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1、第十章第十章 核酸的核酸的生物学功能生物学功能lDNADNA是是由由四四种种脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸所所组组成成的的长长链链大大分分子子，是遗传信息的携带者。是遗传信息的携带者。l生生物物体体的的遗遗传传信信息息就就贮贮存存在在DNADNA的的四四种种脱脱氧氧核核糖糖核酸的排列顺序中核酸的排列顺序中。 第一节第一节 DNA的生物合成的生物合成 DNA BioSynthesis (Replication)症哩地易朽润笔给踩皮待幽猫雹峦稀怕龚攻书废辽喘拳傻帐酞烬揣铅乞戳第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD本节主要内容本节主要内容DNADNA的复制的复制 半保留复制半保留复制 复制起始点
2、复制起始点 复制的不连续性复制的不连续性 复制相关的酶和蛋白质复制相关的酶和蛋白质 复制过程复制过程DNADNA的损伤与修复的损伤与修复RNARNA指导下的指导下的DNADNA合成（反向转录）合成（反向转录）多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（PCRPCR）迈垄招席源勘挂常念那锄城貌汛函去壁甫块碘锗饺之剖已昆柴拖惜喷守娱第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则(Central dogma)(Central dogma) 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA生生物物的的遗遗
3、传传信信息息以以密密码码的的形形式式储储存存在在DNA分分子子上上，表表现现为为特特定定的的核核苷苷酸酸排排列列顺顺序序。在在细细胞胞分分裂裂的的过过程程中中，通通过过DNA复复制制把把亲亲代代细细胞胞所所含含的的遗遗传传信信息息忠忠实实地地传传递递给给两两个个子子代代细细胞胞。在在子子代代细细胞胞的的生生长长发发育育过过程程中中，这这些些遗遗传传信信息息通通过过转转录录传传递递给给RNA，再再由由RNA通通过过翻翻译译转转变变成成相相应应的的蛋蛋白白质质多多肽肽链链上上的的氨氨基基酸酸排排列列顺顺序序，由由蛋蛋白白质质执执行行各各种种各各样样的的生生物物学学功功能能，使使后后代代表表现现出出
4、与与亲亲代代相相似似的的遗遗传传特特征征。后后来来人人们们又又发发现现，在在宿宿主主细细胞胞中中一一些些RNA病病毒毒能能以以自自己己的的RNA为为模模板板复复制制出出新新的的病病毒毒RNA，还还有有一一些些RNA病病毒毒能能以以其其RNA为为模模板板合合成成DNA，称称为为逆逆转转录录这这是中心法则的补充。是中心法则的补充。汐圈异睫阂要蜂嫌循耍宏摧砰孩酚敝氮潞填猴椅奏瑚逸范无任啊包抹爬骆第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD意意义义：中中心心法法则则总总结结了了生生物物体体内内遗遗传传信信息息的的流流动动规规律律，揭揭示示遗遗传传的的分分子子基基础础，不不仅仅使使人人们们对对细细胞
5、胞的的生生长长、发发育育、遗遗传传、变变异异等等生生命命现现象象有有了了更更深深刻刻的的认认识识，而而且且以以这这方方面面的的理理论论和和技技术术为为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。中心法则主要内容中心法则主要内容:（1）DNA的复制（的复制（DNA指导下的指导下的DNA合成合成)（2）RNA指导下指导下RNA的合成的合成(RNA的复制的复制) （3）DNA指导下指导下RNA的合成（转录）的合成（转录）（4）逆转录作用（）逆转录作用（RNA指导下的指导下的DNA的合成的合成（5）RNA通过翻译转变成相应的蛋白质通过翻
6、译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序多肽链上的氨基酸排列顺序虫贯镶歪歌摘肄蝴懈角痈杏连仙易幻受奠张荒掉早夺圃蜘史好巷糟惯蛹休第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD（一）（一）（一）（一） 、DNADNA的半保留复制的半保留复制 子子代代DNADNA分分子子中中一一条条链链来来自自亲亲代代，另另一一条条链链是是新新合合成成的的，这这种种复复制制方方式式称称为为半半保保留留复复制制(semi-conservative (semi-conservative replication)replication)。 一、一、DNA的复制的复制l 复复制制（replication） 以以DN
7、ADNA为为模模板板, ,在在DNADNA聚聚合合酶酶的的催催化下按碱基互补配对原则化下按碱基互补配对原则, ,聚合成新的聚合成新的DNADNA链的过程。链的过程。 淤结腑挞侮掩盘郝卖扛帕际案职纶咐开判续障镍索哄罗系沁买性惑竖酚女第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDl1 1、 半半 保保 留留 复复 制制 实实 验验 依依 据据： 19581958年年 由由 M. M. Meselson Meselson 和和 F. F. Stahl Stahl 所所完完成成的的实实验验所所证证明明。该该实实验验首首先先将将大大肠肠杆杆菌菌在在含含1515N N的的培培养养基基中中培培养养约约十十
