抗体的制备与纯化技术

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1、 大家下午好！第二篇第二篇分子免疫学技术授课内容分子免疫学技术授课内容一、特异性抗体的制备与纯化技术一、特异性抗体的制备与纯化技术二、蛋白质研究水平的分子免疫学技术二、蛋白质研究水平的分子免疫学技术四、基因组和蛋白质组研究水平的分子免疫学技术四、基因组和蛋白质组研究水平的分子免疫学技术授课方式：讲授、自学、演示相结合授课方式：讲授、自学、演示相结合三、三、DNA研究水平的分子免疫学技术研究水平的分子免疫学技术第三章 特异性抗体的制备与纯化技术绪绪 论论特异性抗体：特异性抗体：多克隆抗体（抗血清）多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体（杂交瘤技术）单克隆抗体（杂交瘤技术）基因工程抗体基因工程抗体第一节

2、多克隆抗体的制备与纯化多克隆抗体：由某一抗原刺激机体后产生的多克隆抗体：由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体的混合物，即多克隆抗体。原决定簇的抗体的混合物，即多克隆抗体。多克隆抗体（抗血清）的制备流程多克隆抗体（抗血清）的制备流程 抗原抗原半抗原半抗原+载体载体佐剂佐剂免疫动物（免疫动物（3-5次）次）测效价测效价动物采血，分离血清动物采血，分离血清抗血清纯化、鉴定、保存抗血清纯化、鉴定、保存一、抗原制备1、抗原的制备、抗原的制备1）细胞性抗原或颗粒性抗原细胞性抗原或颗粒性抗原：细胞性抗原主要包括人、细胞性抗原主要

3、包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。如菌体（如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置温箱板培养基表面；置温箱37培养培养24h，用适量的无菌生理盐，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀菌水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀菌体；体；100水裕水裕22.5h杀菌并破会鞭毛抗原。取处理过的杀菌并破会鞭毛抗原。取处理过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升每毫升

4、8亿亿10亿个细菌，加入苯酚至最终浓度为亿个细菌，加入苯酚至最终浓度为5，即为，即为O抗原。抗原。 2）可溶性抗原）可溶性抗原可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，酶、补体、细菌外毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴定后才能用做免疫原。定后才能用做免疫原。（1）组织匀浆的制

5、备）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在及大血管，在4水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。 （2 2）细胞破碎）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。酶处理

6、法等。 超声破碎：一次超声超声破碎：一次超声1 12min2min，总时间为，总时间为101015min15min。（3）蛋白提纯 超速离心法超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油、：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油、CsClCsCl； 选择性沉淀法选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33335050饱和度的硫酸饱和度的硫酸胺收集沉淀物；胺收集沉淀物； 凝胶层析法凝胶

7、层析法（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离；（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离； 离子交换层析；离子交换层析；带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的结合力大小的差别而进行分离 亲和层析亲和层析：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、激素：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、激素受体、受体、IgGIgG和葡糖

8、球菌蛋白蛋白和葡糖球菌蛋白蛋白A A（SPASPA）；）； 制备电泳技术。制备电泳技术。 其它聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白 可将抗原所在的电泳条带（或蛋白点）切下可将抗原所在的电泳条带（或蛋白点）切下, ,研磨后直接研磨后直接用以动物用以动物免疫免疫。 NC膜结合蛋白膜结合蛋白将含目的分子的蛋白进行将含目的分子的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至电泳，转移至NC膜膜上，丽春红显色至清晰显示目的条带，取目的条带置于加有上，丽春红显色至清晰显示目的条带，取目的条带置于加有PBS的的1.5ml离心管中，用离心管中，用PBS洗至无色，继而剪碎、研磨，洗至无色，继而剪碎、研磨，用于动物

