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1、第三节第三节染色体自主复制序列的染色体自主复制序列的分离与鉴定分离与鉴定一一分离分离ARS的一般程序的一般程序染色体染色体DNA限制酶切限制酶切与整合型载体连接与整合型载体连接转化相应的宿主转化相应的宿主细胞细胞分离纯化转化体分离纯化转化体*分离各转化子总分离各转化子总DNA转化转化E.coli药药物抗性菌落物抗性菌落分离质粒分离质粒DNA重新转入宿主细胞重新转入宿主细胞高频重组转高频重组转化体化体*在获得第一次转化体后，可利用下述方法淘汰掉全部因整合作在获得第一次转化体后，可利用下述方法淘汰掉全部因整合作用所形成的转化体：用所形成的转化体：转化体菌落转化体菌落点种在合成和完全培养基上的同一位
2、置点种在合成和完全培养基上的同一位置培养培养将完全培养基平板上的菌落影印到另一个合成培养基平板将完全培养基平板上的菌落影印到另一个合成培养基平板上上培养培养比较两个合成培养基平板上生长的菌落，挑选那比较两个合成培养基平板上生长的菌落，挑选那些在第二个合成培养基平板上不生长的相应位置上的菌落些在第二个合成培养基平板上不生长的相应位置上的菌落（从第一个平板上挑取）（从第一个平板上挑取）二二ARS的分析与鉴定的分析与鉴定1限制酶谱与次克隆限制酶谱与次克隆2.倒位分析倒位分析3.插入分析插入分析：将：将1.4KbEcoRI片段分离出来，插入另一个片段分离出来，插入另一个整合载体，其重组整合载体，其重组
3、DNA分子的转化频率可大大提高分子的转化频率可大大提高4.定位分析定位分析5.遗传稳定性分析遗传稳定性分析6.DNA序列分析序列分析用用ARSDNA作探针与染色体作探针与染色体DNA杂交，只能有一杂交带出现，杂交，只能有一杂交带出现，这表明各这表明各ARS顺序之间不能发生交叉杂交，但不同的顺序之间不能发生交叉杂交，但不同的ARS显然只显然只能利用同种能利用同种DNA聚合酶。聚合酶。核苷酸顺序测定结果表明，来自不同的核苷酸顺序测定结果表明，来自不同的ARS顺序含有顺序含有11个核个核苷酸的保守序列：苷酸的保守序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T)AT含量几乎为含量几乎为100%该保守序列
4、位于一富含该保守序列位于一富含AT的区域内，其长度为的区域内，其长度为100bp，AT含含量为量为79%。ARS1的结构分析表明，它由两个组件构成。组件的结构分析表明，它由两个组件构成。组件A决决定高频转化，但自由复制有限，而组件定高频转化，但自由复制有限，而组件B可提高组件可提高组件A的复制效率，的复制效率，但它本身不能自主复制。但它本身不能自主复制。*利用上述方法分离自不同生物的利用上述方法分离自不同生物的ARS，当放回原来生物时不一定当放回原来生物时不一定能自主复制能自主复制第四节第四节着丝粒着丝粒DNA的分离与鉴定的分离与鉴定一分离着丝粒的方法与步骤一分离着丝粒的方法与步骤1.染色体巡
5、查法染色体巡查法先利用遗传互补法和免疫筛选法分离靠近着丝粒的各个基因，先利用遗传互补法和免疫筛选法分离靠近着丝粒的各个基因，然后用染色体巡查的方法去筛选那些在有丝分裂和减数分裂中十分然后用染色体巡查的方法去筛选那些在有丝分裂和减数分裂中十分稳定的重组质粒，这种方法特别适合于那些遗传学图谱已经清楚的稳定的重组质粒，这种方法特别适合于那些遗传学图谱已经清楚的着丝粒的分离，其一般过程如下着丝粒的分离，其一般过程如下:遗传互补法遗传互补法染色体染色体DNA组建基因文库组建基因文库分离与着丝粒两端或与着丝粒连锁分离与着丝粒两端或与着丝粒连锁免疫筛选法免疫筛选法的基因的基因染色体巡查染色体巡查检测各重组检
