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1、Test: 1.三种限制性内切酶的特征三种限制性内切酶的特征2.DNA片段电泳的片段电泳的原理原理和和电泳的用途电泳的用途3.突变的突变的类型类型和和效应效应第七章第七章DNA的重组的重组一、概述一、概述二、同源重组二、同源重组三、位点专一性重组三、位点专一性重组四、转座重组四、转座重组 内容内容一、概述一、概述1.定义：定义：DNA重组重组是指由于不同是指由于不同DNA链的断裂和连接链的断裂和连接而产生的而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。分子的过程。2.意义：意义：a)重组是遗传变异的主要来源重组是遗传变异的主要来源b)提提供供了了把
2、把不不利利突突变变和和有有利利突突变变分分开开的的途途径径，使使有有利基因得以传播，不利基因得以消除或减少。利基因得以传播，不利基因得以消除或减少。因此，重组是生物进化和适应的基础。因此，重组是生物进化和适应的基础。3. 类型：类型：a)同源重组同源重组 (homologous recombination)b)位点专一性重组位点专一性重组 (Site-specific recombination)c)转座重组转座重组 (transposition)一、概述一、概述二、同源重组二、同源重组1.定义：两个定义：两个DNA分子分子同源区段同源区段间的相互交换。主要发生在真核间的相互交换。主要发生在真
3、核生物的减数分裂，也可能发生在有丝分裂。在原核生物和病毒中生物的减数分裂，也可能发生在有丝分裂。在原核生物和病毒中也广泛存在。也广泛存在。2.同源重组的发生依赖于大范围的同源重组的发生依赖于大范围的DNA同源序列的同源序列的联会联会，在重组，在重组过程中，两条染色体或过程中，两条染色体或DNA分子分子相互交换对等的部分相互交换对等的部分。3.重组频率：重组频率：a)染色体的不同部位重组频率不同，如近端粒区域远高于近染色体的不同部位重组频率不同，如近端粒区域远高于近着丝粒区域。着丝粒区域。b)不同类型细胞的重组率也不同，如女性两倍高于男性。不同类型细胞的重组率也不同，如女性两倍高于男性。4.功能
4、：功能： a）增加生物的遗传多样性；）增加生物的遗传多样性；b）有利于减数分裂中染色）有利于减数分裂中染色体的正确分离；体的正确分离；c）DNA损伤修复。损伤修复。5. 同源重组的发生过程与染色体减数分裂的对应关系同源重组的发生过程与染色体减数分裂的对应关系细线期细线期偶线期偶线期发生断裂发生断裂每每条条染染色色体体复复制制结结束束，分分别别包包含含两个染色单体两个染色单体。核膜核膜联会联会二、同源重组二、同源重组两条单链交换两条单链交换粗线期粗线期双线期双线期终变期终变期交交换换的的单单链链区区域域延伸延伸分离分离联会复合体联会复合体交叉交叉6.同源重组的分子机制同源重组的分子机制Holli
5、day 模型美国科学家模型美国科学家Robin Holliday 在在1964年提出。年提出。二、同源重组二、同源重组联会的染色单体在联会的染色单体在特定位点被酶切，两条特定位点被酶切，两条游离的游离的3末端交叉移动末端交叉移动到对方的断头到对方的断头5端，交端，交叉连接，分支迁移，在叉连接，分支迁移，在交叉点形成的四分支结交叉点形成的四分支结构称为构称为Holliday中间体，中间体，交叉点也叫交叉点也叫Holliday交交叉点叉点。存在问题：参与重组的两个参与重组的两个DNA双链被等同看待，既是双链被等同看待，既是“入侵者入侵者”，又是，又是“入侵者入侵者”作用的对象？作用的对象？2个个D
6、NA分子的同源序列是怎样配对，又是如何形成的？分子的同源序列是怎样配对，又是如何形成的？a. 在两个染色体的一条在两个染色体的一条链上各产生一个缺口链上各产生一个缺口b. 链的侵入和链的侵入和5-3交叉连接交叉连接c. 分支迁移分支迁移交叉点1) 单链断裂模式单链断裂模式过程过程：d. 第二缺口的产生和双链分离第二缺口的产生和双链分离1) 第二缺口产生在同一条链上第二缺口产生在同一条链上2) 第二缺口产生在其它链上第二缺口产生在其它链上异源双链区异源双链区互换重组体互换重组体2) 双链断裂模式双链断裂模式Chi occurs in every 4 kbRecBCD蛋白是一种有效降解蛋白是一种有