9、用于动物免疫免疫。（4）纯化抗原的鉴定含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法，含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法，一般采用分光光度计测量法；一般采用分光光度计测量法；相对分子量的鉴定：一般采用相对分子量的鉴定：一般采用SDS-PAGE电电泳法；泳法；纯度鉴定：常用区带电泳法鉴定。纯度鉴定：常用区带电泳法鉴定。3）半抗原半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂质、核酸、某些药多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂质、核酸、某些药物及其它化学药品；物及其它化学药品；常用载体：常用载体：蛋白质类蛋白质类如：牛血清白蛋白、人血清清如

10、：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物多肽聚合物：如多聚：如多聚Lys大分子聚合物大分子聚合物：如羟甲基纤维素；：如羟甲基纤维素；半抗原载体连接方法：常用物理法和化学法，物半抗原载体连接方法：常用物理法和化学法，物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原，化学法则是利用某些功能基团把半孔吸附半抗原，化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。抗原连接到载体上。2.佐剂佐剂 1）定义：与抗原同时或预先注射于机体能增强）定义：与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫类型的物质机体免

11、疫应答或改变免疫类型的物质.2）良好的佐剂应当具备以下条件：）良好的佐剂应当具备以下条件：（1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；基团构型，从而增强抗原的免疫原性；（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使抗原缓的存留时间，降低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；度的抗体；（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫；并

12、使之增生，从而增强了体液免疫；（4）具有无毒性或副作用低的特点。）具有无毒性或副作用低的特点。3）常用佐剂的种类和制备应用最多的是福氏佐剂和细胞因子佐剂应用最多的是福氏佐剂和细胞因子佐剂福氏佐剂：福氏佐剂：不完全佐剂不完全佐剂:液体石蜡液体石蜡+羊毛脂羊毛脂完全佐剂完全佐剂:液体石蜡液体石蜡+羊毛脂羊毛脂+卡介苗卡介苗福氏佐剂：抗原福氏佐剂：抗原=1：1乳化成乳化成“油包水油包水”乳液（乳化乳液（乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。方法主要有研磨法和注射器混合法）。完全佐剂一般不连续完全佐剂一般不连续2次使用次使用细胞因子佐剂细胞因子佐剂IL-2IL-1IFNrCSF等等二、免疫血清的制备1

13、、免疫动物的选择和饲养、免疫动物的选择和饲养选择动物选择动物:哺乳类和禽类哺乳类和禽类1)适龄、健壮、无感染适龄、健壮、无感染2）抗原与免疫动物种属关系：差异越远越好）抗原与免疫动物种属关系：差异越远越好3）抗血清量的需要：量大，选用马、羊等大动物，量小，选）抗血清量的需要：量大，选用马、羊等大动物，量小，选用兔、豚鼠用兔、豚鼠4）实验考虑：如要利用所制备的抗体进行免疫沉淀实验，则）实验考虑：如要利用所制备的抗体进行免疫沉淀实验，则不同种属的抗体与蛋白不同种属的抗体与蛋白A（SPA）的结合能力不一样，如人）的结合能力不一样，如人IgG、兔、兔IgG、猪、猪IgG、狗、狗IgG、猫、猫IgG、驴

14、、驴IgG等与蛋白等与蛋白A强烈结合，而羊强烈结合，而羊IgG、牛、牛IgG等与蛋白等与蛋白A较弱结合，鸡较弱结合，鸡IgG不不能与蛋白能与蛋白A结合。结合。5）抗血清分为）抗血清分为R（rabbit）型和）型和H（horse）型，）型，R型免疫血型免疫血清具有较宽的等价带，适于做诊断试剂；清具有较宽的等价带，适于做诊断试剂；H型免疫血清等价型免疫血清等价带较窄，一般用于做免疫治疗。带较窄，一般用于做免疫治疗。2、免疫方法 剂量：合适，太大，易引起免疫耐受剂量：合适，太大，易引起免疫耐受途径：多用皮内或皮下途径：多用皮内或皮下多点多点注射（足掌、注射（足掌、背部两侧）背部两侧）腋窝淋巴结直接注

