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1、（一（一 ）化学因素对微生物生长的影响）化学因素对微生物生长的影响（二）细菌的生理生化反应（二）细菌的生理生化反应实验六实验六实验目的：实验目的：实验目的：实验目的：了解常用化学消毒剂对微生物的作用了解常用化学消毒剂对微生物的作用了解常用化学消毒剂对微生物的作用了解常用化学消毒剂对微生物的作用 实验一实验一 化学因素对微生物生长的影响化学因素对微生物生长的影响常用的化学消毒剂主要有常用的化学消毒剂主要有常用的化学消毒剂主要有常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐类、有机重金属及其盐类、有机重金属及其盐类、有机重金属及其盐类、有机溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元素及其化合物、溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元
2、素及其化合物、溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元素及其化合物、溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元素及其化合物、染色剂和表面活性剂等染色剂和表面活性剂等染色剂和表面活性剂等染色剂和表面活性剂等。实验原理：实验原理：1 1 1 1 氧化氧化氧化氧化剂：通过强烈的氧化作用杀死微生物。剂：通过强烈的氧化作用杀死微生物。剂：通过强烈的氧化作用杀死微生物。剂：通过强烈的氧化作用杀死微生物。 碘的杀菌力强，碘的杀菌力强，碘的杀菌力强，碘的杀菌力强，3 3 3 37 7 7 7碘溶于碘溶于碘溶于碘溶于7070707083838383的乙醇的乙醇的乙醇的乙醇中中中中 成成成成碘酒碘酒碘酒碘酒。2 2 2 2 重金属盐类：使
3、蛋白质变性、沉淀，使酶失活。重金属盐类：使蛋白质变性、沉淀，使酶失活。重金属盐类：使蛋白质变性、沉淀，使酶失活。重金属盐类：使蛋白质变性、沉淀，使酶失活。 00200200200202020202HgClHgClHgClHgCl2 2 2 2（升汞升汞升汞升汞）溶液对大多数细菌）溶液对大多数细菌）溶液对大多数细菌）溶液对大多数细菌有致死作用。有致死作用。有致死作用。有致死作用。 3 3 3 3 有机溶剂：使蛋白质及核酸变性、破坏细胞膜有机溶剂：使蛋白质及核酸变性、破坏细胞膜有机溶剂：使蛋白质及核酸变性、破坏细胞膜有机溶剂：使蛋白质及核酸变性、破坏细胞膜透性，抑制脱氢酶，氧化酶活性。透性，抑制脱
4、氢酶，氧化酶活性。透性，抑制脱氢酶，氧化酶活性。透性，抑制脱氢酶，氧化酶活性。乙醇乙醇乙醇乙醇（70%70%70%70%）4 4 4 4 表面活性剂：具有降低表面张力效应的物质，表面活性剂：具有降低表面张力效应的物质，表面活性剂：具有降低表面张力效应的物质，表面活性剂：具有降低表面张力效应的物质，可抑菌或杀菌。可抑菌或杀菌。可抑菌或杀菌。可抑菌或杀菌。甲酚甲酚甲酚甲酚杀菌力最强杀菌力最强杀菌力最强杀菌力最强煤酚皂液（煤酚皂液（煤酚皂液（煤酚皂液（来苏尔）来苏尔）来苏尔）来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液。为甲酚和肥皂的混合液。为甲酚和肥皂的混合液。为甲酚和肥皂的混合液。 新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭新洁
5、尔灭：破坏细胞的渗透性：破坏细胞的渗透性：破坏细胞的渗透性：破坏细胞的渗透性实验材料实验材料1 1 菌种：菌种：菌种：菌种： 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌2 2 2 2 培养基：培养基：培养基：培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基3 3 3 3 消毒剂：消毒剂：消毒剂：消毒剂： 2.5%2.5%2.5%2.5%碘酒碘酒碘酒碘酒，0.5%0.5%0.5%0.5%石碳酸石碳酸石碳酸石碳酸，75%75%75%75%乙醇乙醇乙醇乙醇， 100%100%100%100%乙醇，乙醇，乙醇，乙醇，1%1%1%1%来苏尔来苏尔来苏尔来苏尔， 0.25%0.25