8、五五代代，使使其其DNADNA中中的的碱碱基基氮氮均均转转变变为为1515N N。将将大大肠肠杆杆菌菌移移至至只只含含1414N N的的培培养养基基中中同同步步培培养养一一代代、二二代代、三三代代。分分别别提提取取DNADNA，作作密密度度梯梯度度离离心心，可可得得到到下下列结果：列结果： 茄故澡乓瞩唾赡芳辖痉坝已弧给狐键吭芥芒亭失套档遇四厄督丹抒饿袍糊第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDDNA的半保留复制实验依据 19581958年年Meselson Meselson & stahl& stahl用同位素用同位素示踪标记加密度示踪标记加密度梯度离心技术实梯度离心技术实验验, ,证
9、明了证明了DNADNA是是采取半保留的方采取半保留的方式进行复制式进行复制.15N DNA14N- 15N DNA14N DNA14N- 15N DNA媒蜘盒孝荫蛾吓聚咱宣蚊蛰惩烘疾家肮更珠库梨祥级港若饿南脂揪祖供提第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD2 2、半保留复制的半保留复制的意义意义 复制的这种方式复制的这种方式可保证亲代的遗传可保证亲代的遗传特征完整无误的传特征完整无误的传递给子代，体现了递给子代，体现了遗传的遗传的保守性。保守性。DNADNA的双螺旋结构的双螺旋结构2 2、半保留复制的分子基础、半保留复制的分子基础衙莆谴潘狠逊宝睡呻石逝命磁转郎袜在滋恤贤藩幸涣晤荒乖渭仗
10、邑敬溉鳖第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD（二）、（二）、DNADNA复制开始复制开始 DNA复制开始于一个特定的复制开始于一个特定的位点，称为位点，称为原点原点(origin)。 从原点开始同时向从原点开始同时向DNA链链两个方向进行，形成一个分叉，两个方向进行，形成一个分叉，称为称为复制叉复制叉(replieationfork)。又称又称复制眼复制眼(replication eye)。 环形环形DNA复制时由于复制复制时由于复制眼的形成，构成了一个有内圈眼的形成，构成了一个有内圈的闭合环状体，这种形式称为的闭合环状体，这种形式称为Q结构结构。 大肠杆菌全部基因组大肠杆菌全部基
11、因组( (含含4X106bp)4X106bp)只有只有一个复制原点一个复制原点。高等。高等生物体中生物体中DNADNA具有具有多个复制原点多个复制原点 氰釜彼详评弃鸦咖唇刽惺楔两畴翌氓箱琢阻叶敲硷捅改缉蟹磕董之舒俊真第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD起始点起始点复制叉复制叉1复制叉复制叉2复制叉复制叉1复制叉复制叉2复制起始时复制叉移动复制起始时复制叉移动所形成的复制眼所形成的复制眼环状环状 DNA复制时复制时所形成的所形成的Q结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进园记泊芥俺终泣书劝肖凡咱视啥胖洪昌拳奥惟毙胖脚吁载钎叁慑衡鸵谦杆第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BF
12、D真核细胞真核细胞DNA复制的特点复制的特点 多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点咬汕蜂石崇聂寝鼻跪沦馒制寇传绰拔耐桐恐祝踩扑旅证俄疾畔贴炊罢戎卞第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD由于由于DNADNA聚合酶聚合酶只能以只能以5353方向聚合方向聚合子代子代DNADNA链链，即即模板模板DNADNA链链的方向必须为的方向必须为3535。因此，分别以两。因此，分别以两条亲代条亲代DNADNA链作为模板聚合子链作为模板聚合子代代DNADNA链时的链时的方式就不同方式就不同。（三）、（三）、DNADNA的半不连续复制的半不连续复制l以以3535方方向向
13、的的亲亲代代DNADNA链链作作模模板板的的子子代代链链在在复复制制时时基基本本上上是是连连续续进进行行的的，其其子子代代链链的的聚聚合合方方向向为为5353，这这一一条条链链被被称称为为前前导导链链 .(leading strand)(leading strand)。垫白脂浮遣鸵良攫疑便冒被亚窘培熟夹箍糖搬篙陈莱嫡句撇锻旋啼驼西明第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDl以以5353方向的亲代方向的亲代DNADNA链为模板链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是链的聚合方向也是5353，这条链被，这条链被称为称为随从链随从链(laggi
14、ng strand)(lagging strand)。l在前导链延长在前导链延长1000 2000个核个核苷酸后，另一母链也作为模苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿板指导新链也是沿53合成合成1 000 2 000个核苷酸的小片个核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称为随从链崎片段，这条称为随从链.l随从链为不连续复制，所以随从链为不连续复制，所以DNA为半不连续复制为半不连续复制 .l复制后，这些冈崎片段由复制后，这些冈崎片段由DNA连接酶的作用而连接成连接酶的作用而连接成完整的新链。完整的新链。彪脓倚
