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1、目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。 基因克隆的本质是把某一目的基因克隆的本质是把某一目的DNA片段通过无片段通过无性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。体和寄主细胞来实现的。 一般而言，基因克隆包括四部分工作：一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标、目标DNA片段的获得；片段的获得；2、克隆载体的构建；、克隆载体的构建；3、寄主细胞的转化；、寄主细胞的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定、重组体克隆的选择和鉴定。 目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等目前，以大肠
2、杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。大肠杆菌作为寄主进行大肠杆菌作为寄主进行DNADNA克隆的实验方案克隆的实验方案DNADNA片段片段的获得的获得载体构建载体构建细菌转化细菌转化重组体重组体的鉴定的鉴定限制性内限制性内切酶消化切酶消化机械切割机械切割双链双链cDNA的合成的合成化学法化学法直接合成直接合成同聚物同聚物加尾加尾粘性末端粘性末端连接连接平末端平末端连接连接加接头造成加接头造成粘性末端粘性末端重组噬菌体重组噬菌体DNA转染转染重组质粒重组质粒的转化的转化体外包装体外包装进行转导进行转导表型鉴定表型鉴定核酸杂交核酸杂交免
3、疫学分析免疫学分析酶切鉴定酶切鉴定第一节 基因组DNA片断化一、限制性内切酶法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同切成不同大小的片断。大小的片断。酶切酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。体连接。1. 优点2. 缺点缺点目的基因目的基因内部内部也可能有该内切酶的切点。也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene二、随机片断化1. 限制性内切酶局部消化法限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶
4、切位点只有一部分被随机因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。切开。 内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶的内切酶平均每平均每46（4096）bp一个切点。一个切点。2）6bp的内切酶的内切酶平均每平均每44（256）bp一个切点。一个切点。随机程度高。如随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。 内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）2. 机械切割法（1）超声波）超声波超声波强烈作用于超声波强烈作用于DNA，可使
5、其断，可使其断裂成约裂成约300bp的随机片断。的随机片断。（2）高速搅拌）高速搅拌1500转转/分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约8kb的随机片断。的随机片断。1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法提出了用化学方法合成基因的设想，并于合成基因的设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸酸tRNA基因的论文。基因的论文。第二节 化学合成目的基因一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法固相合成法自动化合成法。自动化合成法。
6、化学合成的化学合成的DNA片断一般在片断一般在200bp以内。以内。 二、 化学合成DNA片断的组装用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的5端带端带上磷酸。上磷酸。1. 互补连接法互补连接法预先设计合成的片断之间都有预先设计合成的片断之间都有互补互补区域区域，不同片断之间的互补区域能，不同片断之间的互补区域能形成有形成有断点断点的完整双链。的完整双链。（2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互补配对）互补配对（合成的（合成的DNADNA单链的单链的5 5端是端是-OH-OH）T4 DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双链双链（
7、3）连接酶连成完整双链2. 互补延伸连接法预先设计的片断之间有预先设计的片断之间有局部互补区局部互补区，可以，可以相互作为另一个片断延长的引物，用相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶聚合酶延伸成完整的双链。延伸成完整的双链。3 5 5 3 5 3 T4DNA连接酶连接酶Klenow片段片段引物引物1. 直接合成基因直接合成基因三、 寡聚核苷酸化学合成的优点2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难作的含量很低，很难作cDNA 3. 合成探针序列合成探针序列4. 定点突变合成定点突变合成合成带有合成带有定点突变定点突变的基因片断。的基因片断。（2）
8、有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪5. 合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点含有各种酶切位点人工接头人工接头（Adaptor）或）或衔接物衔接物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割切割成大小合适的片断，并将成大小合适的片断，并将所有这些片断所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中细胞中保存和扩增保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的物
9、体的全部基因全部基因，称为基因文库。，称为基因文库。一、基因文库的构建一、基因文库的构建1. 基因文库（基因文库（gene library）第三节 目的基因的保存和扩增（2 2）目前常用的载体目前常用的载体 2. 构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的建完整的基因文库所需要的重组子重组子的数目。的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目片断数目越少，所需的越少，所需的重组子重组子越少。越少。（1 1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列： 容量为容量为 24 kp cosmid载
