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1、绪绪 论论第五章 细胞培养与 次生产物生产第四章 植物主要 组织培养技术第八章 人工种子第六章 原生质体培养第二章 细胞全能性 与形态发生第七章 体细胞杂交第一章基本技术第九章 种质贮藏第十章 动物细胞工程第三章体细胞遗传变异1第二章细胞全能性与形态发生细胞全能性及其表达器官发生体细胞胚胎发生2第一节细胞全能性及其表达细胞全能性概述细胞全能性概述细胞脱分化细胞脱分化细胞再分化细胞再分化3一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。能性。细胞全能性的绝对性与相对性细胞全能性的绝对性与相对性:v不是所有基因型的所有细胞在任何
2、条件下都具有良好的培养不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应反应;v即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体均可以直接产生植物个体;动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。一.细胞全能性概述4植物细胞按照分裂能力分为三类：植物细胞按照分裂能力分为三类：第一类是始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个第一类是始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期的周期细胞。如茎尖、根尖及形成层细胞；周期的周期细胞。如茎尖、根尖及形成层细胞；第二类是永久失去分裂
3、能力的细胞，为终端分化细胞。第二类是永久失去分裂能力的细胞，为终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞；如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞；第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的可重新启动分裂的G0细胞。表皮细胞及各种薄壁细胞。细胞。表皮细胞及各种薄壁细胞。5一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。于它在自然部位上所处位置和生理状态。不同类型植物细胞向分生状态回复可能进行的程度趋势不同类型植物细胞向分生状态回复可能进行
4、的程度趋势营养生长中心营养生长中心形成层形成层薄壁细胞薄壁细胞厚壁细胞厚壁细胞退化细胞退化细胞6植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心营养生长中心形成层形成层薄壁细胞薄壁细胞厚壁细胞厚壁细胞(木质化木质化细胞细胞)特化细胞特化细胞(筛管、导管细胞筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织顶端分生组织居间分生组织居间分生组织侧生分生组织侧生分生组织薄壁组薄壁组织织(基本组织基本组织)厚角组织厚角组织输导组织输导组织厚壁组织。厚壁组织。7细胞全能性细胞全能性脱脱分化分化再再分化分化细
5、胞分裂细胞分裂个体再生个体再生细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。的最终体现。8二.细胞脱分化细胞生理与结构变化细胞脱分化调控机理细胞分裂与愈伤组织形成9培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化（dedifferentiation）。）。离体培养下，脱分化过程发生在第
6、一次有丝分裂离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前之前。静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。标志。细胞脱分化过程中生理和结构变化10薄壁细胞：细胞核较小，核位于细胞边缘，细胞中央有大的液泡，细胞体内核糖体密度较低，多聚核糖体数目较少，质体为分化程度较高的叶绿体、杂色体、白色体和淀粉体。脱分化细胞： 细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。在这些变化中，液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。 11根据脱分化细胞过程中细胞结构发生变化的时空根据脱分化细胞过程中细胞结构发生变化的时
7、空顺序，细胞的脱分化过程可分为顺序，细胞的脱分化过程可分为3个阶段：个阶段：第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；质体演变成原质体；第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。细胞分裂即将开始。12细胞脱分化的调控机理细胞周期对脱分化的调控细胞周期对脱分化的调控激素诱导表达基因激素诱导表达
8、基因与细胞脱分化与细胞脱分化促分裂肽的发现及其促分裂肽的发现及其对细胞脱分化的影响对细胞脱分化的影响细胞脱分化与染色细胞脱分化与染色体解凝聚体解凝聚13细胞脱分化调控的实质即是细胞脱分化调控的实质即是G0期细胞回复到分裂周期的期细胞回复到分裂周期的调控过程调控过程20世纪世纪70年代，研究者发现在哺乳动物细胞年代，研究者发现在哺乳动物细胞G1期中，存期中，存在有特定的调控点，称为在有特定的调控点，称为“限制点限制点”（Rpoint）。）。在这在这个点之前，如果缺少外界生长信号（通常是肽生长因子）个点之前，如果缺少外界生长信号（通常是肽生长因子）或某些必需的营养成分（如必需氨基酸），细胞会终止或
9、某些必需的营养成分（如必需氨基酸），细胞会终止其其G1期的进程，进入静止状态称为期的进程，进入静止状态称为G0期，一旦补充了所期，一旦补充了所缺少的因子之后，细胞即会从缺少的因子之后，细胞即会从G0期回到期回到G1期继续分裂周期继续分裂周期。期。142001年度的诺贝尔生理学及医学奖获得者，美国科年度的诺贝尔生理学及医学奖获得者，美国科学家学家Hartwell与英国科学家与英国科学家Hunt和和Nurse的工作揭开的工作揭开了这一过程的调控机制。了这一过程的调控机制。细胞周期蛋白（细胞周期蛋白（cyclin）和依赖周期蛋白激酶和依赖周期蛋白激酶(CDKcyclin-dependentkinas
10、e)是两类主要的调控分子。细是两类主要的调控分子。细胞周期运行的动力主要来自胞周期运行的动力主要来自CDK，其活性则主要通其活性则主要通过过cyclin调节和依赖周期蛋白抑制子（调节和依赖周期蛋白抑制子（CKIcyclin-dependentkinaseinhibitor）的负调节。的负调节。15CyclinCyclinCyclinp34CKICKIp34p34p34Cyclin-M16171819植物细胞周期的调控主要有植物细胞周期的调控主要有2类类CDK（CDKa、CDKb）和和2类类cyclin（CycB、CycD）。）。在环境或激素等外界条在环境或激素等外界条件作用下，件作用下，Cyc
