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1、无菌检查、微生物无菌检查、微生物限度检查限度检查方法学方法学验证实例验证实例8/28/20241虎杖苷注射液无菌检查的方法验证虎杖苷注射液无菌检查的方法验证 样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司 提供，批号提供，批号提供，批号提供，批号20040305200403052004030520040305。培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基， 批号批号批号
2、批号040203040203040203040203；霉菌液体培养基，批号；霉菌液体培养基，批号；霉菌液体培养基，批号；霉菌液体培养基，批号 040302 040302 040302 040302； 营养肉汤培养基，批号营养肉汤培养基，批号营养肉汤培养基，批号营养肉汤培养基，批号 0403045 0403045 0403045 0403045；营养琼脂培；营养琼脂培；营养琼脂培；营养琼脂培养基，批号养基，批号养基，批号养基，批号 040513 040513 040513 040513；0.1%0.1%0.1%0.1%蛋白胨溶液，批号蛋白胨溶液，批号蛋白胨溶液，批号蛋白胨溶液，批号0502170
3、50217050217050217；虎红钠琼脂培养基，批号；虎红钠琼脂培养基，批号；虎红钠琼脂培养基，批号；虎红钠琼脂培养基，批号040202040202040202040202；由；由；由；由中检所所培养基室提供。中检所所培养基室提供。中检所所培养基室提供。中检所所培养基室提供。8/28/20242 方法：中国药典方法：中国药典20052005版无菌检查中薄膜版无菌检查中薄膜过滤法方法验证过滤法方法验证 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（2600326003）、铜绿假单胞）、铜绿假单胞菌（菌（1010410104）、枯草芽孢杆
4、菌（）、枯草芽孢杆菌（6350163501）、）、生孢梭菌（生孢梭菌（6494164941）、白色念珠菌）、白色念珠菌（9800198001）、黑曲霉菌（）、黑曲霉菌（9800398003），来自），来自中国医学细菌保藏中心。中国医学细菌保藏中心。 8/28/20243菌液制备：菌液制备： 取取经经3434培培养养18182424小小时时的的金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、绿绿脓脓假假单单胞胞菌菌与与枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌肉肉汤汤液液体体培培养养物物1 1mlml加加入入9 9ml ml 0.9%0.9%氯氯化化钠钠溶溶液液中中，1010倍倍稀稀释释至至10105 510107 7约约为为50
5、50100100cfucfu/ml/ml备用。备用。 取取经经2424培培养养18182424小小时时的的白白色色念念珠珠菌菌液液体体培培养养物物1 1mlml，加加入入9 9ml ml 0.9%0.9%氯氯化化钠钠溶溶液液中中，1010倍倍稀稀释释至至10105 5约约为为5050100100cfucfu/ml/ml备备用。用。8/28/20244 取取经经3434培培养养18182424小小时时的的生生孢孢梭梭菌菌硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐液液体体培培养养物物1 1ml ml ，加加入入9 9ml ml 0.9%0.9%氯氯化化钠溶液中，钠溶液中，1010倍稀释至倍稀释至10107 7备用。备用
6、。 取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入加入9ml0.9%氯化钠溶液中氯化钠溶液中10倍稀释至倍稀释至104约为约为50100cfu/ml备用备用。 8/28/20245供试液制备：取样品供试液制备：取样品1010瓶分别加瓶分别加0.1%0.1%蛋蛋 白胨溶液白胨溶液30 30 mlml溶解后，过滤。溶解后，过滤。7. 7. 活菌计数活菌计数活菌计数结果见表活菌计数结果见表1 1。8/28/2024610104 4稀释稀释稀释
7、稀释 10105 5稀释稀释稀释稀释 10107 7稀释稀释稀释稀释 试验次数试验次数试验次数试验次数1 1 1 12 2 2 21 1 1 12 2 2 21 1 1 12 2 2 2金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌5656565660606060枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌7777777779797979白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌8686868670707070黑曲霉菌黑曲霉菌黑曲霉菌黑曲霉菌8080808076767676铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌47474747505050508/28/20247 方法验证
