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1、免疫免疫细胞的分离胞的分离2024/8/291.免疫免疫细胞胞v1、概念、概念 直接参与免疫直接参与免疫应答及与免疫答及与免疫应答相关的所有答相关的所有细胞。胞。v2、分、分类 单核吞噬核吞噬细胞系胞系统：单核核细胞胞 / / 巨噬巨噬细胞胞 树突状突状细胞（胞（DCs)DCs) 淋巴淋巴细胞系胞系统：T T 淋巴淋巴细胞胞 （Th / Tc)Th / Tc) B B 淋巴淋巴细胞胞 NK NK 细胞胞 粒粒细胞系胞系统: : 中性粒中性粒细胞胞 噬酸性粒噬酸性粒细胞胞 噬碱性粒噬碱性粒细胞胞2024/8/292.免疫免疫细胞的分离胞的分离v人外周血人外周血单个核个核细胞的分离胞的分离v淋巴淋
2、巴细胞的分离胞的分离v免疫免疫细胞胞亚群的分离群的分离2024/8/293.细胞分离原理胞分离原理v细胞的大小和比重胞的大小和比重v细胞表面胞表面标志志v细胞黏附于各种物胞黏附于各种物质表面的特性表面的特性2024/8/294. 一、人外周血一、人外周血单个核个核细胞的分离胞的分离 Ficoll分层离心法人外周血人外周血单个核个核细胞胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte。原理：原理：血液中各血液中各细胞成分的比重不同，胞成分的比重不同，经离心离心沉淀，即可在分沉淀，即可在分层液与血液与血浆之之间获得比得比
3、较纯的的单个核个核细胞，其中淋巴胞，其中淋巴细胞占胞占90%以上。以上。 2024/8/295.不同不同细胞密度不同胞密度不同 红细胞和多形核白胞和多形核白细胞胞 1.092 单个核个核细胞胞 1.070 分分层液液 1.0772024/8/296.一、人外周血一、人外周血单个核个核细胞的分离胞的分离 Ficoll分层离心法Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。2024/8/297.二、淋巴二、淋巴细胞的分离胞的分离v尼尼龙棉柱法棉柱法vE花花环分离法分离法v补体体细胞毒法免疫胞毒法免疫荧光法光法 2024/8/298.二、淋巴二、淋巴细胞的分离胞的分离
4、尼尼龙棉柱法棉柱法原理原理：B细胞和胞和单核核细胞具有胞具有易黏附易黏附的特性，的特性，将淋巴将淋巴细胞胞悬液加至尼液加至尼龙纤维柱上，柱上，37 作作用用12h后，洗脱的后，洗脱的为非黏附性的非黏附性的T细胞。胞。PBMC尼尼龙纤维棉柱棉柱B细胞胞单核核细胞胞T细胞胞2024/8/299. 二、淋巴二、淋巴细胞的分离胞的分离 E花花环分离法（分离法（纯化化T细胞）胞）原理原理成熟成熟成熟成熟T T细细胞表面有胞表面有胞表面有胞表面有绵绵羊羊羊羊红细红细胞受体（胞受体（胞受体（胞受体（E E受体，受体，受体，受体，CD2CD2分分分分子），可和子），可和子），可和子），可和SRBCSRBC形成
5、形成形成形成E E花花花花环环，B B细细胞胞胞胞则则无。无。无。无。 E E花花花花环环比重大，沉淀，比重大，沉淀，比重大，沉淀，比重大，沉淀，经经分离液分离来。分离液分离来。分离液分离来。分离液分离来。 E E花花花花环环周周周周围围的的的的绵绵羊羊羊羊RBCRBC可可可可 用低渗法除去。用低渗法除去。用低渗法除去。用低渗法除去。10.三、免疫三、免疫细胞胞亚群的分离群的分离v免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法v流式流式细胞胞术2024/8/2911.三、免疫三、免疫细胞胞亚群的分离群的分离 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法原理：原理：将抗体交将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠于磁珠表面形成免疫磁珠
6、（Immunomagnetic bead，IMB），免疫磁），免疫磁珠直接或者珠直接或者间接偶接偶联在抗体上，从而与在抗体上，从而与细胞胞相相连， 在高在高强度、梯度磁度、梯度磁场中达到中达到细胞磁性胞磁性分离的目的。分离的目的。2024/8/2912免疫细胞的分离12. 三、免疫三、免疫细胞胞亚群的分离群的分离 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法v1. 直接法： 抗细胞表面分子抗体+磁性微球 免疫磁珠免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的细胞v2. 间接法： 第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞 特定细胞13.14.15.免疫磁珠法分免疫磁珠法分选装置装置16.三、免疫三、免疫细胞胞亚群的分离群的分离
7、 流式流式细胞胞术（Flow Cytometry，FCM）FCM将将免免疫疫荧光光技技术应用用于于流流式式细胞胞仪，对单个个细胞胞的的表表面面标志志（抗抗原原或或受受体体）进行行快快速速、精精确确的的分分析析和和自自动检测，并并将将不同不同类型的型的细胞分胞分选收集。收集。原原理理：细胞胞经荧光光染染色色后后，通通过高高速速流流动系系统，细胞胞排排成成单行行，逐逐个个流流经检测区区。当当细胞胞从从流流动室室喷嘴嘴处流流出出时，超超声声震震动液液流流，使使液液流流段段裂裂成成一一连串串的的均均匀匀小小滴滴，每每个个小小滴滴内内最最多多含含一一个个细胞胞，细胞胞经激激光光束束照照射射产生生荧光光和和散散射射光光，由由光光电倍倍增增管管接接收收，转换成脉冲信号，数据成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨理，分辨细胞胞类型。型。2024/8/2917.流式流式细胞胞仪工作原理工作原理2024/8/2918.流式流式细胞胞仪2024/8/2919.免疫免疫细胞的分离胞的分离v人外周血人外周血单个核个核细胞的分离胞的分离Ficoll分分层离离 心法心法v淋巴淋巴细胞的分离胞的分离尼尼龙棉柱法、棉柱法、E花花环分离法、分离法、补体体细胞毒法免疫胞毒法免疫荧光法光法v免疫免疫细胞胞亚群的分离群的分离免疫磁珠分离法、免疫磁珠分离法、流式流式细胞胞术20.谢谢！2024/8/2921.
