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1、生物技术药物的药代动力学特点及检测Cumulative Revenues of Selected Biotechnology Companies (Amgen, Genentech, Chiron, Genzyme and Biogen)Selected Blockbuster Protein Pharmaceuticals生物技术药物l l重组蛋白多肽类l l单克隆抗体及其片断l l寡核苷酸l l疫苗制剂l l基因治疗药物（核酸制剂）l l干细胞药物？蛋白肽类药物药代动力学l l吸收l l分布l l代谢与排泄蛋白肽类药物吸收l l小分子多肽：被动吸收l l大分子多肽：l l水溶性：细胞间隙水
2、溶性：细胞间隙l l脂溶性：膜脂扩散脂溶性：膜脂扩散l l胞饮胞饮l l淋巴系统吸收：淋巴系统吸收：popo干扰素；高度脂溶性？干扰素；高度脂溶性？l l影响蛋白肽类药物吸收因素l l药物稳定性；药物稳定性；l l细胞渗透性：细胞渗透性：MW1000MW1000，鼻粘膜肠粘膜，鼻粘膜肠粘膜Correlation between MW and the cumulative recovery of sc Correlation between MW and the cumulative recovery of sc rINF alpha-2a, cytochrome rINF alpha-2a,
3、cytochrome c c, inulin and 5-fluoro-2 -, inulin and 5-fluoro-2 -deoxyuridine (FUDR) in the efferent lymph in sheepdeoxyuridine (FUDR) in the efferent lymph in sheep蛋白肽类药物吸收l l非肠道给药非肠道给药( Parenteral Route)( Parenteral Route)：IVMIVMSCSCIPIP鼻腔鼻腔 肺肺 直肠直肠 回肠回肠 阴道阴道 颊颊 口服口服l l鼻腔给药鼻腔给药(Intranasal administr
4、ation);(Intranasal administration);l lInhale administration;Inhale administration;l l口服给药口服给药(Oral administration )(Oral administration )l lPeroral administrationPeroral administrationl l经皮给药经皮给药(Transdermal administration);(Transdermal administration);l l其他给药途径其他给药途径: : 结肠、回肠、子宫、阴道、颊、眼结肠、回肠、子宫、阴道、颊
5、、眼睛等。睛等。IM 和SC给药生物利用度IM IM AdministrationAdministrationDrugDrugBioavailability Bioavailability (%)(%)AlefaceptAlefacept6363Interferon Interferon alpha-2aalpha-2a8080TriptorelinTriptorelin8383SC SC AdministrationAdministrationDrugDrugBioavailability Bioavailability (%)(%)AnakinraAnakinra9595Cetroreli
6、xCetrorelix8585DarbepoetinDarbepoetin3737FollitropinFollitropin6666GanirelixGanirelix9191Interferon beta-Interferon beta-1b1b5050TeriparatideTeriparatide9595P Pharmacokinetics of IM ADI-SS PEG 20,000 mw in harmacokinetics of IM ADI-SS PEG 20,000 mw in humans with hepatocellular carcinomahumans with
7、hepatocellular carcinomaIntranasal administrationl l易给药；鼻粘膜上皮细胞有大量的微绒毛和广泛易给药；鼻粘膜上皮细胞有大量的微绒毛和广泛分布的血管淋巴管；无肝首过效应；分布的血管淋巴管；无肝首过效应；l l伪首过效应伪首过效应(Pseudo(Pseudofirstfirstpass effect)pass effect)；多肽、；多肽、蛋白酶（主要是氨肽酶）；蛋白酶（主要是氨肽酶）；l lcalcitonin, oxytoxin, LH-RH, growth hormone, calcitonin, oxytoxin, LH-RH, grow
8、th hormone, interferone, vaccinesinterferone, vaccines；l l分子量分子量u up to 2 KDa: pharmacologically acitivep to 2 KDa: pharmacologically acitive；l l血脑屏障：血脑屏障：IGF-1IGF-1。Inhalation administrationl lEase of administrationEase of administrationl llarge surface area (75 large surface area (75 m2)m2)l lHigh