15、暇薪班逢耻吭铁雀哉毗堵掖罗粹敷殆户疵葛遗灸虽僻懂请誉膨缴邻第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解链酶解链酶引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB335前导链前导链随后链随后链35复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5RNA引物引物芒枯殷劳咐援驴屉三闹雪畜砒绣笨艘凶钮弘缝楼搐涯皆梅贿苏制费带册刘第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD（四）、（四）、DNADNA的复制相关的酶和蛋白质的复制相关的酶和蛋白质 1 1、DNADNA聚聚合合酶酶 指指指指以以以以DNA
16、DNADNADNA为为为为模模模模板板板板，dNTPdNTPdNTPdNTP为为为为底底底底物物物物催催催催化化化化DNADNADNADNA合合合合成的一类酶。原核和真核细胞中均普遍存在。成的一类酶。原核和真核细胞中均普遍存在。成的一类酶。原核和真核细胞中均普遍存在。成的一类酶。原核和真核细胞中均普遍存在。 （1 1）、种类）、种类l原核生物：三种原核生物：三种lDNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ）；）；lDNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ）；）；lDNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ）；）；l这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶
17、。l参与参与DNADNA复制的主要是复制的主要是pol pol 和和po po 。 1958195819581958年年年年A.KornbergA.KornbergA.KornbergA.Kornberg在大肠杆菌中发现在大肠杆菌中发现在大肠杆菌中发现在大肠杆菌中发现镍根菠邓缆蔑翅逸红侦聪绅烁叁怂栈侗盐壮目谦雾铸裕雪机纵孝悸鬼喇吸第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD（2 2）作用特点：作用特点：作用特点：作用特点： 1.1.1.1.需需需需dNTPdNTPdNTPdNTP，Mg+,DNAMg+,DNAMg+,DNAMg+,DNA模板模板模板模板 2. 2. 2. 2.只能以只能以只
18、能以只能以5 5 5 5 -3-3-3-3 方向延长链方向延长链方向延长链方向延长链，不能发动新，不能发动新，不能发动新，不能发动新链链链链 3. 3. 3. 3.需有一个游离需有一个游离需有一个游离需有一个游离3 3 3 3 -OH-OH-OH-OH的的的的引物引物引物引物轮炼乃笆蛀骸涧胯聘麻豫醇壹臃帝灭埠回估把驳唤抽鸟枷摧靴倘炉径脐焕第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD（3 3 3 3）DNADNADNADNA聚合酶的活性聚合酶的活性聚合酶的活性聚合酶的活性l 55至至33的聚合活性的聚合活性5 35 3方向方向l核酸核酸 外切酶活性外切酶活性5 35 3外切酶活性外切酶活性3
19、 53 5外切酶活性外切酶活性拳窝软吝杀照虏参肿凝蝗狙八澄罢投痔戈巳沏鄂铭函屡曳诊倪静胃陌往骚第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDDNA聚合反应有关的酶类lDNA聚合酶聚合酶(， )l 1. DNA聚合酶聚合酶 :具有多种催化功能具有多种催化功能。 l5-3 聚合酶作用聚合酶作用l3-5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用(校读功能校读功能,保证保证DNA复复制的真实性制的真实性)l5-3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用(切除引物切除引物,并填补切除并填补切除引物留下的裂隙引物留下的裂隙)戚我镀石宫疲潜津狠瞪捌把哗容乌驴豹高锣麓浮似狰疟赚呢趾石晒恭希口第11章DNA合成BFD第11章DNA
20、合成BFD凶迪糟辉护降滁连芜露滚耘柞乒盘僵伪院谚粱口匣哦茫殃焚匀况淑狞叮绊第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDDNADNA聚合酶的聚合酶的3 3 - 5- 5 外切酶水解外切酶水解位点位点3355错配碱基错配碱基3- 5核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点零恰趾嫌半信杖吼搬汝若探矗笆悠侄荷恼扑镭疗绣尹毫总鼎简琳谆扎郝绍第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDlDNA聚合酶聚合酶l5-3 聚合酶作用聚合酶作用l3-5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用l参与DNA的损伤和修复作用lDNA聚合酶l5-3 聚合酶作用聚合酶作用l3-5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用l5-3 核酸外切酶作
