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1、第六章第六章 微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测 在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。制提供依据。黑箱黑箱 灰箱灰箱检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等检测代谢中间物，分析代谢流向、检测代谢中间物，分析代谢流向、RNA检测检测一一 参数在线检测参数在线检测砸打狡苦矗皆票斯拳参抽胀蕴追电帆弹拿在
2、创稻磋劳淄辣擅尖串禽烛拉琶第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：要求高，因此对传感器有特殊要求：插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）灭菌（材料、数据）传感器结构不能存在灭菌不透的死角，传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）以防染菌（密封性好）传感器对测量参数要敏感，且能转换成传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）电信号。（响应快、灵敏）传感器性能要稳定，受气泡影响小。传感器性能要稳定，受气泡影响小。逊
3、榔示舰梆鹃时彩梦邀错纤泵虾矢晓湘员藏血眼酵嚼们茄岿甲海龙浇脓鹃第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定带计算机数据采集与控制的生物反应系统带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188猜昨乎爵慑迪驴淬幽水荫顺悯同挂畦鹤例街夺迪恢羚偏衍蜡看源孰谅斗涩第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定原理：化学或物理信号原理：化学或物理信号 电信号电信号 放大放大 记录显示仪记录显示仪 控制器（与设定参数比较）控制器（与设定参数比较） 发出调节信号发出调节信号 控制器动作控制器动作诺纽寡谴靶翌酌锣涌激蚂艾斗丹慑煎竟价梭蚊棱钓狠德宦亨滨厘菲印吭坪第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定介绍几种常用的
4、在线检测的传感器及其工介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理作原理 pH电极电极溶氧电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极制作各种离子电极和酶电极睹刽原究涪琢片捂桔毁辞喀说荚惦孽寻括泥搞邯彰赣捎贬坝芝扮装羔蓄啡第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（一）（一） pH pH测量测量pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。生物过程控制是一个非常重要的参数。1 1、pHpH的定义的定义影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对
5、于稀溶液为了避免在氢离子活度很小但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦时表达方式上的麻烦引进引进pH=-lgH+ H+=0.00001时时 用用pH5表示表示粗惯絮重衫楔眠驭岂胜釜宽荡经坑禁券袍樱澄缩辖惑公俩蛊熏住飞内棚藩第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定2 2、pHpH测量方法测量方法 pH试纸曾经是一种广泛采用的方法试纸曾经是一种广泛采用的方法优点：方便，易操作优点：方便，易操作缺点：它主观性较强缺点：它主观性较强 质量差异，不同厂家不同批号的质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达值会有较大的差别，有时甚至达0.51。
6、对于一些要求较高的场合就适用对于一些要求较高的场合就适用pH试纸试纸pH电极电极茅钠锑高乐健拢旬情乃锡侦缔沉卵允匝椰胺新旅磁挞畸溅搐煎市朵骇球孵第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（1）pH电极测量原理电极测量原理pH电极实际上是由参比电极电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：池，该电池的表达式可写为：参比电极参比电极 溶液溶液X 指示电极指示电极该电池的参比电极的输出电位该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电
7、动势就因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函是被测体系中氢离子活度的函数。数。 E=E0- ln1/ =E0-2.303 pH式中式中E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的电位差计的E值可测出值可测出pH值。值。术雏靛道之着艺喘楷扒框床颐纸卒乌兜添站匈躁潮畏韶全颂殃撵熙酬物匠第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定 甘汞电极（甘汞电极（a）232型（型（b）217型型1导线；导线；2加液口；加液口；3-KCl溶液；溶液；4素烧瓷芯；素烧瓷芯；5铂丝；铂丝；6Hg；7Hg2Cl2一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻
8、璃管，里面套一根小一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满汞不会漏失，小管和大管之间充满KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。参参比比电电极极久馆鸭甫既蜜嚣邻堂梭步闻迢保福雪馏信剥慰攒渡霍邦挛才低掸瑞狰贡鸦第六章发酵过程参数
9、测定第六章发酵过程参数测定 由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐氯氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为池可表示为Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L) 电极电位产电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：生于汞和甘汞的界面，其电极反应为： 2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-其电极电位为其电极电位为Cl/HgCl,Hg= + ln1/ 由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响度有关而不受被测溶液的酸碱度影响乔孵