8、方法验证直接接种法：取样品直接接种法：取样品1212支，分别接种支，分别接种8 8支硫乙醇酸盐和支硫乙醇酸盐和4 4支霉菌液体培养基支霉菌液体培养基2 2ml/ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌支后，再按要求加入相应的阳性菌液（液（30-10030-100个个/ /mlml），），置规定温度培养置规定温度培养3-53-5天，逐日观察结果。天，逐日观察结果。8/28/20248薄膜过滤法：薄膜过滤法：取样品取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒联筒/套），用套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗蛋白胨氯化钠溶液冲洗500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、后，
9、再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌枯草杆菌50100个个/筒即可，同时平行做稀筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置性菌的验证滤筒置37培养培养35d，逐日观逐日观察，结果见表察，结果见表2、3、4。8/28/202498/28/2024108/28/2024118/28/202412结论：结论： 根据上述结果，由于采用直接接种根据上述结果，由于采用直接接种法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液
10、的无菌检制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。 8/28/202413头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.50.5g/g/瓶；瓶；瓶；瓶；批号：批号：批号：批号：4080700140807001；生产单位：；生产单位：；生产单位：；生产单位：AventisPharmaAventisPharma Deut
11、schlandGmbHDeutschlandGmbH培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、虎红琼脂虎红琼脂虎红琼脂虎红琼脂( (均由中国药品生物制品检定所培养均由中国药品生物制品检定所培养均由中国药品生物制品检定所培养均由中国药品生物制品检定所培养基室提供基室提供基室提供基室提供) ) 内酰胺酶：内酰胺酶：内
12、酰胺酶：内酰胺酶：2 2mlml大于大于大于大于300300单位单位单位单位/ /毫升（批号：毫升（批号：毫升（批号：毫升（批号：2003063020030630）8/28/202414验证试验用菌种：验证试验用菌种：验证试验用菌种：验证试验用菌种：（1 1 1 1）金黄色葡萄球菌）金黄色葡萄球菌）金黄色葡萄球菌）金黄色葡萄球菌( (StaphylococcusStaphylococcusaureusaureus) )CMCC(B)26003CMCC(B)26003；(2)(2)枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（BacillusBacillussubtilissubtil
13、is）CMCC(B)63501CMCC(B)63501；(3)(3)大肠埃希菌（大肠埃希菌（大肠埃希菌（大肠埃希菌（EscherichiacoliEscherichiacoli）CMCC(B)44102CMCC(B)44102；(4)(4)铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌( (PseudomonasPseudomonasaeruginosaaeruginosa) )CMCC(B)10104CMCC(B)10104；（5)5)生孢梭菌生孢梭菌生孢梭菌生孢梭菌( (ClostridiumClostridiumsporogenessporogenes)CMCC(B)64941)CMC