11、D基因首先表达生成基因首先表达生成CycD，在相关调节在相关调节因子的帮助下因子的帮助下CycD与与CDKa结合形成结合形成CDKa/CycD复合复合体使体使CDKa活化，进而对活化，进而对Rb（G1期限制点调控分子）磷期限制点调控分子）磷酸化，使细胞通过酸化，使细胞通过“限制点限制点”进入分裂周期。当细胞进进入分裂周期。当细胞进入分裂周期后，则入分裂周期后，则由由CDKb与与CycB以及相关的调节蛋白以及相关的调节蛋白完成从完成从S期到期到M期的调控。期的调控。2021植物激素是离体培养中所必需的条件，因此与植物激素植物激素是离体培养中所必需的条件，因此与植物激素相关的基因表达被认为是启动细
12、胞脱分化的关键。相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。Takahashi等（等（1989）从一个叶肉原生质体）从一个叶肉原生质体cDNA文库中文库中分离到一个分离到一个2,4-D诱导表达的基因，命名为诱导表达的基因，命名为par (prostateapoptosisresponse)。par基因在细胞从基因在细胞从G0期期转入转入S期的早期启动中具有功能性作用。期的早期启动中具有功能性作用。Kyo等克隆了一组花粉富含硫蛋白等克隆了一组花粉富含硫蛋白(pollen-abundantphosphoproteins)基因基因(Nicotiana tabacum embryogenic poll
13、en) NtEPa，NtEPb，NtEPc。其中其中NtEPc的表达与花的表达与花粉细胞脱分化转变为胚性细胞高度偶联，认为该基因参粉细胞脱分化转变为胚性细胞高度偶联，认为该基因参与花粉细胞培养中细胞脱分化的过程但不参与细胞进入与花粉细胞培养中细胞脱分化的过程但不参与细胞进入分裂周期后的调控过程。分裂周期后的调控过程。22现有研究证明，植物细胞感受生长素的信号是由现有研究证明，植物细胞感受生长素的信号是由生长素受体（生长素受体（auxinreceptor）和生长素分子相和生长素分子相结合，使生长素受体被活化而完成的，这一过程结合，使生长素受体被活化而完成的，这一过程称为生长素感应称为生长素感应(
14、perception)。激活的受体可能引起某些特定的反应，如某些离激活的受体可能引起某些特定的反应，如某些离子的吸收或释放、特定蛋白的磷酸化或去磷酸化子的吸收或释放、特定蛋白的磷酸化或去磷酸化等，进而引起一系列连锁信号传导反应，最终导等，进而引起一系列连锁信号传导反应，最终导致生长素诱导的基因表达。致生长素诱导的基因表达。231996年，日本学者年，日本学者Matsubyashi等从石刁柏培养细胞的等从石刁柏培养细胞的培养液条件化培养基培养液条件化培养基(conditionedmedium，CM)中中发现了发现了PSK，它可以促进细胞的生长和它可以促进细胞的生长和增殖增殖。植物磺肽素植物磺肽素
15、(phytosulfokine，简写简写PSK)是一种新型是一种新型植物肽类生长调节物质。它是两种短肽类物质植物肽类生长调节物质。它是两种短肽类物质磺磺化的四肽化的四肽(PSK-)或五肽或五肽(PSK-)，其结构为其结构为H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-OH或或H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OH24检测分析发现，在同时有检测分析发现，在同时有NAA和和BA存在的条件存在的条件下，第一次细胞分裂发生在培养下，第一次细胞分裂发生在培养96小时，而培小时，而培养养48小时即可检测到小时即可检测到PSK，在培养基没有在培养基没有NAA和
16、和BA的培养细胞中，检测不到的培养细胞中，检测不到PSK的存的存在，同时细胞也停留在在，同时细胞也停留在G0/G1期而不能启动分裂，期而不能启动分裂，由此推测，由此推测，PSK可能介导了与生长素和细胞分可能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关的信号传导途径裂素密切相关的信号传导途径25 -萘乙酸萘乙酸，NAAC12H10O2-NaphthaleneaceticAcid6-苄胺基嘌呤苄胺基嘌呤,BAC12H11N56-Benzylaminopurine26进一步研究表明，水稻细胞质膜存在有进一步研究表明，水稻细胞质膜存在有PSK的蛋白质的蛋白质受体，已分离的蛋白质受体为受体，已分离的蛋白质受体为1
17、20kD和和160kD的膜蛋白。的膜蛋白。烟草细胞纯化的烟草细胞纯化的120kD蛋白为一受体激酶，含有一个胞蛋白为一受体激酶，含有一个胞外富亮氨酸重复结构域和一个信号转导结构域，与外富亮氨酸重复结构域和一个信号转导结构域，与PSK高度亲合，显示高度亲合，显示PSK和和120kD受体激酶是一活跃的配体受体激酶是一活跃的配体受体对受体对。过量表达受体蛋白基因，能显著提高愈伤组过量表达受体蛋白基因，能显著提高愈伤组织生长织生长27烟草叶肉细胞脱分化过程中染色体有烟草叶肉细胞脱分化过程中染色体有2次解凝聚次解凝聚过程。过程。第一次解凝聚发生在细胞壁酶解过程中第一次解凝聚发生在细胞壁酶解过程中第二次解凝
18、聚发生在原生质体在含有生长素和细胞分裂第二次解凝聚发生在原生质体在含有生长素和细胞分裂素的培养基中诱导培养素的培养基中诱导培养36小时小时第二次解凝聚对于细胞进入第二次解凝聚对于细胞进入S期是十分重要的，发生二次期是十分重要的，发生二次解凝聚的细胞在培养解凝聚的细胞在培养72小时后即进入小时后即进入S期，在不含植物激期，在不含植物激素的培养基中细胞，染色体不发生第二次解凝聚，以后素的培养基中细胞，染色体不发生第二次解凝聚，以后迅速死亡。迅速死亡。第一次染色体解凝聚是细胞脱分化的转换过程，通过此第一次染色体解凝聚是细胞脱分化的转换过程，通过此过程细胞关闭分化状态，而第二次解凝聚则是有丝分裂过程细
19、胞关闭分化状态，而第二次解凝聚则是有丝分裂周期衔接过程。周期衔接过程。28PIfluorescence29细胞脱分化与愈伤组织形成细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂，导致细胞分裂，在一个细胞群体培养或组织器官培养体系中，有时很难在一个细胞群体培养或组织器官培养体系中，有时很难区分细胞脱分化与进入增殖状态的界限。区分细胞脱分化与进入增殖状态的界限。对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂显然是发生在细对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂显然是发生在细胞完全脱分化之后胞完全脱分化之后细胞初期分裂方式与外植体细胞类型有关，如果外植体细
20、胞初期分裂方式与外植体细胞类型有关，如果外植体细胞均为正常二倍体细胞，第一次分裂通常是有丝分裂，细胞均为正常二倍体细胞，第一次分裂通常是有丝分裂，如果外植体含有高倍化细胞，脱分化的第一次分裂可能如果外植体含有高倍化细胞，脱分化的第一次分裂可能是无丝分裂。是无丝分裂。30器官，组织培养时细胞分裂首先发生在伤口部位培养3天培养5天培养7天31脱分化与愈伤组织的形成在性质上是不能等同的，脱分脱分化与愈伤组织的形成在性质上是不能等同的，脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。中的一个阶段。尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大