10、单儒让质道搭哟奇炙整捂席诧虫象殷态饲依详拟蘸酮堡泉棘碌灯核赎第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（2）指示电极）指示电极对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极都可用来测定溶液的电极都可用来测定溶液的pH。 离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构其中敏感性膜部分随组成其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。材料的不同而各有特色。测定测定pH值的玻璃电极的值的玻璃电极的敏感膜是厚度为敏感膜是厚度为101103mm
11、的玻璃薄膜，其的玻璃薄膜，其电阻为电阻为50500m。欢珊枚甸寞臆石娄行利悉滇棋牢旨等塔暮鞭涎赘乃灌辆惟氰扁锥代绥熊隙第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定指示电极的关键是敏感膜指示电极的关键是敏感膜H+H+H+H+H+H+KCl溶液溶液待测溶液待测溶液浓度差引起电位差浓度差引起电位差浓差电极浓差电极玻璃敏感膜玻璃敏感膜狗詹冷购墅融恍攀挫荐旋腕控头蒙碗称华黍芦库魁慰环箍倒拥庸摩许注戏第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（3）膜电位）膜电位膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在看作是一种浓
12、差电位。玻璃电极在使用前必须先在水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并且其中的一价阳离子（如且其中的一价阳离子（如Na+离子）与水中离子）与水中H+离子发离子发生离子交换反应。生离子交换反应。SiO-Na+H+ SiO-H+Na+ 使膜表面形成以使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，为主要成分的水合硅胶层，厚度约为厚度约为10-410-5mm八粥什爱条紫泥迈华汪伺君肮订证汤眉岭涕收菜碑烫躺秒落遇袍除逝镑粪第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定液液 试试水水合合硅硅胶胶层层干干 玻玻 璃璃 层层水水合合硅硅胶胶层层内内参参比比
13、溶溶液液1 1 2 2 1-2以以1、2分别表示试液分别表示试液内与内参比溶液中内与内参比溶液中H+离离子活度，子活度，1、2分分别表示外侧与内侧硅胶别表示外侧与内侧硅胶层表面层表面H+离子活度，离子活度， 由于水合硅胶层表面与由于水合硅胶层表面与内（内参比溶液）、外内（内参比溶液）、外（试液）溶液中的（试液）溶液中的H+离离子从活度大的一方向小子从活度大的一方向小的一方迁移，使玻璃膜的一方迁移，使玻璃膜的外、内侧分别产生相的外、内侧分别产生相界电位界电位1和和2。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。则有：则有：外侧外侧: 1=K1+内侧：内侧：
14、2=K2+忿狈惯沸帘懈蕉挥沛前掐林雾体澈暖好咋牢凤塞轰臣火汰液饥创肝们痔腊第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故故K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质子占据，故基本被质子占据，故1=2，于是玻璃，于是玻璃膜内、外侧之间的电位差膜内、外侧之间的电位差膜膜=1-2= 由于内参比溶液的由于内参比溶液的H+活度活度2一定，故玻璃一定，故玻璃膜电位与待测溶液的膜电位与待测溶液的H+离子活度（离子活度（pH值）值）成线性关系。成线性关系。赊坐欢郸盆期啼锰膨丙篮逊烘养瓣赢弄成技仆办陶
15、孪梦阿舀潦温戌驮砍茶第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定膜膜=常数常数+ 在在25下：下：膜膜=常数常数-0.0591pH（试液）（试液）但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使别，即使1=2时，时，膜膜0，这差别所产生，这差别所产生的电位叫不对称电位（的电位叫不对称电位（不对称不对称），这样整个玻），这样整个玻璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。膜电位与不对称电位之和。忧糙嗓陡颊众藕翔郝正噪酞藉日脾稠望圣馏饮役误卯性贮虎骇药帖乎临私第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测
16、定玻璃玻璃=0 +膜膜+不对称不对称其中，其中， 0 与与不对称不对称对于特定的电极是恒对于特定的电极是恒定的，故玻璃电极的电极电位与试液定的，故玻璃电极的电极电位与试液pH值呈线性关系。值呈线性关系。（4）玻璃电极的性能）玻璃电极的性能存在不对称电势存在不对称电势不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以用已知不对称电势可以用已知pH值的标准缓冲液来校值的标准缓冲液来校正正
17、炉邑儒寄柠椿帮却咋秦台凄醋轿塞藕胀览旱辗树募罩豺渐置皑悄炔茫匡卧第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定零电势或等电势点零电势或等电势点 电极电位为零时的溶液电极电位为零时的溶液pH值称为零电势值称为零电势pH值，该值取决于内参比溶液的值，该值取决于内参比溶液的pH值。值。含有含有0.025mol/l的的 KCl和等摩尔浓度的磷和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为酸混合缓冲液的等电势点为pH=7，在，在pH7时，玻璃电极的极性发生改时，玻璃电极的极性发生改变。变。榴皆兰浙绰侦乒鸵奈抵庄厚婴通枉翼饵要挂楼垂恨甸辛满孽顺坪俏擅乞撞第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定玻璃电极的测量范
18、围玻璃电极的测量范围 玻璃电极的实际转换系数并不是在整个玻璃电极的实际转换系数并不是在整个pH范范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实际的际的pH响应曲线如图响应曲线如图测量值测量值pH在碱性范围内在碱性范围内pH10 k降低，测量值偏高降低，测量值偏高在酸性范围内在酸性范围内pH1 k升高，测量值偏低升高，测量值偏低矛韶寇箭癌洛在态概乳利贷雷溺萤梅沪盯刀诊室屹皖君我当勾嫌搬俄翟殆第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（5）玻璃电极的使用限制）玻璃电极的使用限制对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻璃电极敏感膜上