7、效降解DNA的核酸酶，亦称为核酸的核酸酶，亦称为核酸外切酶外切酶V。过程：过程：a. RecBCD的解螺旋酶活性打的解螺旋酶活性打开开DNA双链，外切酶活性在双链，外切酶活性在两条单链末端进行酶切。两条单链末端进行酶切。b. 在在 chi 位点位点(GCTGGTGG)，RecBCD的的3 5外切酶外切酶活性减弱，活性减弱，5 3 外切酶活性外切酶活性增强，结果形成增强，结果形成3单链末端单链末端。c. RecA蛋白结合到单链蛋白结合到单链DNA上形成上形成RecA-ssDNA细丝。细丝。RecA-ssDNA细丝细丝RecA蛋白：蛋白：由由recA基因编码的一种蛋白产物，基因编码的一种蛋白产物，
8、是一种蛋白酶，参与大肠杆菌中的同源重组。是一种蛋白酶，参与大肠杆菌中的同源重组。RecA结合到单链结合到单链DNA后能增加同源重组发生后能增加同源重组发生的概率的概率。d. 链的侵入链的侵入/交换交换单链侵入另一对单链侵入另一对DNA双链，形成双链，形成D-环。环。双链断裂模式双链断裂模式7. 双链断裂模型和单链断裂模型的区别双链断裂模型和单链断裂模型的区别 在双链断裂模型中形成双交叉点结构。在双链断裂模型中形成双交叉点结构。 在双链断裂模型中，缺口区域的每一端都形成异源双链在双链断裂模型中，缺口区域的每一端都形成异源双链区。在异源双链区之间的部分区。在异源双链区之间的部分，只含有供体只含有供
9、体DNA序列序列。在单链交换模型中，从交换起始点到交叉接点间都是异在单链交换模型中，从交换起始点到交叉接点间都是异源双链源双链DNA。 在双链断裂模型中，从断裂一开始就发生遗传信息的丧在双链断裂模型中，从断裂一开始就发生遗传信息的丧失。但是利用另一同源链进行修复合成的能力为细胞提失。但是利用另一同源链进行修复合成的能力为细胞提供了一道恢复失去遗传信息的安全保障。供了一道恢复失去遗传信息的安全保障。同源重组需要的条件同源重组需要的条件？三、位点专一性重组三、位点专一性重组位位点点专专一一性性重重组组指指在在能能识识别别特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列的的重重组组酶酶作作用下，非同源用下，非同源D
10、NA的特异片段之间的重组。的特异片段之间的重组。重重组组分分子子间间不不一一定定要要求求碱碱基基配配对对，即即使使配配对对也也只只是是少少数数几几个碱基间形成异源双链体。个碱基间形成异源双链体。这这种种重重组组最最初初是是从从 噬噬菌菌体体基基因因组组进进入入和和离离开开宿宿主主菌染色体的途径中发现的。菌染色体的途径中发现的。BOPPOBBOBPOP裂解状态裂解状态: 噬菌体噬菌体DNA是一个是一个独立的环状分子独立的环状分子溶原状态溶原状态: 噬菌体噬菌体DNA和细菌和细菌基因组是一个整体，以与细菌基基因组是一个整体，以与细菌基因一样的方式复制和遗传因一样的方式复制和遗传这两种形式间的互换涉
11、及到位点专一性重组。这两种形式间的互换涉及到位点专一性重组。酶和蛋白酶和蛋白1) 整合酶（整合酶（Int）。）。2)整合宿主因子（整合宿主因子（IHF)3) 噬菌体的基因产物噬菌体的基因产物Xis。Xis对整合起抑制作用，对整合起抑制作用，是切除所必需的。是切除所必需的。4) 整合整合: Int + IHF; 切除切除: Int + IHF + Xis 。三、位点专一性重组三、位点专一性重组噬噬菌菌体体编编码码的的整整合合酶酶（Int）在在这这些些序序列列上上形形成成具具有有7bp的的突突出出端端的交错切的交错切 口。口。 位点专一性重组和同源重组的区别：位点专一性重组和同源重组的区别：1)位
12、位点点专专一一性性重重组组由由专专一一的的酶酶催催化化断断裂裂重重接接，有有专专一一的整合点的整合点；同源重组则取决于同源性。同源重组则取决于同源性。2)专专一一性性重重组组受受到到有有关关酶酶基基因因表表达达的的调调节节，而而同同源源重重组组则则取取决决于于能能与与RecA蛋蛋白白结结合合的的DNA序序列列，断断裂裂是是随机的。随机的。三、位点专一性重组三、位点专一性重组重组位点方向相同重组位点方向相同位点间片段的缺失位点间片段的缺失；有些类似于噬菌体从宿有些类似于噬菌体从宿主菌中切除的反应。主菌中切除的反应。如果重组位点的方向相同，如果重组位点的方向相同，就会导致位点间片段的缺失就会导致位