6、测各重组DNA分子的遗传稳定性分子的遗传稳定性进一步确证与鉴定进一步确证与鉴定酵母染色体酵母染色体3、4、6和和11上的着丝粒就是利用该法分离到的上的着丝粒就是利用该法分离到的2.直接筛选法直接筛选法该法适用于那些着丝粒与已知基因相距较远的或连锁关系该法适用于那些着丝粒与已知基因相距较远的或连锁关系不太清楚的着丝粒的分离。这种分离方法所依赖的不太清楚的着丝粒的分离。这种分离方法所依赖的原理原理之一是之一是当一自主复制型载体插入一段含着丝粒的当一自主复制型载体插入一段含着丝粒的DNA片段后，其片段后，其稳定稳定性大大增加性大大增加，而，而质粒的拷贝数将降为质粒的拷贝数将降为1-2。其分离程序：。
7、其分离程序：染色体染色体DNA部分限制酶切部分限制酶切与自主复制载体相连与自主复制载体相连转化相应突变体转化相应突变体转化转化体体培养在完全培养基上培养在完全培养基上涂布在合成培养基上涂布在合成培养基上纯化转化体纯化转化体分离总分离总DNA转化转化E.coli抗性转化体抗性转化体分离质粒分离质粒DNADNA杂交杂交进一步鉴定进一步鉴定限制酶切限制酶切电泳电泳Southern杂交杂交酿酒酵母酿酒酵母的的CEN5便是利用此方法分离到的便是利用此方法分离到的,该法也适用于该法也适用于任何着丝粒任何着丝粒DNA的分离。的分离。二着丝粒二着丝粒DNA的鉴定方法的鉴定方法1.稳定性分析稳定性分析1)有丝分
8、裂：培养在完全培养基上若干代后再检测其质粒的的有丝分裂：培养在完全培养基上若干代后再检测其质粒的的存在。存在。2)减数分裂：减数分裂：转化体细胞与另一性别细胞交配形成二倍体，然后再经转化体细胞与另一性别细胞交配形成二倍体，然后再经孢子形成过程产生单倍体，从单倍体性状的分布情况就可得孢子形成过程产生单倍体，从单倍体性状的分布情况就可得知分离到的着丝粒的特征知分离到的着丝粒的特征(4+：0-，3+：1-，2+：2-，1+：3-）2.着丝粒在染色体上的定位着丝粒在染色体上的定位利用方法二所分离到的着丝粒常常需要确定它来自何条染利用方法二所分离到的着丝粒常常需要确定它来自何条染色体色体,而用方法一所得
9、的着丝粒也要作进一步确证。定位方而用方法一所得的着丝粒也要作进一步确证。定位方法所依据的原理之一是当一着丝粒侧的法所依据的原理之一是当一着丝粒侧的DNA与一标记基因连与一标记基因连接后转化酵母细胞接后转化酵母细胞,该该DNA可以借助于与染色体同源序列插可以借助于与染色体同源序列插入到染色体中，从而导致原染色体中基因连锁关系发生变化。入到染色体中，从而导致原染色体中基因连锁关系发生变化。如何检测出该如何检测出该DNA插入到那条染色体中，可用下述方法插入到那条染色体中，可用下述方法:1)2染色体丢失作图法染色体丢失作图法（2chromosome-lossmappingtechnique）已有实验表
10、明：已有实验表明：当一条染色体上携带着当一条染色体上携带着2质粒质粒DNA时时，可能导致两种结果产生可能导致两种结果产生：整条染色体丢失；整条染色体丢失；有丝分裂的有丝分裂的纯性化，即远端与插入的遗传标记发生重组，从而导致两者纯性化，即远端与插入的遗传标记发生重组，从而导致两者间的间的DNA片段丢失。在二倍体中，这种现象的发生常常导片段丢失。在二倍体中，这种现象的发生常常导致隐性标记基因的出现。致隐性标记基因的出现。1.3KbSalI-Bgl片段片段+YEp24YEp24/1.3BamHI酶切酶切线状线状DNA转化转化酵母（酵母（Ura-）Ura+转化体转化体选择稳定转化体选择稳定转化体核酸杂