21、用核酸外切酶作用l半保留复制的主要酶,合成DNA史姿诌雷拂涪藤泼攀瘦绸鹃力按聊脸颧外乍缚往郡草沥梭帕炬撵拥滨纱淀第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD 原核生物中的三种原核生物中的三种DNADNA聚合酶聚合酶谭迈膊箕贡眼弟溢乱篱讳妨稀签固德塞萍献诌貌惧崎危娱蜜榷琵勃处浅舞第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDDNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配硷基错配硷基复制方向复制方向正正 确核确核苷酸苷酸555555333333切除错配切除错配核苷酸核苷酸萌榨详牡郭蹄坞法希赞娘阿乞胆蛛栈扎燕烟秤煮栗舰蛇旨猎逸休厉闽适菏第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD
22、参与参与DNADNA复制的复制的DNADNA聚合酶，必须以一段具有聚合酶，必须以一段具有33端自由羟端自由羟基（基（3-OH3-OH）的）的RNARNA作为引物作为引物(primer) (primer) ，才能开始聚合子代，才能开始聚合子代DNADNA链。链。DNA聚合酶都需要一个具聚合酶都需要一个具3-OH的引物，才能将合成原料的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的聚合酶不能催化两个游离的dNTP在在DNA模板上进行聚合模板上进行聚合 , RNA引物酶却具有此能力引物酶却具有此能力 .引物的大小引物的大小： 原核生物：原核生物：5
23、050100100个核苷酸；个核苷酸； 真核生物中约为真核生物中约为1010个核苷酸。个核苷酸。 引引物物酶酶本本质质上上是是一一种种依依赖赖DNADNA的的RNARNA聚聚合合酶酶（DDRPDDRP），该该酶酶以以DNADNA为为模模板板，聚聚合合一一段段RNARNA短短链链引引物物(primer)(primer)，以以提提供供自自由由的的3-OH3-OH，使子代，使子代DNADNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。2 2、引物酶、引物酶蜒冬唬步痢妓迭礁斥妈案嗜岂礼淡抑琳状暴臣跋心蹭坐腥舍虐特义粕鹊方第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD3、解螺旋酶、解螺旋酶(rep蛋白蛋白)l解解
24、 螺螺 旋旋 酶酶 (unwinding (unwinding enzymeenzyme） ，又又称称解解链链酶酶或或reprep蛋蛋白白，是是用用于于解解开开DNADNA双双链链的的酶酶蛋蛋白白，每每解解开开一一对对碱碱基基，需需消消耗耗两两分分子子ATPATP。目目前前发发现现至至少少存在两种解螺旋酶。存在两种解螺旋酶。 势胰癸储翻胰仗着俺稼早骑坦簇甘芋佩粒雷忠塑繁浓啼敛圭蜡扶癣厅桃湘第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD4 4、单链结合蛋白、单链结合蛋白 单单链链DNADNA结结合合蛋蛋白白（single single strand strand binding binding
25、 protein, protein, SSBSSB）又又称称螺螺旋旋降降稳稳蛋蛋白白（HDPHDP）。这这是是一一些些能能够够与与单单链链DNADNA结合的蛋白质因子。结合的蛋白质因子。 作作用用： 使使解解开开双双螺螺旋旋后后的的DNADNA单单链链能能够够稳稳定定存存在在， 即稳定单链即稳定单链DNADNA，便于以其为模板复制子代，便于以其为模板复制子代DNADNA； 保护单链保护单链DNADNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。 梨鸦豪勘赎邯森淡洋滞惕魄刷窟勒打勾约邦祟燃雪梁安卷赡记霓飞裙珍为第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD5、拓扑异构酶、拓扑异构酶(topoiso
26、merase)l拓拓扑扑异异构构酶酶可可使使DNA双双链链中中的的一一条条链链切切断断，松松开开双双螺螺旋旋后后再再将将DNA链链连连接接起起来来，从从而而避避免免出现链的缠绕。出现链的缠绕。l拓拓 扑扑 异异 构构 酶酶 可可 切切 断断DNA双双链链，使使DNA的的超超螺螺旋旋松松解解后后,再再将将其其连连接接起来。起来。 作作用用：产产生生负负超超螺螺旋旋和和消除超螺旋。消除超螺旋。大肠杆菌拓朴异构酶大肠杆菌拓朴异构酶的结构的结构糊映柄灼龟曰颇卉牌担翻履叛菲引斜阉哉芬讼奉能滚咎泰量胯努难恃腺乒第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD6 6、DNADNA连接酶连接酶（基因工程重要的
27、工具酶）（基因工程重要的工具酶） 作用：作用：在在DNADNA修修复、重组、剪接复、重组、剪接中缝合缺口中缝合缺口但：但：不连接单独不连接单独存在的存在的DNADNA或或RNARNA单链单链链术雅失悔羹皖毅截地洱嘉绢奋肘运诫胯肌诽恋拭马煌糜嘛妆惺圆拧涪促第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDlDNADNA连连接接酶酶催催化化的的条条件：件：l 需需一一段段DNADNA片片段段具具有有3-OH3-OH，而而另另一一 段段 DNADNA片片 段段 具具 有有5-Pi5-Pi基；基；l 未未封封闭闭的的缺缺口口位位于于双双链链DNADNA中中，即即其其中中有有一一条条链链是是完完整整的；的