13、点间片段的缺失，重组位点方向相反重组位点方向相反位点间片段倒置位点间片段倒置如果重组位点方向相反就如果重组位点方向相反就会导致位点间片段的倒置会导致位点间片段的倒置四、转座重组四、转座重组 1. 概述概述1)可可移移动动遗遗传传因因子子是是基基因因组组中中可可以以自自己己从从一一个个位位点点转转移移到到另另一一个位点的核苷酸序列。如：转座子、逆转录转座子等。个位点的核苷酸序列。如：转座子、逆转录转座子等。2)可可移移动动遗遗传传因因子子的的移移动动不不依依赖赖于于供供体体和和受受体体位位点点的的序序列列关关系系，它它只只能能在在基基因因组组内内移移动动自自己己。有有时时带带上上其其它它序序列列
14、在在基基因因组组内内转移，因此它等同于一个细胞内转移，因此它等同于一个细胞内载体载体。3)一一个个基基因因组组中中可可能能含含有有可可以以转转座座的的和和丧丧失失转转座座功功能能的的转转座座序序列列。在在真真核核生生物物中中大大多多数数转转座座子子序序列列都都已已失失去去功功能能，但但在在转转座酶系统的作用下仍可作为底物进行转移。座酶系统的作用下仍可作为底物进行转移。1. 概述概述4) 细胞内的转座酶在通常情况下浓度很低，极少引起转细胞内的转座酶在通常情况下浓度很低，极少引起转座。每一世代每转座子的平均转座率为座。每一世代每转座子的平均转座率为10-310-4。在某一插入位点插入的平均频率为在
15、某一插入位点插入的平均频率为10-510-7，相当，相当于自然突变频率。于自然突变频率。5) 遗传效应：遗传效应： 转座引起插入突变转座引起插入突变 转座产生新的基因转座产生新的基因 转座产生回复突变或染色体畸变转座产生回复突变或染色体畸变 转座增加新的变异，有利于生物进化转座增加新的变异，有利于生物进化四、转座重组四、转座重组 1. 概述概述6) 转座子与逆转录转座子转座子与逆转录转座子n 转座子转座子 (transposon, Tn)：能将自身转座至同一细胞中其它：能将自身转座至同一细胞中其它DNA序列上许多不同位点的一段序列上许多不同位点的一段DNA。n它们可以从基因组的一个部位直接转移
16、到另一个部位，这个过它们可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，这个过程称为程称为转座转座。n 转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称迁，所以转座子又称跳跃基因跳跃基因。n逆转录转座子逆转录转座子：以以RNA为中介，逆转录成为中介，逆转录成cDNA后进行转座的后进行转座的可移动元件。可移动元件。四、转座重组四、转座重组 2. 原核生物的转座子及转座机制原核生物的转座子及转座机制1)插入序列（插入序列（insertion sequences, IS ）：具有末端反：具有末端反向重复序列的向重复序列的DNA元件
17、，通常元件，通常1 kb，含有一个转座，含有一个转座酶基因。酶基因。IS元件是细菌染色体和质粒的正常组成部元件是细菌染色体和质粒的正常组成部分。分。a)最简单的转座元件最简单的转座元件，各种插入序列都用，各种插入序列都用“IS”作前缀。作前缀。b)通常用双冒号表示一个插入事件，例如通常用双冒号表示一个插入事件，例如 :IS1 表示表示 IS1 插入到插入到 DNA中。中。c)IS自己编码转座所需的酶，因此转座是自己编码转座所需的酶，因此转座是自主的自主的。转座酶识。转座酶识别末端反向重复序列，启动转座。别末端反向重复序列，启动转座。四、转座重组四、转座重组 d) 组成上插入序列具有共同的特征组