21、多数情况下是尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大多数情况下是形成愈伤组织，但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织，但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织，许多试验表明，有些外植体的细胞脱分化以形成愈伤组织，许多试验表明，有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。愈伤组织内的细胞并不是均一未分化的，即同一愈伤组织内愈伤组织内的细胞并不是均一未分化的，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定差异，特别是在组织器官培养时，的细胞之间其状态存在一定差异，特别是在组织器官培养时，往往出现部分细胞不完全脱分化的现象，从而使其
22、很容易再往往出现部分细胞不完全脱分化的现象，从而使其很容易再分化再生植株，这对培养来说无疑是十分有利的。分化再生植株，这对培养来说无疑是十分有利的。32三.细胞再分化所谓细胞分化（所谓细胞分化（Differentiation），），是指导致细是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。改变的过程。一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化；能，这是在时间上的分化；同一种细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异同一种细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态和
23、机能，这是在空间上的分化。的形态和机能，这是在空间上的分化。33从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的各种不同的表现型。所反应的各种不同的表现型。在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，因其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，因此，
24、通常把离体培养下的这一过程称为再分化此，通常把离体培养下的这一过程称为再分化（redifferentiation）。）。34细胞分化与细胞分化与基因组变化基因组变化TETE分化及其分化及其调控调控激素在细胞分激素在细胞分化中的作用化中的作用极性与细胞极性与细胞分化分化35染色体的反复复制染色体的反复复制DNA的差异扩增的差异扩增基因重排基因重排基因表达产物及其调控与修饰是细胞分化的本质所在。基因表达产物及其调控与修饰是细胞分化的本质所在。越来越多的研究显示，细胞分化主要受基因在转录水平越来越多的研究显示，细胞分化主要受基因在转录水平和转录后水平的调控，其中一些特异蛋白基因的表达调和转录后水平的
25、调控，其中一些特异蛋白基因的表达调节在细胞分化过程中起到了重要作用节在细胞分化过程中起到了重要作用细胞分化中的基因组变化36极性（极性（polarity）是植物细胞分化中的一个基本现象。是植物细胞分化中的一个基本现象。所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。标志。极性与细胞分化37 墨角藻(Fucus)合子细胞不均等分裂及其早期发育（引
26、自Bouget等，1998）极性建立与质膜离子通道的不对称分布和细胞周质微管重排有关38通常把离体培养中通常把离体培养中TE（TEtrachearyelements,管状分子管状分子）细胞细胞的出现作为组织分化的标志的出现作为组织分化的标志而极性的建立似乎又是维管发生的一个信号，极性建立后生长而极性的建立似乎又是维管发生的一个信号，极性建立后生长素按极性方向流动，导致素按极性方向流动，导致TE细胞分化细胞分化由于由于TE细胞在分化过程中具有细胞壁加厚，原生质体自溶等容细胞在分化过程中具有细胞壁加厚，原生质体自溶等容易观察的细胞特征，从而又为植物细胞分化研究提供了模式体易观察的细胞特征，从而又为
27、植物细胞分化研究提供了模式体系系TE的形成与细胞分化39百日草叶肉细胞向TE细胞分化的主要调控过程（引自Fukuda，1997）40由百日草叶肉细胞分化形成的TE细胞（引自Motose,2001）41百日草叶肉细胞向TE分化过程中的基因表达分析（引自Demura等，2002）42激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。此外，在有些试验中也显示，此外，在有些试验中也显示，GA3、AB
28、A、乙烯乙烯等也在细胞分化中起到一定调节作用。等也在细胞分化中起到一定调节作用。激素对细胞分化的调控作用43Gibberellicacid,GA3C19H22O6赤霉素,赤霉酸,920AbscisicAcid,ABAC15H20O4脱落酸;休眠酸;脱落素;44Gibberellicacid,GA3C19H22O6赤霉素,赤霉酸,920451949年，法国植物学家年，法国植物学家Camus，把一种菊苣小的营养芽嫁接在其根把一种菊苣小的营养芽嫁接在其根的组织培养物的上表面，几天以后，处于芽下的薄壁细胞中分化出的组织培养物的上表面，几天以后，处于芽下的薄壁细胞中分化出了维管束。这些维管束与芽的维管组
29、织相接在一起。同时，他在愈了维管束。这些维管束与芽的维管组织相接在一起。同时，他在愈伤组织表面放置一片玻璃纸，在玻璃纸上再放置芽，切段了愈伤组伤组织表面放置一片玻璃纸，在玻璃纸上再放置芽，切段了愈伤组织与芽之间的直接接触，结果维管组织的分化依然发生。这个试验织与芽之间的直接接触，结果维管组织的分化依然发生。这个试验表明，芽对维管组织的分化有刺激作用，这种刺激作用必然是由一表明，芽对维管组织的分化有刺激作用，这种刺激作用必然是由一种或几种扩散性的化学物质引起的。种或几种扩散性的化学物质引起的。46在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和
30、分化具有同等重要的协同作用，素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。要调节作用。47在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样。如果先用生长素的顺序不同，其作用也不一样。如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提