6、%0.25%0.25%新洁尔灭，无菌生理盐水新洁尔灭，无菌生理盐水新洁尔灭，无菌生理盐水新洁尔灭，无菌生理盐水实验步骤实验步骤1 1 1 1 倒牛肉膏蛋白胨平板倒牛肉膏蛋白胨平板倒牛肉膏蛋白胨平板倒牛肉膏蛋白胨平板2 2 2 2 取取取取0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml大肠杆菌菌液加入平板中，涂布均匀。大肠杆菌菌液加入平板中，涂布均匀。大肠杆菌菌液加入平板中，涂布均匀。大肠杆菌菌液加入平板中，涂布均匀。3 3 3 3 将平板将平板将平板将平板( ( ( (皿底）划分为皿底）划分为皿底）划分为皿底）划分为6 6 6 6等份，分别将浸有各种等份，分别将浸有各种等份，分别将浸有各种等份，分别
7、将浸有各种消毒剂的小圆滤纸片贴在平板的每一等份中。消毒剂的小圆滤纸片贴在平板的每一等份中。消毒剂的小圆滤纸片贴在平板的每一等份中。消毒剂的小圆滤纸片贴在平板的每一等份中。4 4 4 4 将贴好滤纸片的含菌平板，置将贴好滤纸片的含菌平板，置将贴好滤纸片的含菌平板，置将贴好滤纸片的含菌平板，置37373737倒置培养倒置培养倒置培养倒置培养24-24-24-24-48h48h48h48h。5 5 5 5 测量并记录抑菌圈的直径，根据其直径的大小，测量并记录抑菌圈的直径，根据其直径的大小，测量并记录抑菌圈的直径，根据其直径的大小，测量并记录抑菌圈的直径，根据其直径的大小，可初步确定测试药品的抑菌效能
8、。可初步确定测试药品的抑菌效能。可初步确定测试药品的抑菌效能。可初步确定测试药品的抑菌效能。（自带尺子）（自带尺子）（自带尺子）（自带尺子）实验结果实验结果思考题思考题 书书书书p97p97p97p97思考题第思考题第思考题第思考题第11111111题题题题消毒剂消毒剂抑（杀）菌圈直抑（杀）菌圈直径径/mm消毒剂消毒剂抑（杀）菌圈直抑（杀）菌圈直径径/mm 2.5%2.5%碘酒碘酒碘酒碘酒5%5%石炭酸（苯酚石炭酸（苯酚石炭酸（苯酚石炭酸（苯酚) )100100乙醇乙醇乙醇乙醇1%1%来苏尔来苏尔来苏尔来苏尔75%75%乙醇乙醇乙醇乙醇0.25%0.25%新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭实验二
9、实验二：细菌的生理生化反应细菌的生理生化反应 （IMViCIMViCIMViCIMViC 与硫化氢试验）与硫化氢试验）与硫化氢试验）与硫化氢试验） 吲哚（吲哚（吲哚（吲哚（I I I I）、）、）、）、甲基红（甲基红（甲基红（甲基红（M M M M）、）、）、）、V.P.V.P.V.P.V.P.试验（试验（试验（试验（ViViViVi）、柠檬）、柠檬）、柠檬）、柠檬酸盐利用（酸盐利用（酸盐利用（酸盐利用（C C C C）试验。用以将大肠杆菌与其形状十分试验。用以将大肠杆菌与其形状十分试验。用以将大肠杆菌与其形状十分试验。用以将大肠杆菌与其形状十分相近的肠杆菌属的细菌鉴别开来。相近的肠杆菌属的细
10、菌鉴别开来。相近的肠杆菌属的细菌鉴别开来。相近的肠杆菌属的细菌鉴别开来。实验目的：实验目的：实验目的：实验目的： 1 1 1 1 学习几种主要微生物的生理代谢试验及检验方法学习几种主要微生物的生理代谢试验及检验方法学习几种主要微生物的生理代谢试验及检验方法学习几种主要微生物的生理代谢试验及检验方法 认识微生物代谢类型的多样性。认识微生物代谢类型的多样性。认识微生物代谢类型的多样性。认识微生物代谢类型的多样性。 2 2 2 2 了解了解了解了解IMViCIMViCIMViCIMViC反应在肠道菌鉴定中的意义和方法反应在肠道菌鉴定中的意义和方法反应在肠道菌鉴定中的意义和方法反应在肠道菌鉴定中的意义
11、和方法 实验原理：实验原理： 1 1 1 1 吲吲吲吲哚哚哚哚试试试试验验验验 ： 用用用用来来来来检检检检测测测测吲吲吲吲哚哚哚哚的的的的产产产产生生生生，有有有有些些些些细细细细菌菌菌菌能能能能产产产产生生生生色色色色氨氨氨氨酸酸酸酸酶酶酶酶，分分分分解解解解蛋蛋蛋蛋白白白白胨胨胨胨中中中中的的的的色色色色氨氨氨氨酸酸酸酸产产产产生生生生吲吲吲吲哚哚哚哚和和和和丙丙丙丙氨酸。氨酸。氨酸。氨酸。吲哚吲哚吲哚吲哚 + + + + 对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛 红色的玫瑰吲哚红色的玫瑰吲哚红色的玫瑰吲哚红色的玫瑰吲哚色氨酸色氨酸吲哚吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚
12、 吲哚试剂吲哚试剂2 2 2 2 甲基红试验（甲基红试验（甲基红试验（甲基红试验（M.RM.RM.RM.R） ：大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌与与与与产气肠杆菌产气肠杆菌产气肠杆菌产气肠杆菌在在在在利用葡萄糖进行发酵时，利用葡萄糖进行发酵时，利用葡萄糖进行发酵时，利用葡萄糖进行发酵时，前者可产生大量的混合前者可产生大量的混合前者可产生大量的混合前者可产生大量的混合酸，使酸，使酸，使酸，使pH4.5pH4.5pH4.5pH4.5；后者则后者则后者则后者则产生大量的中性化合物产生大量的中性化合物产生大量的中性化合物产生大量的中性化合物丁二醇，丁二醇，丁二醇，丁二醇，pH4.5pH4.5pH4.5