18、成上插入序列具有共同的特征(1) 具有末端反向重复序列具有末端反向重复序列(2) 在靶位点产生正向重复序列在靶位点产生正向重复序列Invert repeat靶位点靶位点DNA正向正向重复的产生重复的产生2. 原核生物的转座子及转座机制原核生物的转座子及转座机制2) 复合转座子复合转座子a.一类带有抗药性基因的转座子，其两翼往往是两个相同或一类带有抗药性基因的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的高度同源的IS序列。这表明序列。这表明IS序列插入到某个功能基因两序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。端时就可能产生复合转座子。复合转座子要比复合转座子要比IS长得多长得多。复合转座子两
19、端的组件由复合转座子两端的组件由IS组成。组成。有的二侧组件相同（如有的二侧组件相同（如Tn903），有的不同（如），有的不同（如Tn10）。）。有的方向相同（如有的方向相同（如Tn9），有的方向相反（如），有的方向相反（如Tn903）。）。有的皆有功能（如有的皆有功能（如Tn903），有的仅右侧组件有功能。有的仅右侧组件有功能。四、转座重组四、转座重组 b. 因为复合型转座子的臂由因为复合型转座子的臂由IS组成，每个组成，每个 IS具有通常的反具有通常的反向重复末端结构，因此向重复末端结构，因此复合型转座子具有同样的短的末复合型转座子具有同样的短的末端反向重复序列。端反向重复序列。c. 每个
20、每个Is具有典型的第一类转座子的特征具有典型的第一类转座子的特征，可能独立地转位可能独立地转位，也可能与间插序列一道作为一个整体进行集体转移（？）也可能与间插序列一道作为一个整体进行集体转移（？）d. 对于复合型转座子来说，随着中央序列的增长，转座的对于复合型转座子来说，随着中央序列的增长，转座的频率降低。频率降低。e. 复合型转座子携带有抗药性基因复合型转座子携带有抗药性基因。Tn很容易从细菌染色很容易从细菌染色体转座到噬菌体基因组或者接合型的质粒中。因此，体转座到噬菌体基因组或者接合型的质粒中。因此，Tn可以很快地传播到其他细菌细胞，这是自然界中细菌产可以很快地传播到其他细菌细胞，这是自然
21、界中细菌产生抗药性的重要来源。生抗药性的重要来源。2. 原核生物的转座子及转座机制原核生物的转座子及转座机制3) 转座机制转座机制(1) 转座的一般过程转座的一般过程a) 在靶在靶DNA上产生交错切口。上产生交错切口。b) 交错切口处突出的单链末端与转座子连接，形成连接交错切口处突出的单链末端与转座子连接，形成连接复合体。复合体。c) 缺口处由聚合酶和连接酶补齐。缺口处由聚合酶和连接酶补齐。四、转座重组四、转座重组 3) 转座机制转座机制(2) 两种转座机制两种转座机制a) 复制型转座复制型转座：转转座座子子在在转转座座过过程程中中被被复复制制，转转座座完完成成后后，在在供供体体位位点有一个拷
22、贝，在受体位点有一个拷贝。点有一个拷贝，在受体位点有一个拷贝。b) 非复制型转座：非复制型转座：转转座座子子直直接接从从一一个个位位点点跳跳跃跃到到另另一一个个位位点点，在在供供体体位位点留下一个缺口点留下一个缺口。四、转座重组四、转座重组 复制型转座复制型转座非复制型转座非复制型转座3. 真核生物的转座子及转座机制真核生物的转座子及转座机制1) 转座子的发现：转座子的发现：1948年年B. McClintock 发现：在玉米中有一种因发现：在玉米中有一种因子能在基因组中跳跃式地变动位置。她称之为子能在基因组中跳跃式地变动位置。她称之为“控制控制因子因子”，即转座子。即转座子。 Barbura
23、 McClintock 美国女遗传学家。美国女遗传学家。20世纪世纪40年代开始研究年代开始研究；Cornell University;Cold spring harbor laboratory;四、转座重组四、转座重组 Cold spring harbor laboratory;Watson Retires现象：现象：玉米籽粒有色（红、紫），但有一些籽粒出现花斑玉米籽粒有色（红、紫），但有一些籽粒出现花斑及条纹，花斑有大有小。早期有颜色者，花斑大，后期有及条纹，花斑有大有小。早期有颜色者，花斑大，后期有色者，花斑很小。色者，花斑很小。花斑条纹玉米花斑条纹玉米 McClintock认为，已知认