14、C(B)64941；(6)(6)白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌( (CandidaalbicansCandidaalbicans)CMCC(F)98001)CMCC(F)98001； (7)(7)黑曲霉黑曲霉黑曲霉黑曲霉( (AspergillusnigerAspergillusniger)CMCC(F)98003)CMCC(F)98003。 8/28/202415 仪仪器器和和滤滤器器：HTY2000A集集菌菌仪仪，全全封封闭闭无无菌菌试试验验过过滤滤培培养养器器（批批号号20050105）北北京京牛牛牛基因有限公司。牛基因有限公司。方法：中国药典方法：中国药典2005年版无菌检查
15、的验证实年版无菌检查的验证实验验8/28/202416 操作方法操作方法菌液制备：菌液制备： 取取金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌、大大肠肠埃埃希希菌菌、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌的的新新鲜鲜培培养养物物少少许许接接种种至至营营养养肉肉汤汤培培养养基基中中,生生孢孢梭梭菌菌的的新新鲜鲜培培养养物物少少许许接接种种至至硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基中中,32.52.5培养培养1824小时；小时；8/28/202417 取取经经32.52.5培培养养1921h小小时时的的大大肠肠埃埃希希菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌、铜铜绿绿假假单单孢孢
16、菌菌肉肉汤汤培培养养物物1ml，加加9ml生生理理盐盐水，水，10倍稀释至约倍稀释至约105108之间。之间。 取取经经36培培养养1822h的的生生孢孢梭梭菌菌硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基培培养养物物1ml，加加9ml生生理理盐盐水水，10倍稀释至倍稀释至106，混匀备用。，混匀备用。8/28/202418 白白色色念念珠珠菌菌的的新新鲜鲜培培养养物物接接种种至至改改良良马马丁丁培培养养基基或或改改良良马马丁丁琼琼脂脂培培养养基基中中见见附附录录1.3,25.52.5培养培养2448小时。小时。 取经取经25.52.5培养培养72小时的白色念珠菌小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加
17、入生理盐水真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取吸出转移至空试管作为原液，取1ml加加9ml生生理盐水，理盐水，10倍稀释至倍稀释至106，取，取1.2ml加生理盐加生理盐水水9ml，混匀备用。混匀备用。8/28/202419 将将黑黑曲曲霉霉菌菌斜斜面面的的新新鲜鲜培培养养物物接接种种至至改改良良马马丁丁琼琼脂脂斜斜面面培培养养基基上上，25.52.5培培养养57d，使使大大量量的的孢孢子子成成熟熟。取取经经25培培养养7d的的黑黑曲曲霉霉真真菌菌斜斜面面培培养养物物，加加入入生生理理盐盐水水4ml洗洗下下孢孢子子，吸吸出出转转移移至至空空试试管管
18、作作为为原原液液，稀稀释释至至104，取取0.5ml加生理盐水加生理盐水10ml混匀备用。混匀备用。8/28/202420菌液计数：分别取上述菌液计数：分别取上述5种细菌菌液种细菌菌液1ml加加入培养皿，每种菌液做平行入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养皿。注入营养琼脂约琼脂约18ml。3035培养（生孢梭菌置厌培养（生孢梭菌置厌氧培养箱中培养）。分别取上述氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌种真菌菌液液1ml加入培养皿，每种菌液做平行加入培养皿，每种菌液做平行2皿。皿。注入虎红琼脂约注入虎红琼脂约18ml。2328培养。培养。 8/28/202421供供试试液液制制备备：每每2支支以以1
19、00ml生生理理盐盐水溶解，混匀备用。水溶解，混匀备用。薄薄膜膜过过滤滤：将将规规定定量量的的供供试试品品按按薄薄膜膜过过滤滤法法过过滤滤，冲冲洗洗，每每次次50ml，在在最最后后一一次次的的冲冲洗洗液液中中逐逐一一加加入入试试验验菌菌少少于于100CFU。按按规规定定将将培培养养基基直直接接加至滤筒内。每天观察并记录结果。加至滤筒内。每天观察并记录结果。8/28/202422阳阳性性对对照照：另另取取滤滤筒筒，不不过过滤滤供供试试品品，其其它它操操作作同同上上，作作为为阳阳性性对对照照，将将含含培培养养基基的的容容器器按按规规定定温温度度培培养养35天天。各各试试验验菌菌及及相相应应的的培培