31、高。48Dominov等（等（1992）从一个烟草的悬浮培养细胞系中）从一个烟草的悬浮培养细胞系中分离到一个同时可被生长素和细胞分裂素诱导表达到分离到一个同时可被生长素和细胞分裂素诱导表达到cDNApLS216(原发性脾脏恶性淋巴瘤原发性脾脏恶性淋巴瘤)在诱导表达试验中显示，只加入生长素（在诱导表达试验中显示，只加入生长素（2,4-D）只引起只引起mRNA短暂积累，而加入外源细胞分裂素（短暂积累，而加入外源细胞分裂素（BA）引起的转引起的转录积累虽发生时间较迟，但可持续转录，因此他们也认为细录积累虽发生时间较迟，但可持续转录，因此他们也认为细胞分裂素可能增加了细胞对生长素的敏感性，或者能阻断生
32、胞分裂素可能增加了细胞对生长素的敏感性，或者能阻断生长素的反馈抑制。长素的反馈抑制。49另一个生长素诱导表达基因是另一个生长素诱导表达基因是p48h-10。在百日草叶肉细胞培养在百日草叶肉细胞培养中，单独使用中，单独使用IAA时，在培养时，在培养48小时后才检测到小时后才检测到p48h-10的表达，的表达，而而与与BA同时使用时，培养同时使用时，培养24小时即可检测到该基因地表达，只小时即可检测到该基因地表达，只使用使用BA则不能启动该基因地表达。则不能启动该基因地表达。组织印迹显示，组织印迹显示，p48h-10只在茎和根的维管束中表达，在分生组只在茎和根的维管束中表达，在分生组织中该基因不表
33、达（织中该基因不表达（Ye和和Varner，1994）。）。这一结果较直接的证这一结果较直接的证明了生长素与细胞分裂素在细胞分化中的协同调控作用。明了生长素与细胞分裂素在细胞分化中的协同调控作用。50吲哚吲哚-3-乙酸乙酸(IAA)C10H9NO2Indole-3-aceticacid2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸(2,4-D)C8H6Cl2O32,4-Dichlorophenoxyaceticacid51除了生长素和细胞分裂素外，赤霉酸（除了生长素和细胞分裂素外，赤霉酸（GA）、）、乙烯乙烯（EL）、）、脱落酸（脱落酸（ABA）、）、油菜素内酯（油菜素内酯（BRbrassinosteroi
34、d）等植物激素在细胞分化中的作用也有等植物激素在细胞分化中的作用也有报道。报道。越来越多的研究显示，植物激素对细胞生长与分化的调越来越多的研究显示，植物激素对细胞生长与分化的调控是一个复杂的级联调控过程，离体培养条件下，由于控是一个复杂的级联调控过程，离体培养条件下，由于外植体细胞所处的生理状态不同以及内源激素水平的差外植体细胞所处的生理状态不同以及内源激素水平的差异，试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可异，试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困难的。能是很困难的。52油菜素内酯油菜素内酯;芸苔素内酯芸苔素内酯;24-表表-芸苔素内酯芸苔素内酯;2,3,22R,23-S-
35、四羟基四羟基-21R-甲基甲基-高高-7-氧杂氧杂-5胆胆甾烷甾烷-6酮酮;C28H48O6BR(brassinolide;Brassins;Brassinosteroid;R-epibrassinolide)53细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程，了解这一过程的调控机理，最终是为再生的基本过程，了解这一过程的调控机理，最终是为再生个体奠定基础。个体奠定基础。生物个体形成是通过形态发生（生物个体形成是通过形态发生（morphogenesis）实实现的，建立在离体培养基础上的形态发生称之为体细胞现的，建立在离体培养基础上的形
36、态发生称之为体细胞形态发生（形态发生（somaticmorphogenesis）。）。体细胞形态发体细胞形态发生过程及其调控机理是细胞工程学研究的核心内容。生过程及其调控机理是细胞工程学研究的核心内容。54第二节器官发生植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、）、不定芽不定芽（adventitiousshoots）等器官的过程。等器官的过程。55器官发生方式器官发生方式器官发生过程器官发生过程起始材料起始材料对器官分化对器官分化的影响的影响激素对器官激
37、素对器官分化的调控分化的调控光照对器官光照对器官分化的影响分化的影响器官分化的器官分化的基因调控基因调控56先芽后根先芽后根先根后芽先根后芽根芽同步发生根芽同步发生器官发生方式57经过愈伤组织的器官发生不经过愈伤组织的器官发生器官发生过程58经过愈伤组织的器官发生过程愈伤组织形成愈伤组织形成生长中心形成生长中心形成器官原基及器官形成器官原基及器官形成59愈伤组织形成愈伤组织形成60生长中心形成生长中心形成61芽形成芽形成62芽芽外外生生芽芽内内生生63不经过愈伤组织的器官发生在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基，这一途径有两种
38、情况：器官原基，这一途径有两种情况：一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。为目的的离体培养中具有重要的实践意义。64茎尖
39、培养中茎尖培养中芽形成芽形成外植体直接外植体直接发生芽发生芽65a. 细胞第一次平周分裂b.生长 中心形成c.原 初 分生组织d.芽 原 基形成66外植体的类型母体植物的遗传基础起始材料对器官分化的影响67总体上说，被子植物比裸子植物容易培养，在被子植物总体上说，被子植物比裸子植物容易培养，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。通常情况下，自然繁殖以科植物培养成功的报道最多。通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力的能
40、力同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异已是不争的事实。已是不争的事实。基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。愈伤组织诱导的差异。68不同基因型大豆上胚轴器官分化能力不同基因型大豆上胚轴器官分化能力基因型基因型（品种（品种/自交系）自交系）愈伤组织愈伤组织诱导率（）诱导率（）器官分化率（）器官分化率（）资料来源资料来源汾豆汾豆339434程林梅等，程林梅等，2001晋豆晋豆199328晋遗晋遗219122晋豆晋豆119320汾豆汾豆389323汾豆汾豆1793
41、23汾豆汾豆519216晋早晋早125911269玉米不同自交系幼胚培养器官分化能力玉米不同自交系幼胚培养器官分化能力基因型基因型愈伤组织愈伤组织诱导率（）诱导率（）器官分化率器官分化率（）（）资料来源资料来源34010078杜娟等，杜娟等，2002792210086Mol17100624112100538902100578461003847710047吉吉85310011吉吉921100324441000.470外植体对诱导反应及其再生能力的影响体还现在外植体对诱导反应及其再生能力的影响体还现在生理状态上生理状态上来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更来源于生长活跃或生长潜力大的组织
