但在科学研究领域得到广泛应用，如今这项技术不但在科学研究领域得到广泛应用，可以说可以说可以说可以说“ “全世界的生物研究所，凡是与基因有关的全世界的生物研究所，凡是与基因有关的全世界的生物研究所，凡是与基因有关的全世界的生物研究所
45、，凡是与基因有关的都在使用这项技术都在使用这项技术都在使用这项技术都在使用这项技术” ”，而且在制药业和农业等领域，而且在制药业和农业等领域，而且在制药业和农业等领域，而且在制药业和农业等领域也很受关注。也很受关注。也很受关注。也很受关注。 治疗治疗HIV 感染感染由由由由于于于于RNAiRNAiRNAiRNAi是是是是机机机机体体体体中中中中古古古古老老老老而而而而天天天天然然然然的的的的抗抗抗抗病病病病毒毒毒毒机机机机制制制制，HIVHIVHIVHIV病病病病毒毒毒毒感感感感染染染染是是是是我我我我们们们们亟亟亟亟待待待待解解解解决决决决的的的的问问问问题题题题，将将将将RNAiRNAiR
46、NAiRNAi技技技技术术术术应应应应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。用于艾滋病治疗是顺理成章之事。用于艾滋病治疗是顺理成章之事。用于艾滋病治疗是顺理成章之事。针针针针对对对对HIVHIVHIVHIV病病病病毒毒毒毒研研研研究究究究有有有有JacqueJacqueJacqueJacque等等等等设设设设计计计计的的的的抑抑抑抑制制制制HIV HIV HIV HIV 1 1 1 1长长长长末末末末端端端端重重重重复复复复序序序序列列列列、附附附附件件件件基基基基因因因因vifvifvifvif和和和和nefnefnefnef表表表表达达达达的的的的siRNAsiRNAsiRNAsiRNA，LeeL
47、eeLeeLee等等等等针针针针对对对对revrevrevrev转转转转录录录录子子子子设设设设计计计计的的的的siRNAsiRNAsiRNAsiRNA及及及及NovinaNovinaNovinaNovina等等等等针针针针对对对对HIVHIVHIVHIV病病病病毒毒毒毒gaggaggaggag基基基基因因因因设设设设计计计计的的的的siRNAsiRNAsiRNAsiRNA，其其其其基基基基本本本本策策策策略略略略都都都都是是是是选选选选择择择择HIVHIVHIVHIV病毒基因为靶点。病毒基因为靶点。病毒基因为靶点。病毒基因为靶点。治疗治疗HIV 感染感染然然然然而而而而，RNAiRNAiRN
48、AiRNAi治治治治疗疗疗疗HIVHIVHIVHIV，应应应应用用用用于于于于临临临临床床床床，有有有有几几几几个个个个重重重重要要要要问问问问题题题题必必必必须解决：须解决：须解决：须解决：、作作作作用用用用靶靶靶靶点点点点的的的的选选选选择择择择，siRNAsiRNAsiRNAsiRNA对对对对序序序序列列列列要要要要求求求求非非非非常常常常严严严严格格格格，1 1 1 1个个个个碱碱碱碱基基基基的的的的错错错错配配配配，将将将将大大大大大大大大降降降降低低低低siRNAsiRNAsiRNAsiRNA基基基基因因因因表表表表达达达达抑抑抑抑制制制制作作作作用用用用。如如如如果果果果HIVH
49、IVHIVHIV逆逆逆逆转转转转录录录录酶酶酶酶有有有有较较较较高高高高的的的的错错错错配配配配率率率率(1/1000(1/1000(1/1000(1/1000个个个个核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸每每每每个个个个复复复复制制制制循循循循环环环环) ) ) )，就就就就可可可可能能能能迅迅迅迅速速速速导导导导致致致致所所所所谓谓谓谓siRNAsiRNAsiRNAsiRNA逃逃逃逃逸逸逸逸突突突突变变变变的的的的出出出出现现现现。感感感感染染染染个个个个体体体体中中中中HIVHIVHIVHIV序序序序列列列列的的的的多多多多样样样样性性性性，为为为为siRNAsiRNAsiRNAsiRNA的的的的设设
50、设设计计计计和和和和合成增加了难度。合成增加了难度。合成增加了难度。合成增加了难度。、如如如如何何何何有有有有效效效效导导导导入入入入siRNAsiRNAsiRNAsiRNA. . . . DNADNADNADNA质质质质粒粒粒粒、逆逆逆逆转转转转录录录录病病病病毒毒毒毒载载载载体体体体、腺腺腺腺病病病病毒毒毒毒载载载载体体体体和和和和脂脂脂脂质质质质体体体体等等等等在在在在培培培培养养养养细细细细胞胞胞胞株株株株中中中中有有有有良良良良好好好好的的的的导导导导入入入入效果，但在原代细胞中效果较差。效果，但在原代细胞中效果较差。效果，但在原代细胞中效果较差。效果，但在原代细胞中效果较差。、增增
51、增增强强强强siRNAsiRNAsiRNAsiRNA在在在在细细细细胞胞胞胞中中中中的的的的稳稳稳稳定定定定性性性性. . . .为为为为了了了了防防防防止止止止细细细细胞胞胞胞内内内内RNARNARNARNA酶酶酶酶对对对对siRNAsiRNAsiRNAsiRNA的的的的降降降降解解解解，可可可可以以以以用用用用DNADNADNADNA质质质质粒粒粒粒和和和和病病病病毒毒毒毒载载载载体体体体将将将将siRNAsiRNAsiRNAsiRNA以以以以发夹发夹发夹发夹(hairpins)(hairpins)(hairpins)(hairpins)的形式导入细胞内。的形式导入细胞内。的形式导入细胞内