20、养养基基逐逐一一进进行行验验证证。取取未未加加样样品品的的滤滤器器分分别别加加硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基5桶桶及真菌培养基及真菌培养基2桶，桶，100ml/桶。桶。阴阴性性对对照照：两两个个滤滤器器桶桶内内各各过过滤滤生生理理盐盐水水200ml，然然后后分分别别加加入入硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐培培养养基基和和真真菌菌培培养养基基各各100ml，不不加加对对照照菌菌液液，分分别别于于3035及及2328培养。培养。8/28/202423 培培养养：硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基桶桶3035培培养养；真真菌菌培培养养基基桶桶2328培培养养。观观察察结结果。果。结果结果细菌和真
21、菌数计数结果分别见表细菌和真菌数计数结果分别见表1和表和表2。 8/28/202424表表表表11细菌数计数细菌数计数细菌数计数细菌数计数 表表表表22真菌数计数结果真菌数计数结果真菌数计数结果真菌数计数结果 菌菌菌菌 种种种种大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄金黄色葡萄金黄色葡萄金黄色葡萄球菌球菌球菌球菌 枯草芽孢杆枯草芽孢杆枯草芽孢杆枯草芽孢杆菌菌菌菌 铜绿假单胞铜绿假单胞铜绿假单胞铜绿假单胞菌菌菌菌 生孢梭菌生孢梭菌生孢梭菌生孢梭菌 计数计数计数计数( (CFUCFU) )2222262636363939626266665858545420202020均值均值均值均值(
22、(CFUCFU) )24243838646456562020菌菌 种种黑曲霉菌黑曲霉菌 白色念珠菌白色念珠菌 计数计数( (CFU)CFU)8686939386868383均值均值( (CFU)CFU)898985858/28/202425实验结果见表实验结果见表3和表和表4表表表表33细菌实验结果细菌实验结果细菌实验结果细菌实验结果(20(20小时观察小时观察小时观察小时观察) )大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌生孢梭菌生孢梭菌生孢梭
23、菌生孢梭菌冲洗量冲洗量冲洗量冲洗量800800mlml7272h()h()+ + + + +冲洗量冲洗量冲洗量冲洗量10001000mlml + + + + +阳性对阳性对阳性对阳性对照照照照+ + + + + +8/28/202426表表表表436436小时观察真菌结果小时观察真菌结果小时观察真菌结果小时观察真菌结果黑曲霉菌黑曲霉菌黑曲霉菌黑曲霉菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌冲洗量冲洗量冲洗量冲洗量200200mlml+ + +冲洗量冲洗量冲洗量冲洗量400400mlml+ + +阳性对照阳性对照阳性对照阳性对照+ + +8/28/202427 大肠埃希菌菌液制备：取经大肠埃希菌
24、菌液制备：取经35培养培养1920h的大肠埃希菌肉汤培养物的大肠埃希菌肉汤培养物1ml，加加9ml生理盐水，生理盐水，10倍稀释至倍稀释至106，取，取0.4ml加加盐水盐水10ml混匀，做活菌计数备用。混匀，做活菌计数备用。取取12支样品，每支样品，每2支以支以100ml生理盐水溶生理盐水溶解，冲洗解，冲洗100ml每次，做冲每次，做冲300、500ml、800ml二桶，各加入硫乙醇酸盐培养基二桶，各加入硫乙醇酸盐培养基100ml和和内酰胺酶内酰胺酶2支。分别加入大肠杆支。分别加入大肠杆菌菌液（肉汤培养物菌菌液（肉汤培养物10倍稀释至倍稀释至107）1ml。结果见表结果见表5。 8/28/2
25、02428表表表表55实验结果（大肠埃希菌菌数实验结果（大肠埃希菌菌数实验结果（大肠埃希菌菌数实验结果（大肠埃希菌菌数5454CFUCFU）培养时间培养时间培养时间培养时间1414h h2525h h3838h h110110h h冲洗量冲洗量冲洗量冲洗量300300mlml 冲洗量冲洗量冲洗量冲洗量500500mlml + + +冲洗量冲洗量冲洗量冲洗量800800mlml + + + +阳性对照阳性对照阳性对照阳性对照+ + + + +8/28/202429结论：结论：头孢噻肟钠无菌原料无菌检查法头孢噻肟钠无菌原料无菌检查法:,取样量取样量3.0克，采用薄膜过滤法（封闭滤器为北京克，采用薄
26、膜过滤法（封闭滤器为北京牛牛基因技术有限公司生产）。冲洗液为牛牛基因技术有限公司生产）。冲洗液为0.9的氯化钠溶液，冲洗量的氯化钠溶液，冲洗量800ml，加酶量加酶量2支（大于支（大于300单位单位/ml）以大肠埃希菌为阳以大肠埃希菌为阳性对照菌。性对照菌。 8/28/202430复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法验证实验液微生物限度检查法验证实验样品：复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号样品：复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号样品：复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号样品：复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号309315309315、4020