13、pH4.5，因此因此因此因此在发酵液中加入甲基红在发酵液中加入甲基红在发酵液中加入甲基红在发酵液中加入甲基红试剂时，前者呈红色，试剂时，前者呈红色，试剂时，前者呈红色，试剂时，前者呈红色，后者呈黄色。后者呈黄色。后者呈黄色。后者呈黄色。 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖 乳酸乳酸乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛乙醛乙醛 乙酰乙酰乙酰乙酰CoACoA 甲酸甲酸甲酸甲酸乙醇乙醇乙醇乙醇 乙酰乳酸乙酰乳酸乙酰乳酸乙酰乳酸 二乙酰二乙酰二乙酰二乙酰 3-3-羟基丁酮羟基丁酮羟基丁酮羟基丁酮 2,3-2,3-丁二醇丁二醇丁二醇丁二醇CO2 H2 -乙酰乳酸合成酶乙酰乳酸合成酶 -乙酰乳酸脱羧酶乙酰乳酸
14、脱羧酶2,3-丁二醇脱氢酶丁二醇脱氢酶一些细菌具有一些细菌具有一些细菌具有一些细菌具有 - - - -乙酰乳酸合成酶乙酰乳酸合成酶乙酰乳酸合成酶乙酰乳酸合成酶系而进行丁二醇发酵。系而进行丁二醇发酵。系而进行丁二醇发酵。系而进行丁二醇发酵。EMP产气杆菌产气杆菌产气杆菌产气杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌3 V.P.3 V.P.试验试验碱性条件碱性条件 氧氧红色化合物红色化合物（与培养基中精氨酸（与培养基中精氨酸的胍基结合）的胍基结合）发酵途径：发酵途径：葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 二乙酰二乙酰红色化合物红色化合物 + + 胍基化合物胍基
15、化合物葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸 大肠杆菌大肠杆菌产气杆菌产气杆菌4 4 柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验：有些细菌如有些细菌如有些细菌如有些细菌如产气肠杆产气肠杆产气肠杆产气肠杆菌菌菌菌能利用柠檬酸盐作能利用柠檬酸盐作能利用柠檬酸盐作能利用柠檬酸盐作为碳源，产生碱性化为碳源，产生碱性化为碳源，产生碱性化为碳源，产生碱性化合物，使培养基的合物，使培养基的合物，使培养基的合物，使培养基的 pH pH pH pH 升高，当加入溴升高，当加入溴升高，当加入溴升高，当加入溴麝香草酚蓝指示剂时，麝香草酚蓝指示剂时，麝香草酚蓝指示剂时，麝香草酚蓝指示剂时，培养基会由绿色变为培养基会由绿色变为培养基会由绿色变
16、为培养基会由绿色变为深蓝色。深蓝色。深蓝色。深蓝色。I M Vi C试验试验VP testCitrate utilization testIndol testMethyl test I M Vi C大肠杆菌大肠杆菌 + + 产气肠杆菌产气肠杆菌 + +常用于肠道杆菌的鉴定常用于肠道杆菌的鉴定5 5 硫化氢试验硫化氢试验：有些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，当其遇有些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，当其遇有些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，当其遇有些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，当其遇到培养基中的铅或铁盐时，形成黑色的沉淀物。到培养基中的铅或铁盐时，形成黑色的沉淀物。到培养基中
17、的铅或铁盐时，形成黑色的沉淀物。到培养基中的铅或铁盐时，形成黑色的沉淀物。实验材料实验材料菌种：菌种：菌种：菌种： 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 、产气杆菌、变形杆菌、产气杆菌、变形杆菌、产气杆菌、变形杆菌、产气杆菌、变形杆菌培养基：培养基：培养基：培养基： 蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基（吲哚试验）（吲哚试验） 葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏普试验）（甲基红试验和伏普试验）柠檬酸盐斜面培养基、柠檬酸盐斜面培养基、柠檬酸盐斜面培养基、柠檬酸盐斜面培养基、醋酸铅培养基醋酸铅培养基醋酸铅培养基醋酸铅培养