19、产生沉积，应设法易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。波清洗电极表面。强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟酸溶液会破坏电极如氢氟酸溶液会破坏电极脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合硅胶层坏水合硅胶层鹊琉骡剥陵呆逞关敢桌战专慧笆箔酞砾紫恳纽寞吞臭廖伦荣歧谆该祁苏站第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（6）复合电极）复合电极将两支电极都装在将两支电极都装在一根
20、玻璃管中，这一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，种电极叫复合电极，工业上在线检测大工业上在线检测大都使用这种电极。都使用这种电极。它结构紧凑，便于它结构紧凑，便于安装。安装。尝庐陪羔左央埔酌芬姿弄培蔗唬帚钧干咖两宙决溶猿外景砂扑淆码葛啦袒第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定pH复合电极的结构复合电极的结构屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电极插入被测溶液中后，参比电极当电极插入被测溶液中后，参比电极 隔膜隔膜 被测体系被测体系 玻璃敏感膜玻璃敏感膜 内参内参比电极之间达到电导通，组成原电池，其比电极之间达到电导通，组成原电池，其原理与双电极原理
21、与双电极pH计的工作原理完全相同，计的工作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。只是结构更紧凑，使用更方便。乞黔跌煮聘蹿闽捂仲熟渤黎善擒传讲防偿少攀搁蔷桨闹碧禹坯嘎马苗嚼嗡第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（二）（二） 敏化离子选择性电极敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过化学以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或生化反应使离子选择性电极的响应反应或生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电极等。括有气敏电极和酶电极等。狰喇雁绰驳然醛劳樱禽秆屎村琼措打篆咳吐涂接尉鉴文竣医铜骨寒豹到构第
22、六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极 在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被测定的气体通过，的离子通过，而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压相等。直到透气膜内外两边该气体的分压相等。 进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响
23、而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发生变化，并通过选择性电极应的物质的量发生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接表征被测气体含量电位反映出来，达到间接表征被测气体含量的目的。的目的。搀颂软盾黑探焰漫实劝儡腹健控禾糙蚁松马见呛油滚悠绳确婚皇是蹿磷倦第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定 能用气敏电极测定气体有能用气敏电极测定气体有CO2、NH3、SO2、NO2、H2S、HCN、HF、Cl2、Br2、I2的蒸气等，其中以氨电极比较成的蒸气等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。熟，应用较广。 1、NH4的测量的测量氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨是酶反应中最常见的产物
24、和反应物，氨离子可用氨气敏电极来测定。常用氨离子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：的氨电极为：村凰獭鸵还会卫直执扩侦凋渣蒂捷筏幌肛杉逝焕巴延束否跌盈浇侨沛噎篙第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定1电极管；电极管；2透气膜；透气膜；30.1mol/LNH4Cl溶液；溶液；4pH玻玻璃电极；璃电极；5Ag/AgCl参比电极；参比电极；6，7玻璃膜；玻璃膜；8可卸电极头；可卸电极头；9内参比溶液，内参比溶液，10内参比电内参比电极极在电极管内装有玻璃在电极管内装有玻璃电极电极Ag-AgCl电电极，底部装有一微孔极，底部装有一微孔透气膜，玻璃电极的透气膜，玻璃电极的敏感膜紧贴于透气膜敏感膜
25、紧贴于透气膜上，中间有一极薄的上，中间有一极薄的液层，当氨通过透气液层，当氨通过透气膜渗入内充液薄层，膜渗入内充液薄层，即发生如下反应即发生如下反应NH3+H2O=NH4+OH-补篮得培牛胸线泵嫉劳暮董鄂椎硒暖的乐蹬项妓狂芥镍勘垒体惦春捶拷在第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定内充液中内充液中NH4+远大于生成的远大于生成的NH4+，故，故其变化可以忽略不计，而薄层的其变化可以忽略不计，而薄层的pH则则由于由于OH-的生成而升高，因此由玻璃电的生成而升高，因此由玻璃电极检出极检出OH-的浓度，即可检出的浓度，即可检出NH3的浓的浓度，电极电位与氨的浓度是对数响应。度，电极电位与氨的浓度
26、是对数响应。透气膜一般是透气膜一般是0.1mm厚的微孔聚四氟厚的微孔聚四氟乙烯，内充液为乙烯，内充液为0. 1mol/L的的NH4Cl溶溶液。氨电极使用的上限为液。氨电极使用的上限为1mol/L,下限下限为为10-6mol/L。棉虑禾锅雷郸咏先喀炎孽燎官埋徽立抨踞猾束障腑千噪冕铱吕簇攻掇茁黍第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定2、CO2的测量的测量（1）CO2电极（测溶液中的电极（测溶液中的CO2）结构与氨电极类似。测量结构与氨电极类似。测量CO2时，气体透过时，气体透过电极膜，电极膜，CO2和水反应，达到以下平衡：和水反应，达到以下平衡：CO2+H2O HCO3-+H+产生的氢离子引
27、起产生的氢离子引起pH的变化，就可以测的变化，就可以测出溶解出溶解CO2的浓度。如果的浓度。如果CO2扩散在水或扩散在水或NaHCO3的水溶液中，它们的的水溶液中，它们的pH值会依值会依据下列的式子而变化：据下列的式子而变化：淡末斋倒况散思斜肃矩爽懦碎露症照崖八蓬夷曝照拴曾过志哀盯强腊术济第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定在纯水中在纯水中 pH=常数常数lg 在在NaHCO3溶液中溶液中 pH=常数常数-lgpCO2在在NaHCO3溶液中测量能方便地确定溶液中测量能方便地确定pH和和pCO2之间的对应关系。使用特殊的气之间的对应关系。使用特殊的气体渗透膜，它能够使体渗透膜，它能够使C