11、交（核酸杂交（pBR322为探针）为探针）与具不同表型菌株交配与具不同表型菌株交配二倍体二倍体完全培养基上完全培养基上15-20代代涂布在完全培养基上涂布在完全培养基上影印到无尿嘧啶合成培养基上影印到无尿嘧啶合成培养基上Ura-二倍二倍体体检测其它缺陷型基因检测其它缺陷型基因当上述片段经过这个方法检测后发现当上述片段经过这个方法检测后发现his1出现，表明该片段出现，表明该片段位于染色体位于染色体V上。上。2)四分体分析四分体分析（tetradanalysis）1.3KbSalI-Bgl片段片段+pSZ57pSZ57/1.3BamHI酶切酶切线状线状DNA转化酵转化酵母（母（Leu-）选择稳定
12、选择稳定Leu+转化子转化子核酸杂交核酸杂交与不同表型菌株交配与不同表型菌株交配二倍体二倍体孢子形成孢子形成分离孢子分离孢子检查表型检查表型LEU2总是与总是与ura3和和his1连锁在一起，而后两个基因位于第五条染色体上。连锁在一起，而后两个基因位于第五条染色体上。第五节第五节端粒端粒DNA的分离与鉴定的分离与鉴定一一.四膜虫四膜虫(Tetrahymena)rDNA的端粒结的端粒结构构四膜虫中存在着许多线状的染色体外四膜虫中存在着许多线状的染色体外DNA。由于这种由于这种DNA分分子携带着子携带着rRNA基因，因而称之为基因，因而称之为rDNA。每个单倍体细胞含有每个单倍体细胞含有200个拷
13、贝，每个个拷贝，每个rDNA的长度为的长度为21Kb。这种这种DNA具有以下对称具有以下对称结构：结构：如何检测端粒的这种结构如何检测端粒的这种结构?方法一方法一：rDNA+E.coliDNApolI+dNTP（一种一种dNTP带带标记）标记）不同限制酶切不同限制酶切凝胶电泳凝胶电泳放射自显影放射自显影方法二方法二：rDNA+E.coliDNApolI+一种一种-32PdNTP只有使用只有使用-32PdCTP时才能掺入到时才能掺入到DNA链中去。链中去。二二.线状质粒的构建线状质粒的构建转化转化Leu-酵母菌株酵母菌株Leu+转化子转化子分离非稳定转化子分离非稳定转化子分离转化子中质分离转化子
14、中质粒和鉴定粒和鉴定检测末端结构检测末端结构线状质粒线状质粒pSZ216可用于酵母端粒可用于酵母端粒DNA片段的分片段的分离离pSZ2167.4Kb片段（含片段（含LEU2基因）基因）重组分子重组分子转化酵母细胞（转化酵母细胞（Leu-）酵母酵母DNADNA片段片段LeuLeu + +转化体转化体不稳定转化体不稳定转化体分离线状质粒分离线状质粒DNADNA分析大小，凡是插入片段分析大小，凡是插入片段小于小于4.2 4.2 KbKb片段可能是端粒片段可能是端粒DNADNA利用带标记的利用带标记的dCTPdCTP( (或其它或其它dNTPdNTP) ) 检测是否具检测是否具有典型的端粒结构有典型的端粒结构进一步鉴定进一步鉴定PvuIPvuI三三.酵母端粒的分离与鉴定酵母端粒的分离与鉴定如果一线状质粒如果一线状质粒DNA只含有一个端粒，当此只含有一个端粒，当此DNA转入宿转入宿主细胞后，其结果是形成环状主细胞后，其结果是形成环状DNA或插入染色体或插入染色体DNA。