10、体：载体： 容量为容量为 50 kb YAC： 容量为容量为 1 Mb BAC: 容量为容量为 300 kb断点完全随机，片断长度合适于载体连接。断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体）染色体DNA大片段的制备大片段的制备3. 基因文库构建的一般步骤超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb）。）。 物理切割法：物理切割法：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化。可得到进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。 酶切法：酶切法：（2）载体与基因组DNA大片段的连接 粘性末端直接连接粘性末端
11、直接连接载体与外源载体与外源DNA大片段的两个末端大片段的两个末端都有相同的粘性末端。都有相同的粘性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法（adaptor）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可以向公司定做或购买。各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶粘性末端粘性末端 同聚物加尾同聚物加尾4. 基因组文库的大小一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所时所需要的克隆
12、数目。需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f: 插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因片断的平均长度占整个基因 组组DNA的的百分数百分数N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）例如：人的基因组是例如：人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片断的平均片断的平均长长度如果是度如果是1.7104 bpN=ln (1-p)ln (1-f)=ln (1-99%)ln (1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；大小；f：fragment大小大小N=4.61
13、Gf=4.6131091.7104= 8.11051. cDNA以以mRNA为模板为模板逆转录逆转录出的出的DNA称称cDNA。2. cDNA library二、 cDNA文库的构建mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称行保存和扩增，称cDNA文库。文库。（1）不含内含子序列不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有）包含了所有编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因。 （4）比）比D
14、NA文库小文库小的多，容易构建。的多，容易构建。4. 构建cDNA文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取3. cDNA文库的特点文库的特点提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。 利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，将将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。 mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化 原理原理 mRNA的分离纯化的分离纯化Column（柱）（柱）反转录酶反转录酶（3）cDNA
15、的合成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成DNA。 用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合（或随机引物）作引物，合成成cDNA的第一链。的第一链。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物用用碱碱处理或用处理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物cDNA第一链第一链3 5 引物引物 降解mRNA模板或或RNaseH碱碱方法一：剩下的方法一：剩下的cDNA单链的单链
16、的3末端一般形末端一般形成一个成一个弯回来的双链发卡结构弯回来的双链发卡结构（机理不明）（机理不明），可成为合成第二条，可成为合成第二条cDNA链的引物。用链的引物。用DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链第一链5 cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第二链合成这种酶能识别这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小，并将其降解成许多小片断片断。方法二：妙用RNaseH小片断正好成为小片断正好成为DNA聚合酶的引物，聚合酶的引物，用来合成用来合成冈崎片断冈崎片断。DN
17、A Pol I除去引物并修补后再使用除去引物并修补后再使用DNA连接酶连接酶连成一整条连成一整条DNA链。链。mRNAcDNA3 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 5 引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA第一链第一链3 5 RNaseHDNA ligase去引物去引物去掉发卡结构核酸酶核酸酶S1用用核酸酶核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会可以切掉发卡结构（但这会导致导致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDN
18、A第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 5 3 在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头，即可与载，即可与载体连接，转入受体菌。体连接，转入受体菌。 或借助或借助末端转移酶末端转移酶给载体和双链给载体和双链cDNA的的3端分别加上几个端分别加上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶6. cDNA文库的大小一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的的mRNA时时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1- )p: 文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率