28、O2扩散到扩散到NaHCO3溶液中去，溶液中溶液中去，溶液中pH变化就是变化就是CO2实际分压的测量值实际分压的测量值 蜘房幻神玄豹俘呢已包槽崎服叶泪娃恢琴载神将谩宝胸蓄辑永祭徘到们镰第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定(2)尾气尾气CO2的测量的测量常用的尾气测定仪是常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定不分光红外线二氧化碳测定仪（简称仪（简称IR），其精度高，可达，其精度高，可达 0.5%，量程的，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。养时常被采用。不分光红外线不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体分析
29、原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的的红外吸收峰在红外吸收峰在2.62.9m和和4.14.5m之间有两之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓的所含浓度。度。耗汹况使盈腮翟铜痘雷矩矽焊残铝均拭瓦勾孵顶烘堂羹塔档醉梧润井爷嫌第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（3）尾气氧的仪器分析）尾气氧的仪器分析采用热磁氧分析仪测定采
30、用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。氧的含量。番缅拆座迄砷诗乙酬图萝怂易粱族嘴雕汰肚凰竞传痕波琶再泄姓立蚁棱半第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定通过通过RQ值的测定，可以分析微生物可能值的测定，可以分析微生物可能利用的基质利用的基质氧化型的或还原型的，分氧化型的或还原型的，分析微生物生长阶段，分析补料的速
31、率是否析微生物生长阶段，分析补料的速率是否合理合理例如，储炬等发现例如，储炬等发现RQ的变化与菌体生长、营养状况的变化与菌体生长、营养状况以及产生抗生素密切相关。如以及产生抗生素密切相关。如20h菌丝开始发生膨大，菌丝开始发生膨大，而此时而此时RQ达到峰值开始下降；达到峰值开始下降；40h左右左右RQ降至谷底降至谷底开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于RQ具有以上的关联特性，他们尝试在具有以上的关联特性，他们尝试在avemectin发发酵过程中利用酵过程中利用RQ作为补料控制的参考之一。作为补料控制的参考之一。3 3、排气氧、排气、排气氧、排
32、气COCO2 2和呼吸熵和呼吸熵株身挎距没猿闹贩穆污遗斌帛水烹编嚎段锥穗胺匆节斌熊爪张罩丸胃驳点第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。例如脲酶电极，把脲酶固定在例如脲酶电极，把脲酶固定在NH3气敏电极或气敏电极或CO2气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生如下的分解反应：如下的分解反应：
33、CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2通过通过NH3或或CO2气敏电极测定气敏电极测定NH3或或CO2的分压即可达到间接测定尿素的目的。的分压即可达到间接测定尿素的目的。4 4、酶电极、酶电极朽昏笑愈承揽剑辊宝淹腑针颧裁姚薄轰栅乘粉幢迪辽截伤畴娇竭臀垫耙常第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（三）（三） 溶氧的测定溶氧的测定 对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池
34、型。来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。 极谱型极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，受需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影响小气流影响小 原电池型原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受气流和气泡影响大。大，受气流和气泡影响大。氯槽吵胸掖荆八颈吞颓指束亢毁妓茸倡雹俱檬尚宅战驶迭坝厢泊铜诡缘磺第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定现在国内外测定溶液中的溶解氧基本现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用上用极谱型的复膜氧电极极谱型的复膜氧电极。复膜氧电极可分为复膜氧电极可分为 敞口式敞口式 封闭式封闭式懂去暴撇畅税故稠慨啼隔蚁凉志标姬画杆囊呆帕倚底钧额矢窍盎滑
35、汝捣毒第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定敞口式敞口式 在电极的玻璃管上有一个小在电极的玻璃管上有一个小孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，有利于保护电极有利于保护电极封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌时玻璃管受压大汽灭菌时玻璃管受压大现在使用的大多数是敞口式电极现在使用的大多数是敞口式电极何荣唯咬河咀夹萄芯品演天雍蜕闻挤世拷勃撅乐辟哦坛慧弦奠邻戊涛饺惑第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定1 1、复膜氧电极的工作原理、复膜氧电极的工作原理阴极由铂、银、
36、金等贵金属组成，阳极由阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、铝等组成铅、锡、铝等组成 。当给电极施加极谱电。当给电极施加极谱电压（压（0.60.8V负电压）时，溶液中的氧就负电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正比关系。和电流成正比关系。请挣亮孝旨翁荚专娶吕璃掀表憾锣派秆暖鹃谊二菩召映弹隔望盅坝奄藏偶第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定在阴极表面发生的电极反应：在阴极表面发
37、生的电极反应：1/2O2+H2O+e- 2OH-阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴极，于是在二电极之间形成电流，流向阴极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。电流越大。阳极上的反应是：阳极上的反应是：Pb+2ACO- Pb(ACO)2+2e-化学信号转变成电信号化学信号转变成电信号羡荧杠捡憋敷傲今誉兜处藐跌镀钥谓氛鸵斯陀撵哥辑葫乡迎厨镐但缀脉珍第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定2 2、电极的构造、电极的构造在阴极银（铂）在阴极银（铂）片的前面包一张片的前面包一张半透膜，