15、射腋窝淋巴结直接注射静脉、腹腔注射静脉、腹腔注射间隔时间：第一次免疫间隔时间：第一次免疫（完全佐剂）（完全佐剂）10-20天天第二次免疫第二次免疫（不完全佐剂）（不完全佐剂）7-10天天第三次，第三次，总次数总次数5-8次。次。3、免疫血清采集、分离及保存1）采血前测抗体效价）采血前测抗体效价 在第在第2次加强免疫后次加强免疫后2周，从兔耳缘静脉取周，从兔耳缘静脉取23ml血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。体效价达到预期

16、水平时，即可放血制备抗血清。 抗血清的效价抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是量。效价测定的方法常用的是放射免疫法放射免疫法，此法对，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用原所产生的抗体，可用双向扩散双向扩散等方法测定。前者等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。 放射免疫法：放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射性核素标记）混合，孵育原（放射性核素标记）

17、混合，孵育24h后，测定其后，测定其结合率（用液体闪烁计数仪测定结合率（用液体闪烁计数仪测定AgAg* *AbAb或游离或游离AgAg* *）。通常以结合率为。通常以结合率为50%的血清稀度为效价。的血清稀度为效价。如某抗血清的结合率为如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是，则该血清的效价就是1：15000。抗血。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。等因素的影响，在工

18、作中必须引起注意。双向扩散法双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。及其浓度。琼脂板的制备：琼脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到纱布过滤，待溶液冷却到65左右时，加入叠氮钠（左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移

19、液管把琼脂放在干。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50l），周围），周围各孔内分别加入各孔内分别加入50l 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，及不稀释的抗血清，37下孵育下孵育24h，观察有无沉淀线，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度。产生，以判断血清的稀释度。2）抗血清的采集、分离和保存采集：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血采集：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血分离：室温自然凝固分离：室温自然凝固12h，然

20、后放，然后放4冰箱冰箱过夜，待血块收缩后分离血清，有些血清须过夜，待血块收缩后分离血清，有些血清须经经5630min使补体灭活。使补体灭活。保存：保存：4保存保存存放存放3个月至半年个月至半年低温保存低温保存2至至3年，忌年，忌反复反复冻融冻融冰冻干燥冰冻干燥4-5年年3 3）免疫失败的可能原因及应采取的措施）免疫失败的可能原因及应采取的措施 有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。 （1）免疫）免疫动物动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数

21、量。品系，或扩大免疫动物的数量。 （2）抗原质量抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。 （3）制备的）制备的免疫原免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。 （4）所用的）所用的佐剂佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。加强乳

22、化。 （5）免疫的方法、剂量免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。径是否合适。 （6）动物的）动物的饲养饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。 三、抗体的纯化和鉴定1、目的：尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分、目的：尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分2、纯化方法、纯化方法1）单价特异性抗血清的纯化）单价特异性抗血清的纯化单价特异性是指抗血清只与其特异性抗原发生反

23、应。单价特异性是指抗血清只与其特异性抗原发生反应。去除杂抗体去除杂抗体主要方法：主要方法：亲和层析法亲和层析法（将引起交叉反应的（将引起交叉反应的共同抗原共同抗原交交联到联到Sepharose4B柱上，把要处理的抗血清通过亲和柱上，把要处理的抗血清通过亲和层析柱，共同抗体吸附在柱上，洗脱液则含有特异性层析柱，共同抗体吸附在柱上，洗脱液则含有特异性抗体）；抗体）；吸附法吸附法（指将非特异性抗原液与戊二醛制备成固相吸（指将非特异性抗原液与戊二醛制备成固相吸附剂按附剂按1：10直接加到免疫血清中去除杂抗体）直接加到免疫血清中去除杂抗体）硫酸铵盐析：先用硫酸铵盐析：先用50%饱和度去除白蛋白，再用饱和