42、、器官的细胞更有利于培养有利于培养对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。还是分化均较容易。一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外植体更易成功。以自然繁殖器官为外植体更易成功。71外植体选外植体选取合理与取合理与否，不仅否，不仅影响培养影响培养的难易，的难易，而且有时而且有时甚至影响甚至影响分化的程分化的程度和器官度和器官类型。类型。花芽花芽营养芽，花芽营养芽，花芽营养芽营养芽TranThanhVan等等，197472激素对器官发生的影响离体培养下的器官
43、分化在大多数情况下是通过外源提离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是生长素与细胞分裂素是2类主要的植物激素，在离体器类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。官分化调控中占有主导地位。GA3,PSK在器官分化中也具有一定调控作用。在器官分化中也具有一定调控作用。73生长素/细胞分裂素高有利于根分化生长素/细胞分裂素低有利于芽分化生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体74离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影
44、响到激素的活性从而影响其培养效果。外源细胞分裂素被外植素的活性从而影响其培养效果。外源细胞分裂素被外植体吸收后，在细胞内被修饰和转化形成活化形式和钝化体吸收后，在细胞内被修饰和转化形成活化形式和钝化形式。一般认为，细胞分裂素自由碱基形式是活性形式，形式。一般认为，细胞分裂素自由碱基形式是活性形式，而核苷形式为钝化形式。而核苷形式为钝化形式。通过细胞分裂素氧化酶对侧链的修饰可能是植物组织细通过细胞分裂素氧化酶对侧链的修饰可能是植物组织细胞中降低细胞分裂素活性的主要机制，在烟草细胞培养胞中降低细胞分裂素活性的主要机制，在烟草细胞培养中使用二氢玉米素比使用玉米素更为有效，可能与二氢中使用二氢玉米素比
45、使用玉米素更为有效，可能与二氢玉米素核糖苷不是细胞分裂素氧化酶的底物有关。玉米素核糖苷不是细胞分裂素氧化酶的底物有关。75生长素进入细胞后，一部分以游离状态存在，另一部分生长素进入细胞后，一部分以游离状态存在，另一部分则与氨基酸结合形成生长素氨基酸复合体。则与氨基酸结合形成生长素氨基酸复合体。与生长素结合的氨基酸主要为天门冬氨酸，也有谷氨酸。与生长素结合的氨基酸主要为天门冬氨酸，也有谷氨酸。2,4-D、NAA、IAA是常用的是常用的3种生长素，种生长素，。Ribnicky等等（1996）的研究显示，由于生长素种类不同，形成生长）的研究显示，由于生长素种类不同，形成生长素素-氨基酸复合体的量具有
46、显著差异，从而亦表现出作氨基酸复合体的量具有显著差异，从而亦表现出作为外源生长素在培养效果上的差异。为外源生长素在培养效果上的差异。76外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量*引自Ribnicky等1996。77光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质队器官分化均有影响。间、强度以及光质队器官分化均有影响。光照对器官分化的影响78连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和
47、形态发生。周期则有利于极性建立和形态发生。培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物不是合成光合产物。光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。从而引起器官分化。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。79基因调控基因调控homebox细胞周期基因细
48、胞周期基因其它其它80Kn1（KNOTTED1）是从玉米中鉴定出的第一个植物是从玉米中鉴定出的第一个植物homebox基基因，因，Kn1-likehomebox（knox）基因又可分为基因又可分为2组（组（classI和和classII），），classIIknox在各种分化组织器官中均表达，而在各种分化组织器官中均表达，而classI knox只在分生组织中表达。在玉米和大麦离体培养中，大量不定只在分生组织中表达。在玉米和大麦离体培养中，大量不定芽生成的部位也检测到芽生成的部位也检测到Kn1基因的大量表达。在一些转基因的大量表达。在一些转Kn1相似相似基因地研究中表明，转基因植株能大量产生复
49、合芽以及不定分生基因地研究中表明，转基因植株能大量产生复合芽以及不定分生组织。组织。STM（SHOOTMERISTEMLESS）基因以及它们的直系同源基因以及它们的直系同源（orthologues）基因均参与了茎尖分生组织的分化调控。基因均参与了茎尖分生组织的分化调控。在转在转Homeobox相关基因的烟草植物中还检测分析到赤霉素含量相关基因的烟草植物中还检测分析到赤霉素含量减少和生长素含量上升的内源激素变化，这也暗示，减少和生长素含量上升的内源激素变化，这也暗示，Homeobox基因可能通过一些调节因子（如激素）介导调控器官分化。基因可能通过一些调节因子（如激素）介导调控器官分化。81植物编
50、码细胞周期依赖性激酶基因植物编码细胞周期依赖性激酶基因cdc2在离体培在离体培养中，调节细胞进入分裂状态的过程起着关键性养中，调节细胞进入分裂状态的过程起着关键性作用，在玉米和大麦离体培养中，作用，在玉米和大麦离体培养中，cdc2的表达高的表达高峰发生在不定芽形成的过程中，在培养初期的表峰发生在不定芽形成的过程中，在培养初期的表达量较少，同时，该基因的表达部位处于分生组达量较少，同时，该基因的表达部位处于分生组织的外层细胞，因此认为，织的外层细胞，因此认为，cdc2基因对分生组织基因对分生组织的形成和维持分生组织状态均有重要作用。的形成和维持分生组织状态均有重要作用。82Banno等（等（20
51、01）从拟）从拟南芥根培养再生芽的体南芥根培养再生芽的体系中克隆了一个增强芽系中克隆了一个增强芽再生能力的基因再生能力的基因ESR1，将该基因与将该基因与35S启动子连启动子连接转化拟南芥，在有细接转化拟南芥，在有细胞分裂素存在的情况下胞分裂素存在的情况下转基因外植体可以显著转基因外植体可以显著提高不定芽的分化率。提高不定芽的分化率。而生长素不能诱导该基而生长素不能诱导该基因表达，同样也不能提因表达，同样也不能提高不定芽分化频率。高不定芽分化频率。83从烟草温度突从烟草温度突变体中鉴定出变体中鉴定出3个与个与离体器官发生有关的离体器官发生有关的基因基因SRD1、SRD2和和SRD3，当它们发生
52、当它们发生隐形突变时，在离体隐形突变时，在离体培养中表现出器官发培养中表现出器官发生在不同时期受阻，生在不同时期受阻，3个基因均定位于拟个基因均定位于拟南芥南芥I号染色体上。号染色体上。84Low等（等（2001）通过）通过RT-PCR技术克隆了一个含有亮氨技术克隆了一个含有亮氨酸拉练基因酸拉练基因bZIP（PKSF1），），该基因编码一个亮氨酸拉该基因编码一个亮氨酸拉链转录因子，其表达发生在芽形成之前，在有不定芽形链转录因子，其表达发生在芽形成之前，在有不定芽形成的愈伤组织中其表达量比非分化愈伤组织高成的愈伤组织中其表达量比非分化愈伤组织高6倍倍85第三节体细胞胚胎发生离体培养下没有经过受精