9、 vascularityHigh vascularityl lBypass of first-pass Bypass of first-pass metabolism metabolism l lInsulin for Type II Insulin for Type II diabetesdiabetesl lDornase-alpha for Dornase-alpha for cyctic fibrosiscyctic fibrosisl lProteases in the lungProteases in the lungl lLocal effectsLocal effectsl l
10、Effect of molecular Effect of molecular weight?weight?Plasma bioavailability of therapeutic peptides versus MW after pulmonary administrationOral administrationl lGenerally not therapeutically active;Generally not therapeutically active;l lFactors for lack of systemic bioavailability:Factors for lac
11、k of systemic bioavailability:l lhigh gastrointestinal enzyme activityhigh gastrointestinal enzyme activityl lgastrointestinal mucosa as an absorption barrier;gastrointestinal mucosa as an absorption barrier;l lcytochrome P450 3A and p-glycoprotein activitycytochrome P450 3A and p-glycoprotein activ
12、ityl lAvailable oral forms: cyclosporine (30%) and Available oral forms: cyclosporine (30%) and desmopressin (0.16%);desmopressin (0.16%);l lAbsorption enhancers; encapsulation in Absorption enhancers; encapsulation in microparticles or nanoparticles.microparticles or nanoparticles.蛋白肽类药物的分布l l分布容积小
13、：分布容积小：0.04-0.2 L/kg 0.04-0.2 L/kg vs.vs. 1-20 L/kg( 1-20 L/kg(小分子小分子); );l l分子量大分子量大; ;l l水溶性大水溶性大; ;l l蛋白结合率高？蛋白结合率高？l l中央室（中央室（Vc):3-8 L=plasma volumeVc):3-8 L=plasma volume和平衡室和平衡室(Vss):14-20 L2x(Vss):14-20 L2x中央室中央室; ;l l蛋白结合蛋白结合: reduce clearance;: reduce clearance;l lSite-specific and target-
14、oriented receptor Site-specific and target-oriented receptor mediated uptakemediated uptake蛋白肽类药物分布：血脑屏障l l血脑屏障：l l缺乏特异转运系统；缺乏特异转运系统；l l存在蛋白分解酶；存在蛋白分解酶；l l外排作用泵外排作用泵l l提高血脑屏障对蛋白多肽类药物摄取的方法：l l脂质体脂质体l l鼻腔给药；鼻腔给药；l l脊髓管灌注或泵连续输注。脊髓管灌注或泵连续输注。Ziconotide cerebrospinal CSF concentration as a function of tim
15、eCSF Ziconotide Pharmacokinetic Results by Dose Group小分子药物代谢l lDrug biotransformation is divided into two types of reactions: l lphase I (hydrolysis, oxidation, and reduction)l lphase II reactions: conjugation (uridine diphosphoglucuronosyl transferase (UGT), N-acetyl transferase (NAT), glutathione
16、S-transferase (GST), and sulfotransferase (ST).小分子药物代谢蛋白肽类药物代谢与排泄（消除：elimination)l l蛋白水解酶（溶酶体、蛋白酶、组织蛋白酶、氨肽酶、二肽酶）: throughout bodyl lProteosesProteosesl lPeptisasesPeptisasesl l受体介导清除(receptor-mediated endocytosis): t-PAliverlow density lipoprotein receptor-mannose-asialogglycoprotein receptor; insul
17、inl l蛋白水解酶稳定：环孢菌素P450?蛋白肽类药物代谢与排泄l l肾脏肾脏l l肾小球：肾小球：30 Kd, eg.,IFN, IL-2, 30 Kd, eg.,IFN, IL-2, l l肾小管肾小管l l近曲小管近曲小管(proximal tubule) endocytic vesicle hydrolysis into peptide (proximal tubule) endocytic vesicle hydrolysis into peptide fragments: IL-2, IL-11, growth hormone, insulinfragments: IL-2, I