24、为，已知有色基因有色基因C（第九染色体上，是（第九染色体上，是显性）可使籽粒有色，但在显性）可使籽粒有色，但在C旁有一个基因叫旁有一个基因叫Ds，它能抑，它能抑制基因制基因C的作用，使籽粒无色；的作用，使籽粒无色； 当当Ds从从C旁移走后，旁移走后，C作用恢复，出现颜色；作用恢复，出现颜色； Ds从从C上移走的早，花斑就大，反之就小；因此花斑的上移走的早，花斑就大，反之就小；因此花斑的大小是大小是Ds从从C上移走的早晚引起的。上移走的早晚引起的。 Ds的移动还受另一个因子（的移动还受另一个因子（Ac）的控制，当）的控制，当Ac存在时，存在时，Ds可移动，可移动，Ac丢失，则丢失，则Ds不能移动
25、。不能移动。Ds（Dissociation gene 解解离离基基因因）：位位于于它它能能控制的结构基因控制的结构基因C旁侧。旁侧。Ac（Activator，激激活活因因子子）：位位于于基基因因组组内内任任何地方。何地方。2) 真核生物转座子的分类真核生物转座子的分类按有无自我转座的能力分成两类：按有无自我转座的能力分成两类：1)自主因子（自主因子（antonomous elements），具有自我切除和转座能），具有自我切除和转座能力。由于自主因子的持续活性，它们可以插入到任何位点产生力。由于自主因子的持续活性，它们可以插入到任何位点产生一个不稳定或可突变的等位基因。自主因子的丢失使可变的等
26、一个不稳定或可突变的等位基因。自主因子的丢失使可变的等位基因变成稳定的等位基因位基因变成稳定的等位基因。2)非自主因子（非自主因子（non-antonomous elements），是稳定的，它们），是稳定的，它们自己并不能转座，能否转座取决于有无自己并不能转座，能否转座取决于有无与非自主因子同家族的与非自主因子同家族的自主因子自主因子的存在。当自主因子存在时，不论自主因子位于何处，的存在。当自主因子存在时，不论自主因子位于何处，都都能使非自主因子变得不稳定能使非自主因子变得不稳定。四、转座重组四、转座重组 自主因子自主因子非自主因子非自主因子3) 玉米中的转座子玉米中的转座子四、转座重组四、
27、转座重组 A. Ac-Ds系统系统（激活激活-解离系统解离系统）a. 通过非复制型机制进行转座通过非复制型机制进行转座b. Ac：激激活活因因子子（自自主主因因子子），全全长长4563bp，转转录录生生成成的的RNA中中包包括括4个个内内含含子子和和5个个外外显显子子，其其产产物物为为转转座座酶酶。Ac两两翼翼有有11bp的反向重复序列，在靶位点形成的反向重复序列，在靶位点形成8bp的正向重复序列。的正向重复序列。c. Ds：解解离离因因子子（非非自自主主因因子子 ），与与Ac属属于于同同一一家家族族；已已知知所所有有的的Ds都都是是Ac转转座座子子的的缺缺失失突突变变体体，如如 Ds9缺缺失
28、失了了194bp，Ds6缺缺失失了了2.5kb，因因而而失失去去转转座座酶酶功功能能；当当Ac存存在在时时，能能活活化化Ds，使其转座。，使其转座。Ac:Ds:B. Spm-dSpm系统系统（抑制抑制-促进促进-增变系统增变系统）a. Spm：增增强强因因子子（自自主主因因子子），全全长长8300bp，包包括括11个个外外显显子子，编编码码两两个个转转座座蛋蛋白白TNPA和和TNPB。Spm两两翼翼有有13bp的的反反向向重重复复序序列列，在在靶靶位位点点形形成成3bp的的正正向向重复序列。重复序列。b. dSpm：非非自自主主因因子子，已已知知所所有有的的dSpm都都是是Spm因因子子的缺失
29、突变体。的缺失突变体。c. 如如果果缺缺失失突突变变发发生生在在与与内内含含子子1相相对对应应的的区区域域，破破坏坏了了tnpB基基因因，该该突突变变体体的的功功能能并并不不完完全全消消失失，仅仅产产生生弱弱Spm，说明，说明 tnpB基因产物的功能可以被部分替代。基因产物的功能可以被部分替代。TNPBTNPASpmdSpm本章重点、难点：本章重点、难点：基基本本概概念念：DNA重重组组，RecA蛋蛋白白，Holliday结结构构，分分支支迁迁移移，转转座座子子，逆逆转转座座子子，插插入入序序列列。了了解解三三种种重重组组方方式式的的概概念念、重重组组发发生生的的基基本本过过程程以以及及相相互互间间的的区区别别；掌掌握握同同源源重重组组（单单/双双链链断断裂裂模模式式）和和转转座座重重组组（非非）复复制制型型转转座座）的的分分子子机机制；掌握插入序列与复合转座子间的关系。制；掌握插入序列与复合转座子间的关系。