24、度去除白蛋白，再用2次次33%饱和度沉淀丙种球蛋白。饱和度沉淀丙种球蛋白。离子交换层析：常用的离子交换剂有离子交换层析：常用的离子交换剂有DEAE纤维素纤维素和和QAE纤维素。以纤维素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附最理想。能吸附血清中多种蛋白质，但不能吸附血清中多种蛋白质，但不能吸附IgG.亲和层析法：将纯抗原（或亲和层析法：将纯抗原（或SPA)交联到交联到Sepharose4B，装柱后，将抗血清通过亲和层析柱，装柱后，将抗血清通过亲和层析柱，特异性吸附特异性吸附IgG。凝胶过滤法：分子筛层析凝胶过滤法：分子筛层析2）特异性IgG类抗体的纯化3、抗体鉴定抗体效价的鉴定；如双向扩散等

25、抗体效价的鉴定；如双向扩散等抗体特异性鉴定：用交叉反应率来表示；抗体特异性鉴定：用交叉反应率来表示；抗体纯度鉴定：可用抗体纯度鉴定：可用PAGE电泳或电泳或SDS-PAGE电泳电泳鉴定；鉴定；抗体亲和力鉴定：抗体亲和力是指抗原、抗体结合抗体亲和力鉴定：抗体亲和力是指抗原、抗体结合牢固的程度。亲和力越大表示抗体与相应抗原结合牢固的程度。亲和力越大表示抗体与相应抗原结合越牢固。抗体亲和力大小常以亲和常数越牢固。抗体亲和力大小常以亲和常数K表示，表示，K的单位是升的单位是升/摩尔。在摩尔。在RIA（放射免疫技术）测定时，（放射免疫技术）测定时，K是该抗血清能达到的最小检出量的倒数。是该抗血清能达到的

26、最小检出量的倒数。K的范的范围在围在1081012L/mol之间。之间。 四四.多克隆抗体的应用与问题多克隆抗体的应用与问题一）应用一）应用免疫学检测免疫学检测被动免疫治疗和紧急预防被动免疫治疗和紧急预防二）存在问题二）存在问题特异性差特异性差,用于免疫学检测容易用于免疫学检测容易出现交叉反应出现交叉反应 第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb)一一.概念概念:通过通过B细胞杂交瘤技术细胞杂交瘤技术,获得特异性针对获得特异性针对某一种抗原决定簇某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均的细胞克隆，产生均一性的抗体一性的抗体.二二.B细胞杂交瘤的类型细胞杂交

27、瘤的类型小鼠小鼠-小鼠小鼠大鼠大鼠-大鼠大鼠小鼠小鼠-人人人人-人人 三三杂交瘤技术的原理杂交瘤技术的原理 1.亲本细胞的选择亲本细胞的选择小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞次黄嘌呤次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核苷转移酶鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型缺陷型免疫脾细胞免疫脾细胞经经抗原抗原免疫的免疫的BALB/c小鼠的脾脏小鼠的脾脏（抗原制备方法同多克隆抗体制备方法）（抗原制备方法同多克隆抗体制备方法）BALB/c小鼠简介小鼠简介1913年，贝格年，贝格(Bagg)从美国商人欧希尔从美国商人欧希尔(Ohio)处购得的白化小鼠原种，处购得的白化小鼠原种，以群内方法繁殖。麦克以群内方法繁殖。麦克多威尔多

28、威尔(MacDowell)在在1923年开始作近交系培育，年开始作近交系培育，至至1932年达年达26代，命名为代，命名为BALB/c品系。安德尔文特品系。安德尔文特(Andervont)等人使等人使BALB/c广为传播和应用。广为传播和应用。1985年我国从美国年我国从美国NIH引进到中国医学科学院引进到中国医学科学院实验动物研究所，为实验动物研究所，为BALB/c第第180代。代。毛色：白化。毛色：白化。主要特性：主要特性：乳腺肿瘤自然发生率低，但用乳腺肿瘤病毒诱发时发病乳腺肿瘤自然发生率低，但用乳腺肿瘤病毒诱发时发病率高率高;卵巢、肾上腺和肺的肿瘤在该小鼠有一定的发生率。卵巢、肾上腺和肺