53、过程，但经过了胚胎发育过程离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。这一定义有以下几方面的界定：这一定义有以下几方面的界定：其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；用，以区别于无融合生殖胚；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官其
54、三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。发生形成个体的途径。86体细胞胚的形成体细胞胚的形成体细胞胚的发育与结构特点体细胞胚的发育与结构特点影响体细胞胚发生的因素影响体细胞胚发生的因素体细胞胚发生的生化与分子基础体细胞胚发生的生化与分子基础87直直接接途途径径间间接接途途径径一.体细胞胚的形成88体细胞胚从外植体上直接发生1.诱导阶段诱导阶段2.胚胎发育阶段胚胎发育阶段89经过愈伤组织的体细胞胚形成经过愈伤组织的体细胞胚形成经过悬浮细胞的体细胞胚形成经过悬浮细胞的体细胞胚形成间接发生90诱导诱导愈伤愈伤组织组织形成形成愈伤组织胚性化愈伤组织胚性化球性胚形成球性胚形
55、成子叶胚期子叶胚期91愈愈伤伤组组织织胚性愈伤组织胚性愈伤组织悬浮培养的胚悬浮培养的胚性细胞团性细胞团球性胚形成球性胚形成成成熟熟子子叶叶胚胚92体细胞胚发育的细胞学特点体细胞胚发育的细胞学特点体细胞胚的结构特点体细胞胚的结构特点二.体细胞胚的发育与结构特点93类似于植物合子胚的发育类似于植物合子胚的发育早期原胚早期原胚发生发生胚胎细胞胚胎细胞发生发生球形胚球形胚形成形成完整胚结完整胚结构形成构形成94类似于动物胚胎早期的发育类似于动物胚胎早期的发育胚胚胎胎细细胞胞发发生生发育早期发育早期2次均等分裂次均等分裂胚胚结结构的构的形成形成95结构特点与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植
56、与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点：株有两个明显的特点：一是体细胞胚具有双极性（一是体细胞胚具有双极性（doulblepolarity）；）；二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔离（所谓的生理隔离（physiologicalisolation）现象。现象。96与合子胚比较：与合子胚比较：合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。正的胚柄只有类似胚柄的结构。合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的
57、依据，体细胞合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，体细胞胚的子叶常不规范。胚的子叶常不规范。与相同植物比较体细胞胚的体积明显小于合子胚，在一些贮与相同植物比较体细胞胚的体积明显小于合子胚，在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异。并且，体细胞胚不能有明藏物质的含量上也存在较大差异。并且，体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程。显的脱水干燥过程。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期胚以后，经过一系列的物合子胚在胚胎发育完全进入子叶期胚以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠，而体细胞胚则直接形成植株，在质积累和脱水就进入休眠，而体细胞胚则直接形成植株，在不同的培养条件和植株种类中，形成植株的胚胎时期有
58、所不不同的培养条件和植株种类中，形成植株的胚胎时期有所不同，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株同，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株。97三.影响体细胞胚发生的因素激素的调控作用激素的调控作用培养基及培养条件的影响培养基及培养条件的影响基因型的影响基因型的影响982,4-D是应用最为广泛的生长素。是应用最为广泛的生长素。2,4-D的应用有着规律性的变化，的应用有着规律性的变化，首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2,4-D的的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素有利于浓度下产生早期胚胎，一般在球形
59、胚形成后，除去生长素有利于体细胞胚的继续发育。体细胞胚的继续发育。现有研究证明，在球形胚期形成的生长素极性运输对于体细胞胚现有研究证明，在球形胚期形成的生长素极性运输对于体细胞胚的进一步发育尤为重要，如果球形胚阻断生长素的极性运输或改的进一步发育尤为重要，如果球形胚阻断生长素的极性运输或改变生长素的极性运输方向，均会影响体细胞胚的正常发育。变生长素的极性运输方向，均会影响体细胞胚的正常发育。激素的调控作用99细胞分裂素对体细胞胚发育的影响研究报道较少，但几细胞分裂素对体细胞胚发育的影响研究报道较少，但几乎所有的有关体细胞胚胎发生的培养基配方中，均有细乎所有的有关体细胞胚胎发生的培养基配方中，均
60、有细胞分裂素的配合使用。细胞分裂素在促进细胞分裂，维胞分裂素的配合使用。细胞分裂素在促进细胞分裂，维持细胞活跃生长中具有重要生理功能，而完成体细胞胚持细胞活跃生长中具有重要生理功能，而完成体细胞胚胎发育细胞分裂是基本前体，当胚胎结构建立后，细胞胎发育细胞分裂是基本前体，当胚胎结构建立后，细胞分裂素对于维持分生组织正常发育具有重要作用。分裂素对于维持分生组织正常发育具有重要作用。100培养基中的氮源亦会显著影响离体条件下的胚胎发生，培养基中的氮源亦会显著影响离体条件下的胚胎发生，据据Halperin和和Wetherell的报道，体细胞胚的产生要求培的报道，体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的
61、还原态氮。养基中含有一定浓度的还原态氮。Vesco和和Guerra在在Feijoa(非油果,凤榴凤榴)植物体细胞胚诱导的试植物体细胞胚诱导的试验也证明，培养基氮源影响体细胞胚的发生频率。在验也证明，培养基氮源影响体细胞胚的发生频率。在NH4+和和NO3-(15 34)的培养基中，每个外植体的体细胞胚可达的培养基中，每个外植体的体细胞胚可达10个以个以上，而培养基只有上，而培养基只有NH4+或或NO3-时，体细胞胚发生频率很低。时，体细胞胚发生频率很低。一些氨基酸可以代替还原态氮的作用，上述一些氨基酸可以代替还原态氮的作用，上述Feijoa植物的体细植物的体细胞胚培养体系，在只含胞胚培养体系，在