38、氧可以半透膜，氧可以透过半透膜达到透过半透膜达到阴极上进行电极阴极上进行电极反应。该半透膜反应。该半透膜固定在阴极表面。固定在阴极表面。小孔用于压力补小孔用于压力补偿。偿。卫红帮甜夺匪幕率乍尘螺烁脾殿愿陶梁唾僵肪撩苔闲板财恕亩勋伞湖缩憎第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定3 3、溶氧电极的影响因素、溶氧电极的影响因素（1）电极的灵敏度）电极的灵敏度电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：IS=NFA(
39、pm/dm)pO2式中式中IS电极电流电极电流 N电子数电子数 F法拉第常数法拉第常数 A阴极表面积阴极表面积 Pm氧在复膜中的穿透系数氧在复膜中的穿透系数 PO2被测溶液中的氧分压被测溶液中的氧分压 dm膜的厚度膜的厚度舟岸朋筹娱萤咱楼灼窝其驳淋至殉扔领嘲秒凡硷村界发糯坠灯礁齐霄早搬第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定增加灵敏度因素：增加灵敏度因素：增加膜穿透系数增加膜穿透系数pm减小膜厚度减小膜厚度dm增加阴极表面积增加阴极表面积A扩散速度扩散速度 因为电极表面的氧浓度因为电极表面的氧浓度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度搅拌速度、通气量和培养液粘度搅
40、拌速度、通气量和培养液粘度农亮菠篷虞钳午笔待蘸杨缉父违算泞冤窄掠节妈捷樊琐窟檬嫂咒侠奠合恫第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（2）温度的影响）温度的影响电极还会受温度的影响电极还会受温度的影响氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增加，增加了电化学反应速率。扩散增加，增加了电化学反应速率。由于后者影响比较显著，因此随着温度的由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，电极输出电流呈指数上升。所以电上升，电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧极须有温度补偿
41、功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情况。溶解度变化的情况。独色沤糯怪稿强意六熊妨昆吗倾坠涸咽恰揣枚赎弊汾矢元慢漳渺肇殊田耕第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定4 4、电极的标定、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定）零点标定用饱和用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。稳定后，调节零点旋钮显示零值。 （2）饱和校正（满刻度）饱和校正（满刻度） 进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电进行
42、简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。即为饱和值。贿盈万敲轮智碱茵妨硝谢忍珠残离念僻灰绦磨莫琶困毛挽拿簿盯彩伏熄诌第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定5.5.摄氧率摄氧率r r的测定的测定(1)用溶氧电极测定用溶氧电极测定r要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。测定前先用纯水标定电极，得到变化。测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度：单位电流代表的溶氧浓
43、度： I饱饱在饱和氧浓度在饱和氧浓度C*时的电流值时的电流值I残残氧浓度为零时电极所具有的电流氧浓度为零时电极所具有的电流伯迅评掂焰裤畏濒畸乌话喂庸禄加荷雕己狗破暑木蕴侯烤祟祭眶局炯茵烤第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由于耗氧，此时，由于耗氧，CL下降，仪表上电流值也下降，仪表上电流值也不断下降。不断下降。R= (-i/t) t停止供气后停止供气后CL下降到最低点下降到最低点时所需时间时所需时间 i在在t时间内的电流变
44、化时间内的电流变化蔓契躁圣滥账伤臼宗育焉错律赞庸念麓漾用在瘦励岿滚个欢峙楼宴廖誉懂第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定(2)用热磁氧分析仪测定用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少，根化率几乎完全取决于含氧气的多少，根据排气中的氧含量，可以算出摄氧率据排气中的氧含量，可以算出摄氧率设进口氧含量为设进口氧含量为21%r=每小时通气量每小时通气量（0.21-出口氧出口氧%）*22.41000*V椰兹绕跑突匠俺酪俘咙旨咬挽串杖瓦没埠侦碱具绵埠陛锦剪
45、撇墩壶添黄司第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定6 6、氧传递系数、氧传递系数kLakLa的测定的测定设备的设备的KLa可以用亚硫酸钠法来测定，可以用亚硫酸钠法来测定，但它是在非发酵过程中测定的，不能完但它是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发酵过程中的全代表发酵过程中的KLa值。其它测定值。其它测定方法有方法有(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示此时供氧和需氧达到平衡，即值表示此时供氧和需氧达到平衡，即 r=KLa(C*-CL)式中式中C*可以查得，可以查得，CL可以用溶氧电极
46、测可以用溶氧电极测得，得，r也可算出，因此可求得也可算出，因此可求得KLa值值胚体串悄粟墙喜疤翁肖答辰囱阿聪劈植灯平某鉴跟球围苑憋沁封魄融凑撼第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定例：一装料为例：一装料为7L的发酵罐，通气量的发酵罐，通气量1l/L.m，操作压力为，操作压力为0.3Kg/cm2，在某发，在某发酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓度的度的25%，空气进入时的氧含量为，空气进入时的氧含量为21%，废气排出时的氧含量为，废气排出时的氧含量为19.8%（1atm时氧饱和浓度时氧饱和浓度C*=0.2mmol/L）求此时菌）求此时菌的摄氧率的摄氧率r=