27、21402021，生产厂家为香港欧化药业有，生产厂家为香港欧化药业有，生产厂家为香港欧化药业有，生产厂家为香港欧化药业有限公司。限公司。限公司。限公司。验验验验证证证证用用用用菌菌菌菌种种种种： 枯枯枯枯草草草草杆杆杆杆菌菌菌菌CMCCCMCC（B B）6350163501、金金金金黄黄黄黄色色色色葡葡葡葡萄萄萄萄球球球球菌菌菌菌CMCCCMCC（B B）2600326003、大大大大肠肠肠肠埃埃埃埃希希希希菌菌菌菌CMCCCMCC（B B）4410244102、白白白白色色色色念念念念珠珠珠珠菌菌菌菌CMCCCMCC (F)(F)9800198001、 黑曲霉黑曲霉黑曲霉黑曲霉CMCC(F)
28、CMCC(F)9800398003。 方法：方法：方法：方法： 中国药典有关微生物限度检查法方法验中国药典有关微生物限度检查法方法验中国药典有关微生物限度检查法方法验中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验。证试验。证试验。证试验。 8/28/202431具体操作方法具体操作方法菌液制备：菌液制备：(1)(1)取取经经37培培养养1824h，金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、大大 肠肠 埃埃 希希 菌菌 、 枯枯 草草 杆杆 菌菌 的的 肉肉 汤汤 培培 养养 物物1ml+9ml盐盐水水，10倍倍稀稀释释至至105107，细细菌菌数约为数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。做活菌计数备用。
29、(2)取取经经25培培养养1824小小时时的的白白色色念念珠珠菌菌霉霉菌菌液液体体培培养养物物1ml+9ml盐盐水水10倍倍稀稀释释至至105107，细细菌菌数数约约为为50100cfu/ml，做做活活菌菌计数备用。计数备用。8/28/202432 取取经经25培培养养1周周的的黑黑曲曲霉霉斜斜面面培培养养物物，加加35ml盐盐水水洗洗下下霉霉菌菌孢孢子子，吸吸取取出出菌菌液液，用用标标准准比比浊浊管管比比浊浊，然然后后取取1ml+9ml盐盐水水，逐逐 管管 10倍倍 稀稀 释释 为为 104， 细细 菌菌 数数 约约 为为50100cfu/ml，做活菌计数备用。做活菌计数备用。供供试试液液制
30、制备备：吸吸取取样样品品10ml，加加0.1%蛋蛋白白胨胨水水氯氯化化钠钠稀稀释释液液90ml浓浓度度均均为为1：10供供试液，分别人工污染上述试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株种代表试验菌株。 8/28/202433回收率测定：回收率测定：(1)(1)试试验验组组:分分别别取取不不同同品品种种的的1：10供供试试液液1ml、50100个个/ml试试验验菌菌株株同同时时加加入入平平皿皿中中，立立即即倾倾注注琼琼脂脂培培养养基基，待待凝凝固固后后，置置规规定定温温度度培培养养2472小小时时观观察察结结果果。薄薄膜膜过过滤滤法法以以最后一次的冲洗液加入试验菌最后一次的冲洗液加入试验菌.(2)
31、活菌组活菌组测定每一菌株的试验菌数测定每一菌株的试验菌数(3)供试液对照供试液对照测定供试品本底菌数测定供试品本底菌数(4)稀释剂对照组稀释剂对照组8/28/202434结果结果菌菌落落计计数数结结果果、常常规规法法和和培培养养基基稀稀释释法法在在复复方方磷磷酸酸可可待待因因微微生生物物限限度度检检查查法法的的验验证结果见表证结果见表1、2和表和表3。8/28/202435表表表表11菌落计数（菌落计数（菌落计数（菌落计数（cfucfu/ml/ml）实验次数实验次数实验次数实验次数金葡菌金葡菌金葡菌金葡菌101055枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌101055白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌白色
32、念珠菌101055黑曲霉黑曲霉黑曲霉黑曲霉101044大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌1010771 19494、9090130130、80807373、7272110110、90901414、15152 28080、74744545、2323128128、108108110110、1201205454、34343 3153153、1501507878、77777373、7474110110、1001003030、27278/28/202436表表表表22复方磷酸可待因微生物限度检查方法验证复方磷酸可待因微生物限度检查方法验证复方磷酸可待因微生物限度检查方法验证复方磷酸可待因微生物限度