18、L-11, growth hormone, insulinl lLuminal membranes: hydrolysis: small linear peptides: ANGI, ANGII, Luminal membranes: hydrolysis: small linear peptides: ANGI, ANGII, bradykinin, glucagon, LH-RHbradykinin, glucagon, LH-RHl lEndocytosed and degraded in lysozymes: larger and more complex proteins Endoc
19、ytosed and degraded in lysozymes: larger and more complex proteins peptidespeptidesl lPeritubular capillaries: growth hormonePeritubular capillaries: growth hormonel l肝脏肝脏: insulin, glucagon, epidermal growth factor, antibodies, and t-: insulin, glucagon, epidermal growth factor, antibodies, and t-P
20、APAl l胆道胆道: :l l血液血液: endo-oligopeptidase?: endo-oligopeptidase?l l肠道肠道蛋白肽类药物特点及其应用l l明显的种族特异性：实验动物的选择；明显的种族特异性：实验动物的选择；l l免疫原性：免疫原性：ELISA; ELISA; 反复给药产生抗被测试药物的抗体；反复给药产生抗被测试药物的抗体；l l体内有大量的蛋白肽类物质包括结合蛋白：生物样品的前体内有大量的蛋白肽类物质包括结合蛋白：生物样品的前处理：处理：LC-MSLC-MS；l l被测试药物尤其细胞因子给药量极小（被测试药物尤其细胞因子给药量极小（ng-pg/ml): ng-
21、pg/ml): 检测灵检测灵敏度；敏度；l l存在被测试药物的内源性物质：本底效应；同位素法存在被测试药物的内源性物质：本底效应；同位素法; ; suppression via physiological regulation or feedback, eg, suppression via physiological regulation or feedback, eg, infusing glucose to suppress endogenous insulininfusing glucose to suppress endogenous insulinl l生物活性不仅取决于药物的一级
22、结构生物活性不仅取决于药物的一级结构, ,而且与其二级、三级而且与其二级、三级结构有关：结构有关：生物检定法；生物检定法；生物检定法；生物检定法；生物生物PD-PKPD-PK模型模型蛋白肽类药物样品检测方法 l l免疫测定法免疫测定法 (Immunoassays) (Immunoassays)l l酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-linked immunosobant (Enzyme-linked immunosobant assay,ELISA);assay,ELISA);l l放射免疫测定法放射免疫测定法 (Radioimmunoassay,RIA); (Radioi
23、mmunoassay,RIA);l l免疫放射定量法免疫放射定量法 (IRMA); (IRMA);l l同位素标记示踪法同位素标记示踪法 (Isotope label trace assay) (Isotope label trace assay)l l生物检定法生物检定法 (Bioassays); (Bioassays);l l高效液相（高效液相（HPLCHPLC）、液质联用（）、液质联用（LC-MSLC-MS）法）法: comparable : comparable sensitivity higher selectivity; eg, plasma bradykinin sensitiv
24、ity higher selectivity; eg, plasma bradykinin peptide antagonist;peptide antagonist;l l毛细血管电泳毛细血管电泳(CE)(CE)、高效毛细血管电泳、高效毛细血管电泳(HPCE) (HPCE) 和毛细血和毛细血管电泳色普管电泳色普(CEC)(CEC)；l lReal time PCRReal time PCR、protein chipsprotein chipsELISA法l l一抗（种族特异性）l l抗原（待测药物）l l二抗（酶偶联）l l显色酶底物l l酶标仪ELISA法l l优点优点l l高度的灵敏度高
25、度的灵敏度: ng: ngpg/ml;pg/ml;l l较高的特异性较高的特异性; ;l l易于操作、快速、不使易于操作、快速、不使用同位素、无辐射源用同位素、无辐射源, ,适用于批处理适用于批处理; ;l l试剂使用寿命长；试剂使用寿命长；l l目前最常用的检测方法。目前最常用的检测方法。l l缺点缺点l l待测蛋白多肽的免疫活待测蛋白多肽的免疫活性而非生物活性性而非生物活性; ;l l不能区别具有抗原决定不能区别具有抗原决定族的代谢物片断；族的代谢物片断；l l不能同时测定代谢物片不能同时测定代谢物片断断; ; l l不同来源抗体结合性不不同来源抗体结合性不一；一；l l受一些因素的干扰受
26、一些因素的干扰ELISA法的干扰因素l l具有抗原决定族的代谢物片断；具有抗原决定族的代谢物片断；l l被测试药物的内源性物质；被测试药物的内源性物质；l l基质效应基质效应; ;l l被测试药物的可溶性受体被测试药物的可溶性受体l l结合蛋白结合蛋白; ;l l低亲活力结合蛋白低亲活力结合蛋白l l高亲活力结合蛋白高亲活力结合蛋白l l反复给药产生抗被测试药物的抗体：中和性或非反复给药产生抗被测试药物的抗体：中和性或非中和性中和性l l长期给药；长期给药；l l生物等量性实验生物等量性实验Immunogenicity of native ADI and ADI-SS PEG in mice