47、1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7KLar/0.26(0.21.0.198)驰节糙蕴遮坛僧谈旺打玲拷浊旬琐茶省饮寞敖阶育筑踩棠野缕团梗溶翔希第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定(2)单用溶氧仪测定单用溶氧仪测定用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶氧下降缓慢，待溶
48、氧到最低点后在恢复氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线曲线批泡烘特蛛膨掀峻科两宾还何滔琶恼象痢虑尔驶高殷秋授耗轿棕驶筷岸弊第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定CL/t=KLa(C*-CL)-rCL=-1/KLa(CL/t+r)+C*将将CL对对CL/t+r作图，得到一条直线，斜率作图，得到一条直线，斜率为为-1/KLa因此可求得因此可求得KLa,延长直线与纵坐标相延长直线与纵坐标相交点为交点为C* 溶解氧浓度随通气变化的情况溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取的求取积橱致披雇设塑颗郁续喘咕禹讲蹦丈管矿朽泳臣叼训闸
49、誉原阔庐烷碑傲阵第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定二二 参数的离线检测进展参数的离线检测进展（一）（一） 利用高效液相（利用高效液相（HPLC）分析代谢）分析代谢中间产物中间产物 通过中间代谢产物的测定可以深入了解通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程况。从而有的放矢的控制发酵过程朝干庄辊么绕贫锋绢示递竟涪氨鳖峙潭窃品详内诅庇封论选尿攀销耕掸肄第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定例：鸟苷生产例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发在鸟苷发酵中，发现发酵到现发酵到40小时后小时后鸟苷合成速率下
50、降，鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖降，而且由于耗糖,使发酵过程使发酵过程pH下降，下降，补入氨水增多。那补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了么糖耗到哪里去了呢？呢？于是进行以下一些于是进行以下一些测定与分析测定与分析沟死绍东彬幸芍膏丫倘做玉水钨邦缮卫祁荫差洛周并洗陀碉旧撕筋氏抑车第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定什么因素导致什么因素导致pH下降？下降？1 1、有机酸的积累、有机酸的积累 有机酸积累有机酸积累 pH下降下降 补加补加氨水氨水 在正常代谢情况下，细胞通过在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能循环
51、的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的若发酵后期有机酸积累会引起加入的NH4+积累，相应出现产苷速率下降。积累，相应出现产苷速率下降。代谢不代谢不正常正常鼓尉芭悬呼止追羞驹彝遂部驶盲钢煮社窟刮仿桶峭氯户剥悼疼派妓慑娱吾第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定测定以下中间物测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累发酵后期丙酮酸积累诈煞噎荔拘鸵关腋叭钡淋丁裹倦淹满旷拍悉阁枪殖摇蜂绕烫驼菇咱棒羡斌第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定2 2、氨基酸的积
52、累、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和机酸和NH4+积累。积累。彪道蓖曼府刹庶档诬飞巍葛史炉袄代俯定因谁真嘿驭声秒串邻丹羌遂敖煮第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在体
53、合成，在8小时之前已经降到很低水平，小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在并始终维持在低水平，而在48小时左右丙小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。贬种笑仅芝谩挖载怯实耕馁脂米敷弟夏贫敞瓷脸放船稽京竿涉扫访柔畦通第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定3
54、 3、分析原因、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。择该扁难婪危维蔑蜒釜蔬挨臀插律裔陋潞喻锗氢财舟讥娱谣跑栏也芍砷秉第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定丙酮酸积累丙酮酸积累
55、氨水补加增加氨水补加增加NH4+积累积累抑制抑制GS抑制抑制TCA循环循环丙酮酸积累丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶激活磷酸果糖激酶EMP流量增加流量增加恶性循环恶性循环丙氨酸丙氨酸积累积累京七实征窃柠荣搏丁意穷叼说冷幻表狮濒草窟样隆此筛匆寇岳烙帚兹械傻第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（二）（二） 代谢流迁移的酶学证明代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖代谢途径关键酶糖酵解途径（糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析磷酸果糖激酶的时序分析拟家撇币炔逸经潭瓢氰
56、制泳讼章墅役挤萌惮锁抿卞描奉卒臆润公晓学亨虞第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以所以PFK的活力相对较低。的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过相对酶活增加，这
57、表明此时通过EMP途径的糖代途径的糖代谢通量已有了明显的增加。谢通量已有了明显的增加。 挤浆山呈逻邯景痒极觉扯浊茁券慧遂酌蓝捆夺噬耳犬蛙跌彤箭篇滚岛戍恶第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶时序分析资待乌霉锗高菠叙升傲乙谩丫孜怎板壕之扮佑廖杠熙贝郴舍疹咨肢妒三饯第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在而是在24小时就基本上达到其最大值，随小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的途径代