29、的肿瘤在该小鼠有一定的发生率。易患慢性肺易患慢性肺炎。炎。对放射线甚为敏感。对放射线甚为敏感。与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值较大。较大。20月龄的雄鼠脾脏有淀粉样变。月龄的雄鼠脾脏有淀粉样变。有自发高血压症，老年鼠心脏有自发高血压症，老年鼠心脏有病变，雌雄鼠均有动脉硬化。有病变，雌雄鼠均有动脉硬化。对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对麻疹对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对麻疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次氏体和百日咳组织胺易感因子病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次氏体和百日咳组织胺易感因子敏感。敏感。主要用途：主要用途：广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核

30、医学研究，以广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等及单克隆抗体的制备等。 2.细胞融合细胞融合骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞PEG脾细胞脾细胞融合后细胞的类型融合后细胞的类型:未融合的脾细胞未融合的脾细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞未融合的瘤细胞未融合的瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞3杂交瘤细胞的选择性培养杂交瘤细胞的选择性培养DNA合成的途径合成的途径：糖糖+氨基酸氨基酸氨基喋呤氨基喋呤(Aminopterin,A)TK核苷酸核苷酸DNA胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)核苷酸前体核苷酸前体次黄嘌呤次黄嘌呤HGPRTIMP(Hypoxanthine,H)融合后

31、细胞在融合后细胞在HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨甲蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（thymidine），故名HAT培养基中存活情况中存活情况（脾细胞和骨髓瘤细胞经脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，

32、而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在在HAT选择培养液可以生长繁殖。选择培养液可以生长繁殖。）脾细胞（脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）不能长期生长）骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长，不能生长）杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能够生长），能够生长）4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化杂交瘤细胞的筛选和克隆化 1 1）筛选：）筛选： 在用在用HATHAT选择培养选择培养1 12 2天内，将有大量瘤细胞死亡，天内，将有大量瘤细胞死亡，3 34 4天后瘤天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，细胞消失，杂交细胞形成小集落，HATHAT选择培养液维持选择培养液维持7 710

33、10天后应换天后应换用用HTHT培养液，再维持培养液，再维持2 2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底杂交瘤细胞布满孔底1/101/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2 23 3天换一半培养天换一半培养液。液。 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。的筛选方法，一般以快速、简

34、便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：（常用的方法有：（1 1）放射免疫测定（）放射免疫测定（RIARIA）可用于可溶性抗原、）可用于可溶性抗原、细胞细胞McAbMcAb的检测。（的检测。（2 2）酶联免疫吸附试验（）酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）可用于可溶性抗）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等原、细胞和病毒等McAbMcAb的检测。（的检测。（3 3）免疫荧光试验适合于细胞表面）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的抗原的McAbMcAb的检测。的检测。2）克隆化 杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过经过HAT筛选后的杂交

35、瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体

36、非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。生抗体的能力。克隆化的方法主要有：克隆化的方法主要有：有限稀释法、单个细胞显微操作有限稀释法、单个细胞显微操作法、软琼脂培养法法、软琼脂培养法有限稀释法克隆有限稀释法克隆 （

37、1）克隆前）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。天制备饲养细胞层（同细胞融合）。（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。数。（3）调整细胞为）调整细胞为310个细胞个细胞/ml。（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞入稀释细胞100l。孵育于。孵育于37、5%CO2孵箱中孵箱中 。（5）在第）在第7天换液，以后每天换液，以后每23天换液天换液1次。次。（6）89天可见天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。细胞克隆形成，及时检测抗体活性。（7）将阳性孔的细胞移至）将阳性孔

38、的细胞移至24孔板中扩大培养。孔板中扩大培养。（8）每个克隆应尽快冻存。）每个克隆应尽快冻存。软琼脂培养法克隆软琼脂培养法克隆 （1）软琼脂的配制：含有）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的（小牛血清）的2倍浓缩的倍浓缩的RPMI1640。1%琼脂水溶液：高压灭菌，琼脂水溶液：高压灭菌，42预热。预热。0.5%琼脂：由琼脂：由1份份1%琼脂加琼脂加1份含份含20%小牛血清的小牛血清的2倍浓缩的倍浓缩的RPMI1640配制而成。置配制而成。置42保温。保温。（2）用上述）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝

39、固后作为基底层备用。的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。（3）按）按100/ml，500/ml或或5000/ml等浓度配制需克隆的细等浓度配制需克隆的细胞悬液。胞悬液。（4）1ml 0.5%琼脂液（琼脂液（42预热）在室温中分别与预热）在室温中分别与1ml不同不同浓度的细胞悬液相混合。浓度的细胞悬液相混合。（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，使其凝固，孵育于孵育于37、5%CO2孵箱中。孵箱中。（6）45天天 后即可见针尖大小白色克隆，后即可见针尖大小白色克隆，710天后，直接移天后，直接移种至含饲养细胞的种至含饲养细胞的

40、24孔中进行培养。孔中进行培养。（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。 5.单克隆抗体的生产单克隆抗体的生产 大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清液中获）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为1060g/ml,如果大量生产，费用较高。如果大量生产，费用较高。（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。实体瘤法：对数

41、生长期的杂交瘤细胞按实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按13107/ml接种接种于小鼠背部皮下，每处注射于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共共24点。待肿瘤达到一定大小点。待肿瘤达到一定大小后（一般后（一般1020天）则可采血，从血清中获得单克隆天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量抗体的含量可达到可达到110mg/ml。但采血量有限。但采血量有限。腹水的制备：常规是先腹腔注射腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷降植烷)或液体石蜡于或液体石蜡于BALB/C鼠，鼠，12周后腹腔注射周后腹腔注射1106个杂交瘤细个杂交瘤细胞，接种细胞胞，接种细胞710天后可产生

42、腹水，密切观察动物的健康状况与腹天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获510ml腹水。也可用注射腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到510mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多

43、。6. 单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法离子交换层析离子交换层析A蛋白蛋白-Sepharose亲和层析亲和层析7、单克隆抗体的鉴定对对制制备备的的McAb进进行行系系统统的的鉴鉴定定是是十十分分必必要要的的，应应做做下下述述几几个个方方面面的的鉴鉴定定：1）抗抗体体特特异异性性的的鉴鉴定定：除除用用免免疫疫原原（抗抗原原）进进行行抗抗体体的的检检测测外外，还还应应该该用用与与其其抗抗原原成成分分相相关关的的其其它它抗抗原原进进行行交交叉叉试试验验，方方法法可可用用ELISA、IFA法法。例例如如：制制备备抗抗黑黑色色素素瘤瘤细细胞胞的的McAb，除除用用黑黑色色素素瘤瘤

44、细细胞胞反反应应外外，还还应应该该用用其其它它脏脏器器的的肿肿瘤瘤细细胞胞和和正正常常细细胞胞进进行行交交叉叉反反应应，以以便便挑挑选选肿肿瘤瘤特特异异性性或或肿肿瘤瘤相相关关抗抗原原的的单单克克隆隆抗抗体体。制制备备抗抗重重组组的的细细胞胞因因子子的的单单克克隆隆抗抗体体，应应首首先先考考虑虑是是否否与与表表达达菌菌株株的的蛋蛋白白有有交交叉叉反反应应，其其次次是是与与其其它它细细胞胞因因子子间间有有无无交交叉叉。2）McAb的的Ig类类与与亚亚类类的的鉴鉴定定：一一般般在在用用酶酶标标或或荧荧光光素素标标记记的的第第二二抗抗体体进进行行筛筛选选时时已已经经基基本本上上确确定定了了抗抗体体的

45、的Ig类类型型。如如果果用用的的是是酶酶标标或或荧荧光光素素标标记记的的兔兔抗抗鼠鼠IgG或或IgM，则则检检测测出出来来的的抗抗体体一一般般是是IgG类类或或IgM类类。至至于于亚亚类类则则需需要要用用标标准准抗抗亚亚类类血血清清系系统统作作双双扩扩或或夹夹心心ELISA来来确确定定。在在作作双双扩扩试试 验验 时时 ， 如如 加加 入入 适适 量量 的的 PEG（ 3%） ， 更更 有有 利利 于于 沉沉 淀淀 线线 的的 形形 成成 。3）McAb中中和和活活性性的的鉴鉴定定：用用动动物物或或细细胞胞的的保保护护实实验验来来确确定定McAb的的生生物物学学活活性性。例例如如，如如果果确确