52、。的形式导入细胞内。 治疗肝炎病毒感染治疗肝炎病毒感染Jude LiebermanJude LiebermanJude LiebermanJude Lieberman等已经成功地利用等已经成功地利用等已经成功地利用等已经成功地利用 RNAiRNAiRNAiRNAi技术治愈了实验技术治愈了实验技术治愈了实验技术治愈了实验鼠的肝炎。鼠的肝炎。鼠的肝炎。鼠的肝炎。他他他他们们们们干干干干扰扰扰扰的的的的目目目目标标标标是是是是“凋凋凋凋亡亡亡亡相相相相关关关关蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质（FAsFAsFAsFAs）基基基基因因因因”。FAsFAsFAsFAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。存在
53、于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了中毒激活了中毒激活了中毒激活了FAsFAsFAsFAs基因所导致的。基因所导致的。基因所导致的。基因所导致的。Jude LiebermanJude LiebermanJude LiebermanJude Lieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在等给实验鼠尾部血管注
54、入旨在等给实验鼠尾部血管注入旨在等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默沉默沉默沉默” FAsFAsFAsFAs基因的基因的基因的基因的siRNAsiRNAsiRNAsiRNA，发现有，发现有，发现有，发现有90909090的肝细胞接收到了这种的肝细胞接收到了这种的肝细胞接收到了这种的肝细胞接收到了这种RNARNARNARNA分子，分子，分子，分子，FAsFAsFAsFAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受接受接受接受RNAiRNAiRNAiRNAi治疗的实验鼠有治疗的实验
55、鼠有治疗的实验鼠有治疗的实验鼠有40404040在天内死亡。而在天内死亡。而在天内死亡。而在天内死亡。而40404040只接受只接受只接受只接受过治疗的实验鼠有过治疗的实验鼠有过治疗的实验鼠有过治疗的实验鼠有33333333只活了下来，只活了下来，只活了下来，只活了下来，10101010天后研究人员检查这天后研究人员检查这天后研究人员检查这天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。些实验鼠的肝部，发现完全正常。些实验鼠的肝部，发现完全正常。些实验鼠的肝部，发现完全正常。 治疗肝炎病毒感染治疗肝炎病毒感染McCaffreMcCaffreMcCaffreMcCaffre A A A A及及及
56、及其其其其导导导导师师师师Kay Kay Kay Kay M M M M结结结结果果果果则则则则证证证证明明明明RNAiRNAiRNAiRNAi可可可可以以以以直直直直接接接接治治治治疗肝炎病毒。疗肝炎病毒。疗肝炎病毒。疗肝炎病毒。他他他他们们们们首首首首先先先先将将将将HBVHBVHBVHBV的的的的基基基基因因因因组组组组插插插插入入入入到到到到小小小小鼠鼠鼠鼠肝肝肝肝脏脏脏脏细细细细胞胞胞胞中中中中，模模模模拟拟拟拟HBVHBVHBVHBV感感感感染染染染，然然然然后后后后合合合合成成成成靶靶靶靶向向向向HBVHBVHBVHBV基基基基因因因因组组组组不不不不同同同同部部部部分分分分的的
57、的的2 2 2 2种种种种siRNAsiRNAsiRNAsiRNA并并并并分分分分别别别别与与与与表表表表达达达达载载载载体体体体连连连连接接接接后后后后导导导导入入入入感感感感染染染染小小小小鼠鼠鼠鼠。结结结结果果果果发发发发现现现现治治治治疗疗疗疗组组组组小小小小鼠鼠鼠鼠体体体体内内内内肝肝肝肝炎炎炎炎病病病病毒毒毒毒RNARNARNARNA的的的的数数数数量量量量与与与与对对对对照照照照组组组组相相相相比比比比减减减减少了少了少了少了92%92%92%92%。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。但
58、但但但KayKayKayKay指指指指出出出出，这这这这种种种种运运运运送送送送siRNAsiRNAsiRNAsiRNA方方方方法法法法不不不不能能能能用用用用于于于于人人人人类类类类。他他他他们们们们正在实验更温和的途径将正在实验更温和的途径将正在实验更温和的途径将正在实验更温和的途径将siRNAsiRNAsiRNAsiRNA运送到细胞中。运送到细胞中。运送到细胞中。运送到细胞中。对对对对于于于于人人人人来来来来说说说说，身身身身体体体体比比比比老老老老鼠鼠鼠鼠大大大大得得得得多多多多，血血血血液液液液循循循循环环环环系系系系统统统统也也也也庞庞庞庞大。大。大。大。如如如如果果果果解解解解决