58、谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素素 磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（HMP）关键酶）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化萄糖脱氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢磷酸葡萄糖脱氢生成生成6磷酸葡萄糖酸内酯磷酸葡萄糖酸内酯。氏犁侧畜刺耘简锅魂淋豪仙窖扶鞘运当趾没登络俏载氮叶讹沏卫它勒明贿第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌
59、体合成代谢比较活跃，通过这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持从而保持EMP和和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到的形成产物；但是到40小时后，小时后，6磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在谢在HMP途径通量下降而途径通量下降而EMP途径通量增加。途径
60、通量增加。潘寒狱窿盛沸尉逆卡甭花陨儡埔抑杂脉账浸铬习酚殴悄拎啡御克祁凸厉旦第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定三羧酸三羧酸(TCA)循环的关键酶循环的关键酶三羧酸循环是三羧酸循环是“消耗消耗”丙酮酸的途径，丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸柠檬酸合成酶所催化的
61、反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。循环中的第一个限速步骤。窜憋晶琅噎偏悦赢膊巢课室奈友胡皿暴刘告澳弘歧炕瞥肇复样腾紫剪鄂调第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定柠檬酸合成酶时序分析柠檬酸合成酶时序分析舌岔政站封载挣捣浙寝图暴款遭连改受粹告壶术碑艾栓鲸痔纪妨牲阔卜应第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定从图可以看到，从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁
62、移时，发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量循环的通量并没有发生明显的增加。即并没有发生明显的增加。即代谢流迁移代谢流迁移发生在发生在EMP和和HMP之间，主要是由于之间，主要是由于EMP和和HMP途径之间的分配平衡被打破途径之间的分配平衡被打破所造成的。所造成的。EMP途径代谢流的增加造成途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。了一种代谢流的溢流现象。迷约纤俺赁嘴乎埠叼剂舵膊玛卜集胰胞赏放击茬稗美虫辕值杂予面选筷蛹第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定丙氨酸脱氢酶的时序分析丙氨酸脱氢酶的时序分析现鸭贺崇破磺糖汰丝桨份耐掺咨萍藕义姻碾每驳恃何报便姬落疮猜该芹饭第六章发酵过程参数测定第六
63、章发酵过程参数测定在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果加入结果加入EMP途径的抑制剂，克服了途径的
64、抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量量摇琵烹撒选雏铸缸仰鲤资携蠕询片趟扒矢咋欧称顾券珐递尼噶浩纺卷滞戒第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定（三）与产物合成相关的酶和中间物（三）与产物合成相关的酶和中间物测定测定例：螺旋霉素生物合成的代谢研究例：螺旋霉素生物合成的代谢研究惠照近申颈呜姑磐喷镑趣灌蹈仓啼悔惭洱港委板迹青额阳淮寥锤亢括鸳侈第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定图图3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径螺旋霉素生物合成代谢网络途径 影配氛瑚最泽偷程扯皖哩遁厉蛆羔锅兽等邓杉擅缸枚谋氟走焦疙棒蓟志探第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数
65、测定图图1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图 哪哪个个代代谢谢中中间间物物过过多多积积累累绳恭赤价鞘法易挡咳胃擞桥辆拦盗冀述招咨承擅傣箔稚同釉铺泉里砷亥酶第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定在在发发酵酵后后期期有有FO-积积累累， 要要减减少少FO-FO-转转化化为为FO-必必须须降降低低C3酰酰化化酶酶的的活活力力，但但这这与与SP、SP合成有矛盾合成有矛盾在发酵结束时，在发酵结束时， SP- SP-还有一定的积累，如能最大还有一定的积累，如能最大限度的转化为限度的转化为SP-SP-、SP-SP-，即加强步骤，即加强步骤3 3对发酵对发酵效率和
66、发酵效价是有积极意义的。而效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-FO-、NSP-NSP-的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4 4的通的通量。但由于这几个步骤的转化都是由量。但由于这几个步骤的转化都是由C C3 3酰化酶催化酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。反应，这给改变通量带来一定的困难。呆龙奢幅焦染玲浇君模麻尾火窗薪关羽媳獭些争讣医输目篮乃狭捣赎牛搐第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定图图2 有机酸前体的动态流量分布图有机酸前体的动态流量分布图阿镭盈
67、锹飞承铺烬放氏狱彩彼蓖剑碰斜火莹新庭畅炯线余钳拒丹拯潘传鞍第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定在图在图2 2中，乙酸和丁酸在从中，乙酸和丁酸在从4040小时开始积累小时开始积累并在并在6464小时达到最高值，对照图小时达到最高值，对照图3 3螺旋霉素螺旋霉素生物合成代谢网络途径生物合成代谢网络途径99，我们可以推测在，我们可以推测在发酵中前期在图发酵中前期在图3 3中的步骤中的步骤1 1也即大环成环步也即大环成环步骤有一定程度的骤有一定程度的“瓶颈瓶颈”影响，从而导致乙影响，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的