18、基（硫化氢试验）（硫化氢试验）实验步骤实验步骤一一一一 接种与培养接种与培养接种与培养接种与培养1 1 1 1 用接种针将大肠杆菌用接种针将大肠杆菌用接种针将大肠杆菌用接种针将大肠杆菌 、变形杆菌分别穿刺接入、变形杆菌分别穿刺接入、变形杆菌分别穿刺接入、变形杆菌分别穿刺接入2 2 2 2支支支支醋酸铅培养基醋酸铅培养基醋酸铅培养基醋酸铅培养基2 2 2 2 将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于2 2 2 2支蛋白胨水培支蛋白胨水培支蛋白胨水培支蛋白胨水培养基（吲哚试验）、养基（吲哚试验）、养基（吲哚试验）、养基
19、（吲哚试验）、 4 4 4 4支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和基红试验和基红试验和基红试验和V.P.V.P.V.P.V.P.试验）中，置试验）中，置试验）中，置试验）中，置37373737培养培养培养培养24 -48h 24 -48h 24 -48h 24 -48h 。3 3 3 3 柠檬酸盐斜面培养基柠檬酸盐斜面培养基柠檬酸盐斜面培养基柠檬酸盐斜面培养基4 4 4 4 对照（所有同学共用）对照（所有同学共用）对照（所有同学共用）对照（所有同学共用）二二二二 结果观察结果观察结果观察结果观察( ( ( (时间时间
20、时间时间) ) ) )2 2 2 2、学学学学生生生生按按按按实实实实验验验验书书书书所所所所介介介介绍绍绍绍的的的的操操操操作作作作方方方方法法法法进进进进行行行行生生生生化化化化反反反反应应应应试试试试验验验验，将将将将实实实实验验验验 结果填入下表中（六人一组结果共享）结果填入下表中（六人一组结果共享）结果填入下表中（六人一组结果共享）结果填入下表中（六人一组结果共享）菌种菌种菌种菌种吲哚试吲哚试吲哚试吲哚试验验验验甲基红试甲基红试甲基红试甲基红试验验验验V.P.V.P.V.P.V.P.试验试验试验试验H H H H2 2 2 2S S S S试验试验试验试验柠檬柠檬柠檬柠檬酸盐酸盐酸盐
21、酸盐大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌产气杆菌产气杆菌产气杆菌产气杆菌变形杆菌）变形杆菌）变形杆菌）变形杆菌）3 3 3 3 思考题：见书思考题：见书思考题：见书思考题：见书p120p120p120p120思考题第思考题第思考题第思考题第1 1 1 1题题题题硫化氢试验硫化氢试验 培养培养24h24h后观察黑色硫化铁的产生。后观察黑色硫化铁的产生。吲哚试验吲哚试验 在培养在培养24h24h后的蛋白胨水培养基中加入后的蛋白胨水培养基中加入3-43-4滴乙滴乙醚，摇动数次，静置醚，摇动数次，静置1-3min1-3min，待乙醚上升后，沿试管徐徐加入，待乙醚上升后，沿试管徐徐加入2 2滴吲哚试剂，在乙
22、醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。甲基红试验甲基红试验 在培养在培养24h24h后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加入后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加入甲基红试剂甲基红试剂2 2滴，培养基变红者为阳性，变黄者为阴性。（注意：滴，培养基变红者为阳性，变黄者为阴性。（注意：甲基红试剂加得过多，可出现假阳性现象。）甲基红试剂加得过多，可出现假阳性现象。）伏普试验伏普试验 在培养在培养24h24h后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加入入5 51010滴滴4040KOHKOH，然后加入等量的，然后加入等量的5 5-萘酚溶液，用力振萘酚溶液，用力振荡，再放入荡，再放入3737温箱中保温温箱中保温15153030分钟。反应物呈红色者，为分钟。反应物呈红色者，为伏普反应阳性。伏普反应阳性。培养培养48h48h后观察柠檬酸盐斜面培养基上是否有细菌生长和是否后观察柠檬酸盐斜面培养基上是否有细菌生长和是否变色，蓝色为阳性，绿色为阴性。变色，蓝色为阳性，绿色为阴性。实验要求实验要求每个人做每个人做1 1个平板的化学因素对微生物生个平板的化学因素对微生物生长的影响长的影响每个人做每个人做IMViC 与硫化氢试验与硫化氢试验中的一个中的一个小实验小实验每组每组(5-6(5-6人人) )