62、只含NO3-的培养基中，如果加入的培养基中，如果加入4mM的甘的甘氨酸，可以显著提高体细胞胚的发生频率。氨酸，可以显著提高体细胞胚的发生频率。培养基及培养条件的影响101一些体细胞胚规模生产模式的试验还发现，球形一些体细胞胚规模生产模式的试验还发现，球形胚形成后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显胚形成后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。著促进体细胞胚的进一步发育。Choi等（等（2002）在西伯利亚人参（）在西伯利亚人参（E. senticosus）培培养中证明，在体细胞胚培养后期，降低培养基无机盐养中证明，在体细胞胚培养后期，降低培养基无机盐浓度，可显著提高体细胞
63、胚的成苗率浓度，可显著提高体细胞胚的成苗率。在一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓在一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。102Lee等（等（2001）在改）在改进胡萝卜体细胞胚生进胡萝卜体细胞胚生产程序的试验中，将产程序的试验中，将胚性愈伤组织转入减胚性愈伤组织转入减少浓度的少浓度的MS培养基中培养基中诱导体细胞胚，结果诱导体细胞胚，结果显示，当胚性愈伤组显示，当胚性愈伤组织形成后，在只含织形成后，在只含1/2MS无机盐浓度的无机盐浓度的培养基中，体细胞胚培养基中，体细胞胚形成可以比
64、在形成可以比在MS培养培养基中高基中高3-4倍。倍。103Choi等（等（2002）在西伯）在西伯利亚人参利亚人参(E. senticosus)培养中也证培养中也证明，在体细胞胚培养后明，在体细胞胚培养后期，降低培养基无机盐期，降低培养基无机盐浓度，可显著提高体细浓度，可显著提高体细胞胚的成苗率胞胚的成苗率。104马铃薯不同基因型体细胞胚形成能力比较 基因型的影响105内源激素内源激素调控基因调控基因特异蛋白特异蛋白四.体细胞胚胎发生的生化与分子基础106外源生长素的对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节外源生长素的对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用
65、的。内源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。Ribnicky等在胡萝卜上胚轴培养中证明，体细胞胚形成初期细等在胡萝卜上胚轴培养中证明，体细胞胚形成初期细胞内具有较高浓度的游离态生长素，外源胞内具有较高浓度的游离态生长素，外源2,4-D和和NAA比比IAA诱导体细胞胚效果好，体细胞胚诱导初期，细胞内高浓度的诱导体细胞胚效果好，体细胞胚诱导初期，细胞内高浓度的游离生长素是必要条件，直接添加外源游离生长素是必要条件，直接添加外源IAA对其合成有反馈抑对其合成有反馈抑制，从而也影响体细胞胚的形成，而制，从而也影响体细胞胚的形成，而2,4-D对对IAA的合成不存的合成不存在反馈抑制，其结果也提高
66、了体细胞胚的发生频率。在反馈抑制，其结果也提高了体细胞胚的发生频率。水稻胚性细胞的诱导也证明，高浓度的水稻胚性细胞的诱导也证明，高浓度的2,4-D引诱导细胞内引诱导细胞内IAA含量升高，当加入外源含量升高，当加入外源IAA或阻止细胞内或阻止细胞内IAA渗出而提高渗出而提高细胞细胞内内IAA含量时，均可促进胚性愈伤组织形成。含量时，均可促进胚性愈伤组织形成。内源激素107胡萝卜胚发育过程中内源胡萝卜胚发育过程中内源IAAIAA的变化的变化发育时期发育时期胚大小胚大小（m）IAA浓度（浓度（ng/gFW）自由态自由态结合肽结合肽总含量总含量受精前子房受精前子房受精前子房受精前子房受精后子房受精后子
67、房受精后子房受精后子房球球形形胚胚晚晚期期/ /心心形形胚胚早期早期鱼雷形胚早期鱼雷形胚早期鱼雷形胚晚期鱼雷形胚晚期75-12575-125125-225400-500900-110015428560869504522060696245274225742419625634986595106348274903440824386796292227241319904835594582156746395504126848392823289内源激素108生长素不仅影响体细胞胚的早期发生，同时也影响体细生长素不仅影响体细胞胚的早期发生，同时也影响体细胞胚的后期发育。生长素对体细胞胚后期发育的影响是胞胚的后
68、期发育。生长素对体细胞胚后期发育的影响是通过极性运输实现的。通过极性运输实现的。在合子胚的发育中，这种极性运输严重影响胚形态的建立。在合子胚的发育中，这种极性运输严重影响胚形态的建立。Liu等（等（1993）利用拟南芥幼胚培养体系，揭示了生长素极性）利用拟南芥幼胚培养体系，揭示了生长素极性运输由球形胚期得轴向对称转向心形胚期的两侧对称的过程，运输由球形胚期得轴向对称转向心形胚期的两侧对称的过程，如果这一过程受阻，则导致子叶异常发育成筒状子叶，而不如果这一过程受阻，则导致子叶异常发育成筒状子叶，而不是正常的是正常的2个子叶。个子叶。在生长素极性运输突变在生长素极性运输突变体体pin1中证实了上述
69、结果，已克隆的中证实了上述结果，已克隆的pin同源基因研究显示，生长素的极性运输及其对胚胎发育的同源基因研究显示，生长素的极性运输及其对胚胎发育的调控，是一系列胚胎发育相关基因有序表达到结果。调控，是一系列胚胎发育相关基因有序表达到结果。内源激素109有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分的变化，尽管不有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分的变化，尽管不同研究在绝对含量上不尽相同，但总体趋势均表现出体同研究在绝对含量上不尽相同，但总体趋势均表现出体细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加。细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加。李中奎等（李中奎等（1993）比较水稻胚性与非胚性愈伤组织的蛋白质）比较水稻胚性与非
70、胚性愈伤组织的蛋白质含量变化显示，两种愈伤组织蛋白质含量的差异主要表现为含量变化显示，两种愈伤组织蛋白质含量的差异主要表现为胚性愈伤组织的水溶性和盐溶性蛋白高于非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织的水溶性和盐溶性蛋白高于非胚性愈伤组织，而醇溶性蛋白则低于非胚性愈伤组织而醇溶性蛋白则低于非胚性愈伤组织。特异蛋白110水稻不同愈伤组织（干重）可溶性蛋白质含量（g/mg）可溶性蛋白质可溶性蛋白质胚性愈伤组织胚性愈伤组织非胚性愈伤组织非胚性愈伤组织继代继代10次的次的愈伤组织愈伤组织水溶性蛋白质水溶性蛋白质盐溶性蛋白质盐溶性蛋白质醇溶性蛋白质醇溶性蛋白质碱溶性蛋白质碱溶性蛋白质136.330.010.613.