28、；l 需需要要消消耗耗能能量量，在在 原原 核核 生生 物物 中中 由由NADNAD+ +供供能能，在在真真核核生生物中由物中由ATPATP供能供能。惕束莲坷类儿进痹陪肚恭掳柞椰虏喝触殊堵蹦惮量瘪袋二孪意据枷瘴汉拥第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD（五）（五） DNA生物合成过程生物合成过程 1、复制的起始、复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。复制的起始阶段，由下列两步构成。（1）预引发：）预引发： 识别起点，识别起点，解旋解链，形成复制叉：解旋解链，形成复制叉：l 参与蛋白及酶：参与蛋白及酶：拓扑异构酶；拓扑异构酶； 解链酶解链酶 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白
29、（SSB）原核生物原核生物原核生物原核生物E.coliE.coli为例为例为例为例（2 2）引发：）引发：l 在在引物酶引物酶的催化下，以的催化下，以DNADNA为模板，合成一段短的为模板，合成一段短的RNARNA片段，从而获得片段，从而获得33端自由羟基（端自由羟基（3-OH3-OH）。）。租联骆立梯衙绅帝朵岁仆惜噪边爷特焊尚赂褒扇孺毡绵郡睛躁绦帜高岁墩第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD复制由起始点复制由起始点复制由起始点复制由起始点 oriC(origin) oriC(origin)开始双向复制开始双向复制开始双向复制开始双向复制E.coliE.coli的复制起始点的复制起始
30、点oriCoriC（245bp245bp的的DNADNA组分）组分）序列分析有如下特点序列分析有如下特点 3 3组重复序列组重复序列(13bp(13bp），每个顺序都由），每个顺序都由GATCGATC开始开始 2 2组反向重复序列组反向重复序列(9bp)(9bp) 4 4个个dnaAdnaA蛋白结合部位蛋白结合部位l当当dnaAdnaA蛋白结合在此时，复制就开始。蛋白结合在此时，复制就开始。 dnaA dnaA使使dnaBdnaB和和dnaCdnaC等蛋白复合物进入等蛋白复合物进入DNADNA的熔解区形成的熔解区形成前引物化复合物前引物化复合物，于是导致模板于是导致模板DNADNA双螺旋解链。
31、同时活化引物酶双螺旋解链。同时活化引物酶崭磁奋饿题淡窑靛荒活限饰怒浓怖或亥嗅搏络铀蕉芍慎雇揪每位栖薛厂遗第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD2 2、复制的延长、复制的延长 连续复制连续复制: :leading strandleading strand不连续复制不连续复制:lagging strandlagging strand冈崎片段（冈崎片段（Okazaki Okazaki fragmentfragment） 不连续复制的不连续片段不连续复制的不连续片段篮翌顾什杂樟际妖嫩炎贮均挥词呵熟塞忻遂岁斜历咳脂像铺购廊曾漆降韵第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD复制叉处前导链和
32、随后链同时合成的工作模型复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶聚合酶III全全酶酶引物引物聚合酶聚合酶III全全酶酶引物引物引物体引物体引物体引物体解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNA聚合酶聚合酶全酶全酶的对称二聚体使的对称二聚体使两条链在全酶上同时同方向合成。两条链在全酶上同时同方向合成。亭楷扎班邮扭拘郑失站鳖闸雾职迫佬款倘纂荡宪吉锗欺积釉蠕琐趁惊嘴此第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD3 3、复制的终止、复制的终止 l包括包括 切除引物：切除引物：由由DNADNA聚合酶聚合酶I I催化催化 填补空隙：填补空隙：由由DNADNA聚合酶聚合酶I I催化催化 连接缺口：连接缺
33、口：由由DNADNA连接酶催化连接酶催化迎屠韧烩咋侮迫岂讫是页抢牌妈骸霖瑚掣塑木乞疟妮椅库得菩舌破系耙柳第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD 新合成的两条新合成的两条染色体染色体DNADNA分子相互分子相互连在一起，被拓扑连在一起，被拓扑异构酶异构酶IVIV分离分离浊项盅箍帜塑阔嗽杆脆狡篮挡瑚职右升遇诡趟爆俏直辜国顺阶迟靶岁咕倦第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解链酶解链酶引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB335前导链前导链随后链随后链35复制的起始DNA链的合
34、成与延长DNA链合成的终止5RNA引物引物粘米居喂垮搬柿己慑鉴状锭倔涌确镍花森咏拍芽鼠柞蝉客玉虾落鄙刮噬拾第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDDNADNA的生物合成的生物合成 - -复制的过程小结复制的过程小结l双链双链DNADNA的复制包括的复制包括 识别起点、解链解旋、识别起点、解链解旋、 合成引物合成引物 延长子链延长子链 切除引物、填补连接切除引物、填补连接 蔽氨仓尊歧哗教微怪吠中湍霖惯脉臣邻栓钨掷腺柴质韶姜孝缀显洼臀浇赁第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD（六）、复制的忠实性 DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆
35、菌计，大肠杆菌DNA复制复制109-1010碱基对仅出现一碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点: DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能（错配碱基被（错配碱基被3-5 外切酶切除）外切酶切除） 起始时以起始时以RNA作为引物作为引物 DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循聚合酶的高度专一性（严格遵循 碱碱基配对原则）基配对原则）聚合时的方向为聚合时的方向为5 5-3-3细胞的各种修复机制。细胞的各种修复机制。 茂吧搁计芜啥续见铸刷箩伐咏凿调稿戊阻鹅餐杉吝镇熄稿迅闪柬蛀坯邑猴第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD真核生物DNA的
36、复制l拓扑异构酶拓扑异构酶lDNA聚合酶聚合酶l复制蛋白复制蛋白A(类似类似SSB)l复制因子复制因子C(控制滞后链上酶的结合与脱控制滞后链上酶的结合与脱离离)l端粒酶：端粒酶：端粒酶端粒酶的发现获得的发现获得诺贝尔生理诺贝尔生理学或医学奖。端粒酶衰老和癌症的潜在学或医学奖。端粒酶衰老和癌症的潜在关系关系 。邯逼莉房邵乙吮聪妓富巩憎完扭态拍铅缘烽懒爪廷出湿捐尚雷躬帆邵辑妊第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD 三、三、DNA的突变的突变 DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生
37、变化，表现出异常的遗传特性，复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为称为DNA的突变。它包括由于的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。分子之间的交换而引起的遗传重组。二、二、诱变剂的作用诱变剂的作用 碱基类似物碱基类似物(base analog) 碱基修饰剂碱基修饰剂(base modifier) 嵌入染料嵌入染料(intercalation dye) 紫外线紫外线(ultraviolet)和电离辐射和电离辐射(ionizing radiation)一
38、、一、突变的类型突变的类型 碱基对的置换碱基对的置换(substitution) 移码突变移码突变(framesshift mutation)逝襟相彭袖挫株舶枪轨雹迅犬益烁烷榷渴碧晤送饮涟燎蛮诫萝臆浓很徐丛第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD DNA突变突变的类型的类型 -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-转换转换 -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入插入A -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失T野
39、生型基因野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution)移码突变移码突变(framesshift mutation)至锋口喘们粗扼惺淌荤扎键剧欲樊棒骄砖走榜殉讥偶眠侯阅哪散贝据坍樟第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD四、DNA的损伤与修复 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理
40、是作用于剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成，造成DNA结构和功能的破坏，称为结构和功能的破坏，称为DNA的损伤的损伤. DNA的修复的修复主要有以下类型主要有以下类型:暗修复暗修复（4）诱导修复诱导修复（SOS修复）修复）（1）光裂合酶修复活光裂合酶修复活（2）切除修复切除修复（3）重组修复重组修复 康革愉垄郎凿使搂憾寺港军它查侥掂胡式草险决蜘流鹃渭课仑撮腋饿梳衰第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD1、光修复：、光修复：光修复酶催化光修复酶催化 胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体紫外光照射可使相邻的两个紫外光照射可使相邻的两个T T 形成二聚体形成二聚体可见光
41、（最有效波长可见光（最有效波长400nm400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种是一种高度专一高度专一的修复形式，只分解由于的修复形式，只分解由于UVUV照射而形成的嘧啶二聚体。照射而形成的嘧啶二聚体。数舒厢狠闰嗣留窿哲铰厂划协将椅拔肚符熙休巡拉巧瘩告赔吱期搜暂蒋犀第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDDNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复页福烫攻锈孽拾排蔽蝇纸末炎还装会阑浩供剁奈液七找钟闰哼墩双冬伏草第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD2