27、and rabbits SC生长激素（0.4 IU/kg）后食蟹猴(n=7-8/组)的血清生长激素浓度普通普通ELISA ELISA 、高灵敏度、高灵敏度ELISAELISA（additional additional 增色放大系统）和化学发光增色放大系统）和化学发光ELISA ELISA 法法(luminol/(luminol/过氧化氢底物过氧化氢底物) )灵敏度和线性范围比较灵敏度和线性范围比较 (From (From 汤仲明，汤仲明，20022002）放射免疫测定法和免疫放射定量法l l抗原，标记抗原，抗体l l灵敏度高，尤其免疫放射定量法l l需同位素l l常用于激素浓度测定同位素标记
28、示踪法同位素标记示踪法l l在目标蛋白多肽分子上标记同位素在目标蛋白多肽分子上标记同位素, ,从而鉴别目标蛋白多肽从而鉴别目标蛋白多肽与内源性蛋白多肽与内源性蛋白多肽l l该法需将目标蛋白多肽进行同位素标记该法需将目标蛋白多肽进行同位素标记, ,标记方法有外标法标记方法有外标法( (化学联接法化学联接法) ) 和内标法和内标法( (掺入法掺入法) 2 ) 2 种；种；l l外标法：将标记物如外标法：将标记物如125 I 125 I 通过化学方法偶联至完整蛋白中如蛋白通过化学方法偶联至完整蛋白中如蛋白中酪氨酸或赖氨酸等，常用的化学方法有氯胺中酪氨酸或赖氨酸等，常用的化学方法有氯胺T T 或或Io
29、dogenIodogen法法l l内标法：可用即将标记以内标法：可用即将标记以3H ,14C 3H ,14C 或或35S 35S 等同位素的氨基酸加入等同位素的氨基酸加入生长细胞或合成体系中生长细胞或合成体系中, ,从而获得含同位素的蛋白多肽分子从而获得含同位素的蛋白多肽分子, ,但因其但因其操作复杂而少用；操作复杂而少用；l l标记后蛋白多肽表征：标记后蛋白多肽表征：l l比放射性比放射性l l放射性纯度放射性纯度l l标记的蛋白多肽的生物活性。标记的蛋白多肽的生物活性。同位素标记示踪法同位素标记示踪法l l优点优点l l灵敏度高灵敏度高l l简便直观简便直观l l检测迅速检测迅速l l尤其
30、适用于蛋白肽类药尤其适用于蛋白肽类药物的组织分布物的组织分布l l缺点缺点l l同位素标记同位素标记l l一般不能进行人体药物动力一般不能进行人体药物动力学研究学研究; ;l l可能引起药物的生物活性及可能引起药物的生物活性及代谢行为发生变化；代谢行为发生变化；l l由于蛋白多肽进入体内会被由于蛋白多肽进入体内会被降解代谢降解代谢, ,或标记氨基酸的或标记氨基酸的生物再利用，或与其它蛋白生物再利用，或与其它蛋白质结合质结合, ,总的放射性不能代总的放射性不能代表药物动力学过程表药物动力学过程同位素标记示踪法同位素标记示踪法与其他分析手段联合应用l lSDS-PAGEl l三氯醋酸(TCA) 沉
31、淀法l lHPLC 法生物检定法生物检定法l l利用被测蛋白多肽类药物某种特异生物反应利用被测蛋白多肽类药物某种特异生物反应, ,通过通过剂量剂量( (浓度浓度) )效应曲线对目标蛋白多肽进行定量效应曲线对目标蛋白多肽进行定量测定的一种分析方法；测定的一种分析方法；l l分为离体分析法和在体分析法；分为离体分析法和在体分析法；l l离体分析法通常采用细胞体外培养技术离体分析法通常采用细胞体外培养技术, ,以细胞的以细胞的增殖、分化或细胞毒性为基础增殖、分化或细胞毒性为基础, ,以细胞数目的增减以细胞数目的增减等为量效指标，如水蛭素等为量效指标，如水蛭素(hirudin) (hirudin) 凝
32、血酶时间测凝血酶时间测定；定；l l在体分析法则利用蛋白多肽类药物在整体动物中在体分析法则利用蛋白多肽类药物在整体动物中引起的特异生物学反应，如胰岛素降底小鼠血糖。引起的特异生物学反应，如胰岛素降底小鼠血糖。Pharmacokinetic analyses of ADISS PEG and ADISS PEG Pharmacokinetic analyses of ADISS PEG and ADISS PEG measured by enzyme and ELISA assaysmeasured by enzyme and ELISA assays生物检定法生物检定法缺点l l缺乏特异性缺乏
33、特异性, ,不能定量其代谢产物不能定量其代谢产物, ,不能区分内源性不能区分内源性和外源性细胞因子和外源性细胞因子; ;l l灵敏度差灵敏度差, ,为启动生物过程细胞因子的浓度必须在为启动生物过程细胞因子的浓度必须在阈水平以上阈水平以上, ,低于阈水平的样品将不能被定量低于阈水平的样品将不能被定量, ,从而从而降低了方法的灵敏度降低了方法的灵敏度; ;l l耗时耗时, ,为完成分析需时间较长为完成分析需时间较长, ,往往达数日或数周；往往达数日或数周；l l重复性差重复性差, ,不同实验室的结果有很大差异性不同实验室的结果有很大差异性, ,致不同致不同单位之间的比较难以进行单位之间的比较难以进
34、行; ;l lPharmacokineticsPharmacokinetics？延长半衰期常用方法l l聚乙二醇化(Pegylation)l l白蛋白融合(albumin fusion)l l可溶性受体融合(soluble receptor fusion)l l糖链化(glycosylation)Pharmacokinetic profiles for interferon (IFN)-2a and 40 kDa polyethylene glycol (PEG)IFN-IV or SC albutropinIV or SC albutropin（growth hormonealbumin growth hormonealbumin fusionfusion）or GH in rats and monkeysor GH in rats and monkeys