19、（的概率（99%）: 某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整个占细胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）1n1n三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组用目的基因探针与文库中的重组载体进行载体进行Southern blot杂交。杂交。文库文库载体载体探针探针电泳后杂交电泳后杂交放射自显影放射自显影测序分析测序分析第四节 目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离一、目的基因的分离1. 探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合根据已知的基因序列合成探针，结合到到纤维素柱纤维素柱上，用
20、来分离纯化该基因上，用来分离纯化该基因的的mRNA。富集富集特定基因的特定基因的mRNA或或cDNA模板。模板。纤纤 维维 柱柱探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNATotal mRNA纤纤 维维 柱柱探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA过柱过柱与探针碱基互补的与探针碱基互补的mRNA结合结合到柱上，其它到柱上，其它mRNA流走。流走。特异特异mRNA洗脱洗脱RT-PCR2. mRNA消解杂交原理：原理：羟基磷灰石柱羟基磷灰石柱结合单链结合单链DNA-RNA或或DNA-DNA双双链，不结合单链链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatite colu
21、mn）从表达从表达A蛋白蛋白和不表达和不表达A蛋白的组织细胞中蛋白的组织细胞中分别提取和分离分别提取和分离总总mRNA。 将表达将表达A蛋白的蛋白的mRNA合成合成cDNA第一链。第一链。再同不表达再同不表达A蛋白的总蛋白的总mRNA杂交成杂交成cDNA-mRNA双链。双链。 不能杂交的不能杂交的cDNA就包括特异表达的就包括特异表达的A基因基因的的cDNA单链。单链。 用用羟磷灰石柱羟磷灰石柱收集单链收集单链cDNA，合成为双链，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。进行扩增、克隆、测序。AAA组织组织B组织组织总总mRNA（A）总总mRNA（B）含蛋白含蛋白A的的mRNA不含蛋白不含蛋白A
22、的的mRNA总总cDNA第一链第一链A杂交杂交内含蛋白内含蛋白A 的的cDNA羟磷灰石柱羟磷灰石柱过柱过柱吸收吸收RNA-DNA单链滤过单链滤过羟磷灰石柱羟磷灰石柱BAPCR16cDNA文库文库3. mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）mRNA differential display RT-PCR（1）3端的锚定引物端的锚定引物Oligo(dT)引物的引物的3端加两个核苷酸端加两个核苷酸（倒数第二个不再是（倒数第二个不再是T）。）。 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTTM：A、G or C N: A、G、T or C5 3 （2）12种锚定引物AGTT
23、TTTTTT5 3 CGTTTTTTTT5 3 GGTTTTTTTT5 3 TGTTTTTTTT5 3 AATTTTTTTT5 3 CATTTTTTTT5 3 GATTTTTTTT5 3 TA TTTTTTTT5 3 ACTTTTTTTT5 3 CCTTTTTTTT5 3 GCTTTTTTTT5 3 TCTTTTTTTT5 3 （3）5端的随即引物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTT5 3 扩增扩增cDNA第一链。第一链。RTNMTTTTTTTT5 cDNA 3 NNNNNNNNNN5 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二链，并第二链，并P
24、CR（4）随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物，若与种锚定引物，若与20种随机引物，可种随机引物，可组成组成240组引物。组引物。引物组合：引物组合：240组能分出组能分出20000多条带！多条带！实验结果：实验结果：如果每条带相当于一种如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中基本上反映了一种特定细胞中全部的全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出在测序胶上，每组扩出50-100条长条长度为度为100-500bp的带。的带。（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较不同组织的不同组织的240组引物组合组引物组合PCR产物在产物在测序胶中电泳。测序胶中电泳。选择
25、有差异的带，进一步选择有差异的带，进一步PCR作探针。作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。筛选文库，找到差别基因的全长序列。二、PCR扩增获得目的基因1. 直接从基因组中扩增直接从基因组中扩增（1）提取基因组）提取基因组DNA作模板作模板（2）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增扩增真核生物基因组含有内含子！真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。适合扩增原核生物基因。原核基因组部分原核基因组部分原核细胞原核细胞提取基因组提取基因组DNAPCR扩增扩增（1）提取基因组）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总）反转录合成总cDNA作模板作模板（4）PCR扩增扩增（3）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物2. 从mRNA中扩增: RT-PCR原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾。尾。适合扩增真核生物基因。适合扩增真核生物基因。目的基因目的基因 的引物的引物1反转录成目的基因反转录成目的基因cDNA第一链第一链目的基因目的基因 的引物的引物2目的目的 基因基因cDNA第二链第二链PCRmRNA