42、、切除修复、切除修复（excission repairing）：一种多酶的催化过程，：一种多酶的催化过程，4 4个步骤个步骤 (1)(1)由由特异内切核酸酶特异内切核酸酶识别识别损伤，损伤，并在损伤前的糖并在损伤前的糖磷酸骨架上切开一磷酸骨架上切开一个裂口。裂口处有个裂口。裂口处有3 3-OH-OH和含有损伤和含有损伤区的区的5 5端。（切）端。（切） (2)(2)DNADNA聚合酶聚合酶以以3 3-OH-OH为引物，以为引物，以另一条完好的互补链为模板进行修复，另一条完好的互补链为模板进行修复，合成一段新片段（补）合成一段新片段（补） (3)(3)损伤区被损伤区被DNADNA聚合酶聚合酶的的
43、5 5-3-3外切酶活性作用切除。外切酶活性作用切除。 （切）（切） (4) (4)新合成的新合成的DNADNA片段和原存在的片段和原存在的DNADNA部分由部分由连接酶连接酶催化相连。催化相连。 （封）（封） （复制前修复）（复制前修复）里媚赢儿疆忍练挪设凰粕伶翠太裕圃蓝忆吨身苦奴层瓷渠萌粟滁黎罕隶本第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD3 3、重组修复、重组修复（recombination repairing） 这种修复中含嘧啶二聚这种修复中含嘧啶二聚体的体的DNADNA片段仍可进行复制，片段仍可进行复制，但子链中在损伤的对应部但子链中在损伤的对应部位出现缺口。复制后通过位出现缺
44、口。复制后通过分子内重组分子内重组或称为或称为姐妹链姐妹链交换交换(sister(sisterstmnd stmnd exchanSe)exchanSe)，从完整的亲代，从完整的亲代链上把相应碱基顺序的片链上把相应碱基顺序的片段移至子代链缺口处，使段移至子代链缺口处，使之成为完整的分子。亲链之成为完整的分子。亲链上的缺口由上的缺口由聚合酶聚合酶I I和和连接连接酶酶填补完整，这就称为填补完整，这就称为重重组修复组修复 。（复制后修复）（复制后修复）痞贝快哀低掺钥似腔坯暖异鄂记惶坷傻毗述查浊淮挪波搀飘莫先贩参觅线第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD3 3SOSSOS修复：修复：l 这
45、这是是一一种种在在DNADNA分分子子受受到到较较大大范范围围损损伤伤并并且且使使复复制制受受到到抑抑制制时时出出现现的的修修复复机机制制，以以SOSSOS借借喻喻细胞处于危急状态。细胞处于危急状态。l DNADNA分分子子受受到到长长片片段段高高密密度度损损伤伤，使使DNADNA复复制制过程在损伤部位受到抑制。过程在损伤部位受到抑制。l损损伤伤诱诱导导一一种种特特异异性性较较低低的的新新的的DNADNA聚聚合合酶酶，以及重组酶等的产生。以及重组酶等的产生。l由由这这些些特特异异性性较较低低的的酶酶继继续续催催化化损损伤伤部部位位DNADNA的的复复制制，复复制制完完成成后后，保保留留许许多多
46、错错误误的的碱碱基，从而造成突变。基，从而造成突变。 缺能浇而美妖是仰劈空咬扮黄嘶鸦互临趴吹锭懦佣兽爱启衰刁苍惰均润巢第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDSOS反应机制反应机制结局不能存活不能存活继续存活继续存活表型不理想表型不理想表型理想表型理想进化动力进化动力抚恐贪坷拂侈萍财悬原巨耽洒刺偿糖氏束葡范吃鼠缝跺撅梳难兄漳蛛谗寒第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD三、三、RNARNA指导下的指导下的DNADNA合成（反向转录）合成（反向转录） 1 1、概念、概念2、逆转录酶、逆转录酶三种功能三种功能依赖依赖DNA指导下的指导下的DNA聚合酶活力聚合酶活力依赖依赖RNA的的
47、DNA聚合酶活力聚合酶活力核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA，这，这与通常转录过程中遗传信息与通常转录过程中遗传信息从从DNADNA到到RNARNA的方向相反，故的方向相反，故称为逆转录作用。称为逆转录作用。堡收嫌差斟钠酿钵孤又篷舆奠节陇跟鸟馋啊宴咋若讣糠患臆衷员二咙甘觉第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶3、病毒逆转录过程病毒逆转录过程4 4、逆转录的生物学意义逆转录的生物学意义扩充了中心法则扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解有
48、助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶逆转录酶是分子生物学重要工具酶羔拽森丫镶表追鸯文掣郡盈拴装排栋谎氏些扯琢禹漫漆暖贬癣伟橡空掂纹第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD 四、多聚酶链式反应四、多聚酶链式反应（PCR） 多多 聚聚 酶酶 链链 式式 反反 应应 （ Polymerases Polymerases chain chain Reaction)Reaction)是是2020世世纪纪8080年年代代末末发发展展起起来来的的一一种种快快速速的的DNADNA特定片段体外合成扩增的方法。特定片段体外合成扩增的方
49、法。PCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNADNA体内复制的体内复制的体内复制的体内复制的DNADNA快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得19931993年诺贝年诺贝年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。尔化学奖。尔化学奖。优点：它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重优点：它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等。复性好、易自动化等。朋盼橇纵或孩定酸慕膳就胶脱厅逃辰俏回篓闯读利午