71、294.517.614.414.4115.324.510.913.6特异蛋白111伴随体细胞胚发育的特异蛋白伴随体细胞胚发育的特异蛋白植物植物特异蛋白特异蛋白蛋白类型蛋白类型资料来源资料来源胡箩卜胡箩卜E1,E2未知未知Sung和和Okimoto（1983）苜宿苜宿50KD膜膜蛋白蛋白小麦，小麦，枸杞枸杞49KD,35KD未知未知邢更生等邢更生等（1999）水稻水稻51KD,68KD未知未知方继朝等方继朝等 （1994）特异蛋白112阿拉伯半乳糖蛋白（阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）是植物中广泛存在的糖蛋白，大多是植物中广泛存在的糖蛋白，大多数数AGPs存在有存在有Ala-Hyp重复序列或类似重复
72、序列，暗示重复序列或类似重复序列，暗示AGPs可可能作为调控蛋白调控某些基因的转录。能作为调控蛋白调控某些基因的转录。在细胞中，在细胞中，AGPs主要分布在细胞壁和质膜上，利用一系列单克主要分布在细胞壁和质膜上，利用一系列单克隆抗体已鉴定出一些与特殊发育相关和特殊组织相关隆抗体已鉴定出一些与特殊发育相关和特殊组织相关的的AGPs，其中与单克隆抗体其中与单克隆抗体JIM8抗体结合的抗体结合的AGPs在油菜中主要存在性细在油菜中主要存在性细胞中、胚胎发育早期的胚柄中。胞中、胚胎发育早期的胚柄中。在胡萝卜体细胞胚发育中，这种抗体检测的在胡萝卜体细胞胚发育中，这种抗体检测的AGPs存在于胚性细存在于胚
73、性细胞和早期体细胞胚中，在非胚性细胞中没有胞和早期体细胞胚中，在非胚性细胞中没有AGPs，如果在一些如果在一些非胚性悬浮细胞系中加入这类非胚性悬浮细胞系中加入这类AGPs，则可使其恢复胚胎发生能则可使其恢复胚胎发生能力，显示力，显示AGPs在植物体细胞胚发生过程中起到了调控作用。在植物体细胞胚发生过程中起到了调控作用。特异蛋白113近年来的研究发现，某些病程相关蛋白可能也与体细胞近年来的研究发现，某些病程相关蛋白可能也与体细胞胚的形成有关。胚的形成有关。vanHengel（1998）在胡萝卜悬浮培养细胞衍生的原生质体培在胡萝卜悬浮培养细胞衍生的原生质体培养诱导体细胞胚过程中，随着体细胞胚的形成
74、在培养基中检养诱导体细胞胚过程中，随着体细胞胚的形成在培养基中检测到几丁酯酶（测到几丁酯酶（chitinases）和）和AGPs的积累；的积累；Dubois等（等（1991）在菊芋的体细胞胚诱导中发现，）在菊芋的体细胞胚诱导中发现，-1,3-葡聚葡聚糖酶（糖酶（-1,3-glucanases）与愈伤葡聚糖降解有关，推测该酶与愈伤葡聚糖降解有关，推测该酶可能与体细胞胚形成有关。可能与体细胞胚形成有关。Helleboid等（等（2000）在菊芋悬浮细胞培养中比较了胚性和非）在菊芋悬浮细胞培养中比较了胚性和非胚性细胞蛋白质组分差异，结果显示，胚性细胞中胚性细胞蛋白质组分差异，结果显示，胚性细胞中3种
75、不同组种不同组分（分（38kD、32kD、25kD）的蛋白质显著高于非胚性细胞。进的蛋白质显著高于非胚性细胞。进一步分析显示，这些组分的蛋白质主要是一步分析显示，这些组分的蛋白质主要是-1,3-葡聚糖酶、几葡聚糖酶、几丁酯酶和渗透相似蛋白（丁酯酶和渗透相似蛋白（osmotin-likeprotein）。）。特异蛋白114胡萝卜体细胞胚形成相关的部分基因胡萝卜体细胞胚形成相关的部分基因基基因因表达产物表达产物表表达达时时期期资资料料来来源源DC8DC59DC3EMB-1ECP31ECP40EP2EP3DC2.1DC7.1DC9.1EF1-aCEM1Gea14Gea31Gea41LEA(Grp3)
76、OleosinLEA(Grp3)LEA(Grp1)LEA(Grp4)LEA(Grp2)LipidtransferChintinasePro-richproteinGly-richproteinGly-richproteinElongationfactorEF1-aLipidtransferPR-proteinHeat-shock心形胚心形胚心形胚心形胚原胚、球形胚、心形胚原胚、球形胚、心形胚球形胚、心形胚球形胚、心形胚原胚原胚原胚原胚原胚原胚原胚原胚球形胚、心形胚、鱼雷胚球形胚、心形胚、鱼雷胚球形胚、心形胚球形胚、心形胚胚性细胞、原胚胚性细胞、原胚球形胚球形胚原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚原胚、
77、球形胚、心形胚、鱼雷胚胚性细胞、球形胚、心形胚胚性细胞、球形胚、心形胚胚胚性性细细胞胞、球球形形胚胚、心心形形胚胚、鱼鱼雷胚、小植株雷胚、小植株球形胚、心形胚球形胚、心形胚Borrkird等等 ， 1986； Franz等等 ， 1989；Halzopoulos等，等，1990Choi等，等，1987；Hatzopoulos等，等，1990Wilde等，等，1988；Vivekananda等，等，1992Ulrich等，等，1990；Wurtele等，等，1993Kiyosue等，等，1992，1993DeVries等，等，1988；Sterk等，等，1991DeJong等，等，1992Ale
78、ith和和Richter,1990Apuya和和Zimmerman，1992Kawahara等，等，1992Liu等，等，1996调控基因115从已鉴定的基因表达时序分析，可分为从已鉴定的基因表达时序分析，可分为3类：类：第一类是涉及到胚性细胞转变和体细胞胚早期形态建立的基第一类是涉及到胚性细胞转变和体细胞胚早期形态建立的基因，如因，如ECP31、ECP40、EP2、EP3、DC9.1、EF1-a等，这类等，这类基因对体细胞胚的早期发育极为重要，一些突变体分析显示，基因对体细胞胚的早期发育极为重要，一些突变体分析显示，当这些基因突变时，则体细胞胚不能正常形成。当这些基因突变时，则体细胞胚不能正
79、常形成。第二类是体细胞胚胎的整个发生和发育过程中始终表达到基第二类是体细胞胚胎的整个发生和发育过程中始终表达到基因，有的甚至持续到再生植株，如因，有的甚至持续到再生植株，如Gea31。第三类就是与体细胞胚发育过程有关的基因，如第三类就是与体细胞胚发育过程有关的基因，如DC8、DC59、DC3、EMB-1、DC2.1、DC7.1、Gea41等，在此类基因中，等，在此类基因中，不同基因在胚胎发育的不同时期其表达强度和表达顺序亦有不同基因在胚胎发育的不同时期其表达强度和表达顺序亦有差异，如差异，如EMB-1、Gea41和和DC7.1只在球形胚至心形胚期间表只在球形胚至心形胚期间表达，而达，而DC8和和DC59只在心形胚期间表达只在心形胚期间表达。调控基因116