68、通量，提高螺的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。旋霉素的效价。我们测定了内酯环合成相关的酶活我们测定了内酯环合成相关的酶活前体前体的活化的活化颖伺废传平物育宠誓沁疗挪备怎琶观摈覆饶们莆铅医蝶雨湘怕臀上绝谴瞥第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定酰基激酶和酰基酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势合成酶活性趋势 测定酶活并建立酶活趋势曲线。测定酶活并建立酶活趋势曲线。分分析析：两两种种酶酶在在发发酵酵过过程程中中都都有有两两个个活活性性高峰期高峰期, ,但但出出现现的的时间时间相差很大。相差很大。酰酰基基激激酶酶的的活活性性高高峰峰期期主主要要集集中中在在发发酵酵中中前期前期酰
69、酰基基CoACoA合合成成酶酶的的活活性性高高峰峰期期主主要要集集中中在在发发酵酵中中后后期期。此此外外，酰酰基基CoACoA合合成成酶酶的的活活性性远远小于小于酰酰基激基激酶酶的活性。的活性。 伯旋熙都颖锄邢间殆拌切赤蜂偏霸忻耘租茂服晌衙宏谁份修讽钦箔膝饯豪第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定图图1 1 酰基激酶和酰基酰基激酶和酰基CoACoA合成酶活性趋势合成酶活性趋势 酰基激酶酰基激酶酰基酰基CoA合成酶合成酶炬比米国廷传输榔比漳桶订鲜寺井韶秆耙凸少莉员讼恿膛傍歹瘸弃丧则勤第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，酰基激酶在发酵初期出现一个活
70、性高峰，推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出现在发酵中期，且与酰基现在发酵中期，且与酰基CoACoA合成酶的第合成酶的第一个活力峰出现时间相一致，意味着酰基一个活力峰出现时间相一致，意味着酰基激酶对次级代谢同样有着重要作用。在螺激酶对次级代谢同样有着重要作用。在螺旋霉素的生物合成中，酰基旋霉素的生物合成中，酰基CoACoA合成酶的合成酶的活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶主要参与次级代谢。由于合成酶的活性较主要参与次级代谢。由于合成酶的活性较小，推测其可能是大环合成的小，推测其可能是大环合成的“瓶颈瓶颈”，如果提高其活性
71、，就有可能大幅度提高发如果提高其活性，就有可能大幅度提高发酵效价。酵效价。 恳赢挑赎卫竹湖澜评牲点每皂蛛少嗽航邪晴深投堕真兆趴弥港眠敝刽阵当第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定采取措施：寻找酶的激活剂采取措施：寻找酶的激活剂添添加加ZnSOZnSO4 4、MnClMnCl2 2、CoClCoCl2 2、CuSOCuSO4 4等等无无机机盐盐，研研究究了了ZnZn2+2+、MnMn2+2+、CoCo2+2+、CuCu2+2+等等二价阳离子对两种酶的影响。二价阳离子对两种酶的影响。体体外外各各阳阳离离子子对对酶酶活活性性影影响响，确确定定了了各各阳阳离离子子对对两两种种酶酶的的最最佳佳添添
72、加加浓浓度度（表表1 1）。）。汕曲贩天隧刽其堪夷咕船捷挟矗溺羽除狄二烤肉忧控纯阀罢娠惭躇单脆圾第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定ControlCo2+Zn2+Mn2+Cu2+图图2 2 二价阳离子对酰基激酶活性的影响二价阳离子对酰基激酶活性的影响张凶邱绑左饲棍憾彪咽涂父咱恋伊氟窥摸嫌屠伯沏哆喊述翱疡焚吩竖离拜第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定ControlCo2+Zn2+Mn2+Cu2+图图3 3 二价阳离子对酰基二价阳离子对酰基CoACoA合成酶活性的影响合成酶活性的影响 玩盎梁料毙控涡捶净批襟丛昔蟹译院带着数唐卵豪泌燕辽拳龚捡商耪麓晒第六章发酵过程参数测定第六章发酵过
73、程参数测定在在最最佳佳浓浓度度下下，各各离离子子对对两两种种酶酶的的影影响响程程度度如如图图2 2、3 3所所示示。对对于于酰酰基基激激酶酶， CoCo2+2+、MnMn2+2+、ZnZn2+2+离离子子都都有有明明显显的的激激活活作作用用；而而CuCu2+2+则则几几乎乎完完全全抑抑制制了了激激酶酶。对对于于酰酰基基CoACoA合合成成酶酶，CuCu2+2+却却有有很很强强的的激激活活作作用用；CoCo2+2+、MnMn2+2+有有较较高高的的激激活活作作用；而用；而ZnZn2+2+的作用不明显。的作用不明显。仟骂尼敲飘庙情伯杯鲜冯挨痊铣掳崭英文耽惰逊篇窍厚颗睦莱搽成钙耘耘第六章发酵过程参数
74、测定第六章发酵过程参数测定摇瓶发酵摇瓶发酵根根据据酰酰基基激激酶酶和和酰酰基基CoACoA合合成成酶酶活活性性趋趋势势曲曲线线，分分别别在在发发酵酵0h0h和和48h48h添添加加上上述述最最佳佳浓浓度度的的离离子子，测测定定螺旋霉素的平均发酵效价（表螺旋霉素的平均发酵效价（表2 2）。）。表表2 2 不同时间添加二价阳离子对螺旋霉素效价的影响不同时间添加二价阳离子对螺旋霉素效价的影响0h0h48h48hControlControlMnMn2+2+CoCo2+2+MnMn2+2+CoCo2+2+CuCu2+2+1#1#25712571261226122806280624982498302430
75、24295629562#2#2606 2606 3350 3350 322432242814 2814 3498 3498 3822 3822 AverageAverage2589 2589 2981 2981 301530152656265632613261 3389 3389 付兆搬埃祝蛆给连银惜寿厌整汇戌宜奖勇凄雁肯九痊漂专劈丘哇栏搔拷付第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定代谢过程检测的新进展代谢过程检测的新进展转录谱转录谱基因芯片基因芯片微阵列检测微阵列检测RNA含量含量割捏溉畏降奴擎处枷隘煌泽模勤草的辕矽星办契脏碎书昼奈拜甄蛰境寻丰第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定
76、思考题思考题1、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？2、pH电极的指示电极能测定电极的指示电极能测定pH值的原理是什么值的原理是什么？3、pH电极的测量范围有没有限制？使用时应注电极的测量范围有没有限制？使用时应注意哪些问题？意哪些问题？4、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？么？5、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有哪些？哪些？6、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测定原理是什么？定原理是什么？纂驴祷队尾骄绩墓锥私机滴芬撂猛振题际丽庄浙绍线太怨杉吊肖厅蒂砚奔第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定