46、定定抗抗病病毒毒McAb的的中中和和活活性性，则则可可用用抗抗体体和和病病毒毒同同时时接接种种于于易易感感的的动动物物或或敏敏感感的的细细胞胞，来来观观察察动动物物或或细细胞胞是是否否得得到到抗抗体体的的保保护护。4）McAb识识别别抗抗原原表表位位的的鉴鉴定定：用用竞竞争争结结合合试试验验，测测相相加加指指数数的的方方法法，测测定定McAb所所识识别别抗抗原原位位点点，来来确确定定McAb的的识识别别的的表表位位是是否否相相同同。5）McAb亲亲合合力力的的鉴鉴定定：用用ELISA或或RIA竞竞争争结结合合试试验验来来确确定定McAb与相应抗原结合的亲合力。与相应抗原结合的亲合力。8、影响因

47、素、失败原因分析、影响因素、失败原因分析由于制备由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有其主要失败原因和影响因素有:1.污染：包括污染：包括细菌、霉菌和支原体细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最的污染。这是杂交瘤工作中最辣手辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它

48、添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALBc小鼠的腹腔，待长出腹水或小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污

49、染。2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素考虑下列因素PEG有毒性或作用时间过长。有毒性或作用时间过长。牛血清的质量太差，用牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。前没有进行严格的筛选。骨髓瘤细胞污染了支原体。骨髓瘤细胞污染了支原体。HAT有问题，有问题，主要是主要是A含量过高或含量过高或HT含量不足。含量不足。3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中中A(氨甲蝶呤,aminopterin）失

50、效或骨髓瘤细胞发生突变，变成失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出曾提出“三要三要”“三不要三不要”，可能是防，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。止抗体停止分泌的有效措施。三要三要:要大量

51、保持和补充液氮冻存的细胞原管；要应用倒置显微镜经要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管；要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况；要定期进行再克隆。常检查细胞的生长状况；要定期进行再克隆。三不要三不要:不要让细胞不要让细胞“过度生长过度生长”；因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优；因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞；不要让培养物不加检查地任其连续培养势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞；不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月；不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续几周或几个月；不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。传好几代。4.杂交瘤细胞难以克隆化

52、杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加加HT。四四.单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性高度均一性：高度均一性：纯度很高的均一性抗体纯度很高的均一性抗体高度专一性：高度专一性：只对抗原分子上某一抗原决定只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应簇起反应大量产生及稳定性：大量产生及稳定性：杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代之传代五五 .单克隆抗体在医学上的

53、应用单克隆抗体在医学上的应用（一）用作诊断试剂（一）用作诊断试剂 1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。2.鉴定病原体，鉴定病原体，准确准确诊断传染病。诊断传染病。3.用于肿瘤的诊断和分型用于肿瘤的诊断和分型4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内分泌的功能状态断内分泌的功能状态 （二）用作研究工具（二）用作研究工具1.纯化抗原纯化抗原2.分析和探查抗原结构分析和探查抗原结构3.分析抗原决定簇分子的功能分析抗原决定簇分子的功能4.（三）用于疾病的治疗（三）用于疾病的

54、治疗5.抗细胞表面分子单抗用于移植排斥反应抗细胞表面分子单抗用于移植排斥反应的防治的防治6.抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗治疗7.抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题1.单克隆抗体的特异性单克隆抗体的特异性2.由于肿瘤特异性抗原较少，缺由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应正常组织有交叉反应2.异种抗体反应异种抗体反应3.鼠源性单抗用于人体，导致异鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应源性超敏反应第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody)根据研究者的意图，采用基因工程根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括包括嵌合抗体、改型抗体、单链抗体、嵌合抗体、改型抗体、单链抗体、双功能抗体、双特异性抗体和人源化双功能抗体、双特异性抗体和人源化抗体。抗体。