59、决决决了了了了将将将将siRNAsiRNAsiRNAsiRNA有有有有效效效效而而而而又又又又充充充充足足足足地地地地运运运运送送送送到到到到细细细细胞胞胞胞的的的的问问问问题题题题，将为许多疾病和感染提供新疗法。将为许多疾病和感染提供新疗法。将为许多疾病和感染提供新疗法。将为许多疾病和感染提供新疗法。 治疗肿瘤治疗肿瘤 多种癌基因可以作为靶点设计相对应的多种癌基因可以作为靶点设计相对应的多种癌基因可以作为靶点设计相对应的多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNAsiRNAsiRNAsiRNA 。 BrummelkampBrummelkampBrummelkampBrummelkamp 等等
60、等等用用用用逆逆逆逆转转转转录录录录病病病病毒毒毒毒载载载载体体体体将将将将siRNAsiRNAsiRNAsiRNA导导导导入入入入肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞中中中中, , , ,特异性抑制了癌基因特异性抑制了癌基因特异性抑制了癌基因特异性抑制了癌基因k k k k rasrasrasras (v12) (v12) (v12) (v12)的表达。的表达。的表达。的表达。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。ScherScherScherScher 等等
61、等等以以以以引引引引起起起起慢慢慢慢性性性性髓髓髓髓性性性性白白白白血血血血病病病病和和和和bcrbcrbcrbcr ab1ab1ab1ab1阳阳阳阳性性性性急急急急性性性性淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞白白白白血血血血病病病病的的的的bcrbcrbcrbcr ab1ab1ab1ab1癌癌癌癌基基基基因因因因为为为为靶靶靶靶基基基基因因因因, , , ,设设设设计计计计了了了了对对对对应应应应的的的的siRNAsiRNAsiRNAsiRNA, , , ,并获得了并获得了并获得了并获得了87%87%87%87%的有效抑制率。的有效抑制率。的有效抑制率。的有效抑制率。WildaWildaWild
62、aWilda等等等等用用用用siRNAsiRNAsiRNAsiRNA抑抑抑抑制制制制白白白白血血血血病病病病bcr/ablbcr/ablbcr/ablbcr/abl融融融融合合合合基基基基因因因因表表表表达达达达也也也也取取取取得得得得了了了了成成成成功功功功。 因因因因此此此此基基基基于于于于 RNAiRNAiRNAiRNAi技技技技术术术术的的的的抗抗抗抗肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤治治治治疗疗疗疗药药药药物物物物开开开开发发发发潜潜潜潜力力力力巨大。巨大。巨大。巨大。 首先，科学家还没有找到一种方便快捷的方法，使RNA干扰能在患者体内的有效部位进行，怎么将RNA干扰药物运送到特定的细胞群体，比如肿瘤
63、细胞，就是一大障碍。比如说，在治疗黄斑变性时，科学家可以直接对患者眼部进行治疗，而对于其他一些疾病就没有这么简单。其次，科学家还无法确定这种疗法是否会影响目标基因以外的其他基因，引发副作用。技术障碍技术障碍The plot thickens The Discovery of Endogenous Effectors for RNAin nDiscovery of the first naturally occurring small RNA specie , Discovery of the first naturally occurring small RNA specie , lin-4l
64、in-4Non-coding, 22nt RNANon-coding, 22nt RNAn nImportant for larval developmentImportant for larval developmentn nlin-4lin-4 partially complementary to conserved sites in partially complementary to conserved sites in lin-14lin-14 3UTR Lee 3UTR Lee et al.,et al., 1993 1993lin-4 lin-4 binds these site