33、检查方法验证 （常规法）（常规法）（常规法）（常规法） 实验次数实验次数实验次数实验次数人工染菌回收率人工染菌回收率人工染菌回收率人工染菌回收率%金葡菌金葡菌金葡菌金葡菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌白色念珠白色念珠白色念珠白色念珠菌菌菌菌黑曲霉黑曲霉黑曲霉黑曲霉大肠埃希大肠埃希大肠埃希大肠埃希菌菌菌菌1 10.020.0271.471.481.181.1100.0100.0100.0100.02 229.229.229.429.4100.0100.0100.0100.0100.0100.03 3抑菌抑菌抑菌抑菌抑菌抑菌抑菌抑菌100.0100.0100.0100.0100.0100.08/
34、28/202437从表从表2结果可以看出结果可以看出:（1）采用常规方法检验复方磷酸可待因溶）采用常规方法检验复方磷酸可待因溶液供试品，人工污染液供试品，人工污染5株代表菌株，该供试株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于收率试验均高于70%，可采用常规方法检验。，可采用常规方法检验。（2）复方磷酸可待因对金黄色葡萄球菌、）复方磷酸可待因对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有不同程度的抗菌活性，供试品回枯草杆菌有不同程度的抗菌活性，供试品回收率为收率为0.0229.2%，均低于，均低于70%。8/28/202438 培养基稀释法：培养基
35、稀释法：采用加采用加0.5ml、0.2ml、0.1ml/皿供试液，皿供试液，再加再加1520ml琼脂培养基，待凝固后，琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养置规定温度培养2448小时观察结果细菌小时观察结果细菌计数，测定回收率。计数，测定回收率。 常常常常规规规规法法法法为为为为1 1 1 1mlmlmlml供供供供试试试试液液液液加加加加1520152015201520mlmlmlml菌菌菌菌落落落落计计计计数数数数用用用用培培培培养养养养基基基基；培培培培养养养养基基基基稀稀稀稀释释释释法法法法则则则则为为为为0.50.50.50.5mlmlmlml供供供供试试试试液液液液加加加加15201
36、52015201520mlmlmlml菌菌菌菌落落落落计计计计数数数数用用用用培培培培养养养养基基基基为为为为2 2 2 2倍倍倍倍稀稀稀稀释释释释，0.20.20.20.2mlmlmlml供供供供试试试试液液液液加加加加1520152015201520mlmlmlml菌落计数用培养基为菌落计数用培养基为菌落计数用培养基为菌落计数用培养基为5 5 5 5倍稀释。倍稀释。倍稀释。倍稀释。8/28/202439表表表表33培养基稀释法（培养基稀释法（培养基稀释法（培养基稀释法（1 1mlml加加加加2 2个平皿）复方磷酸可待因个平皿）复方磷酸可待因个平皿）复方磷酸可待因个平皿）复方磷酸可待因微生物
37、限度检查验证微生物限度检查验证微生物限度检查验证微生物限度检查验证 实验次数实验次数实验次数实验次数人工染菌回收率人工染菌回收率人工染菌回收率人工染菌回收率%金葡菌金葡菌金葡菌金葡菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌1 180.780.7100.0100.02 291.491.4100.0100.08/28/202440表表3中的结果证明，采用培养基稀释法可消中的结果证明，采用培养基稀释法可消除供试品对人工污染金黄色葡萄球菌和枯草除供试品对人工污染金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑菌作用。回收率达到杆菌的抑菌作用。回收率达到70%以上。因以上。因此，培养基稀释法（此，培养基稀释法（0.5ml/皿）可用于复方皿）可用于复方磷酸可待因（欧博士止咳露）的微生物限度磷酸可待因（欧博士止咳露）的微生物限度检查。检查。结论结论根据验证试验结果，确定复方磷可待因（欧根据验证试验结果，确定复方磷可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法为细菌博士止咳露）溶液微生物限度检查法为细菌数测定可采用培养基稀释法（数测定可采用培养基稀释法（0.5ml/皿）测皿）测定，霉菌数可采用常规法测定。定，霉菌数可采用常规法测定。 8/28/2024418/28/202442