65、sbinds these siteslin-4 lin-4 negatively regulatesnegatively regulates lin-14 lin-14 translationtranslationn nThe naturally occurring small RNA designated microRNAs (miRNAs)The naturally occurring small RNA designated microRNAs (miRNAs)n nNo other miRNAs found for 7 years!No other miRNAs found for 7
66、 years!n nSecond miRNA Second miRNA let-7 let-7 Reinhart Reinhart et al.,et al., 2000 2000Non coding, 21nt RNANon coding, 21nt RNARegulates Regulates lin-14lin-14 in same way as lin-4 in same way as lin-4Pathway of siRNAs and miRNAs Endogenous vs exogenous在当前研究中，miRNA可以说是热点中的热点。miRNA广泛存在于真核生物中,本身不具有
67、开放阅读框架(ORF)，多数miRNA 具有高度保守性，miRNA 基因不是随机排列的, 其中有一些是成簇的(cluster)，而且簇生排列的基因常常协同表达，大多数已发现的miRNA 的表达都具有时序性。这就意味着miRNA可能参与空间发育、应激性、细胞周期和基因重组等过程。就在2005年，细胞杂志上发表文章，美国怀特黑德生物医学研究所和马萨诸塞理工学院的科学家发现，人类基因组中大约有三分之一负责蛋白质合成的基因是由miRNA控制的。这一新发现表明，在细胞机制中所起的作用远超出先前的认识。除此之外，科学家在自然杂志上撰文指出，目前已有的研究结果表明，miRNA参与控制果蝇的细胞死亡与增殖、哺
68、乳动物的造血作用、线虫的神经网络分布、以及植物的叶和花的发育。现在，一个新的小RNA在胰岛瘤细胞中被发现：miR-375是胰岛特有的，其过度表达抑制由葡萄糖诱导的胰岛素分泌。miR-375以及其他组织特定的小RNA可能是糖尿病药物治疗的候选目标。有关miRNA的研究不但对于我们理解细胞活动中复杂而有序的细节从而探索生命的本质有极大帮助，而且会给医疗的发展提供新的思路和方向。可见，关于miRNA的研究将是生命科学研究的前沿和热点.These riboregulators have two traits ideally suited for gene relulation: 1. Being so
69、 small, they can be rapidly transcribed 1. Being so small, they can be rapidly transcribed from their genes. from their genes. 2. They do not need to be translated into a protein 2. They do not need to be translated into a protein product to act (in contrast, e.g., to transcription product to act (i
70、n contrast, e.g., to transcription factors).factors).New Frontiers for RNASmall RNAs likely to have bigger impact on gene Small RNAs likely to have bigger impact on gene and protein regulationand protein regulationNew classes of small RNAs:New classes of small RNAs:n nPiRNAPiRNASmall single-strand R
71、NA 26-31ntSmall single-strand RNA 26-31ntDiscovered in aDiscovered in a wide range of eukaryotic organismswide range of eukaryotic organismsInteract with Piwi family proteinsInteract with Piwi family proteinsRegulate gene silencing, eg. controlling the Regulate gene silencing, eg. controlling the transcription transcription and translation of transposons and retrotransposons of and translation of transposons and retrotransposons of genomegenome