50、般垛别迸宝殴艇散足第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDPCR技术基本原理 lPCR技术的基本原理技术的基本原理 类似于类似于DNA的的 天然复制过天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。酸引物。lPCR由由变性变性-退火退火-延伸延伸三个基本反应步骤构成：三个基本反应步骤构成：l模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加经加 热至热至93左右左右一定时间后，使模板一定时间后，使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成扩增形成的双链的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下
51、轮反应作准备；结合，为下轮反应作准备；l模板模板DNA与引与引 物的退火物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加经加热变性成单链后，温度降至热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模左右，引物与模板板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；桓骡券佰廉捉屎蔫然埃综惯洋另皿俞个谐锣顿昏苯褥簇颓荒兽避办义滩抵第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDl引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结合引物结合 物物在在TaqDNA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTP为为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模与
52、半保留复制原理，合成一条新的与模板板DNA 链互补的半保留复制链链互补的半保留复制链.重复循环重复循环变性变性-退火退火-延伸三过程，就可获得更多延伸三过程，就可获得更多的的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新链又可，而且这种新链又可成为下次循环的模板。成为下次循环的模板。l每完成一个循环需每完成一个循环需 24分钟，分钟，23小时小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 炮愈炼本酬审埔肃讳答壮饺涛喝论旁驯错命澄咨虐即额赴颗渗晾核蝴众姨第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD PCR技术原理示意图技术原理示意图靶序列靶序列变性和引变性和引物复性物
53、复性循环循环1循环循环2循环循环3变性和引变性和引物复物复性性链延伸链延伸Taq酶酶链延伸链延伸锡扭蒂墟届问请续踊刚仟晓书巧虚远菱铀痉搭式精稻洞膀虹笨蛇吩久澳宰第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDPCR反应五要素：l参加参加PCR反应的物质主要有五种即引物、反应的物质主要有五种即引物、酶、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+l引物：引物： 引物是引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板何一段模板DNA序列，就能按其设计互序列，就能按其设
54、计互补的寡核苷酸链做引物，利用补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可就可将模板将模板DNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。 杭宠戮践慈头洒玻像敞茄闭冶忿猩元忍步汤等绰悍造蔼惋震处租河曰缔滇第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD设计引物应遵循以下原则：l引物长度：引物长度： 15-30bp，常用为，常用为20bp左右。左右。 l引物扩增跨度：引物扩增跨度： 以以200-500bp为宜，特定条件下为宜，特定条件下可扩增长至可扩增长至10kb的片段。的片段。 l引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜，为宜，G+C太少太少扩增效果不佳，扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
55、过多易出现非特异条带。 l避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补。互补。 l引物引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致而导致PCR失败。失败。 l引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。它序列无明显同源性。 能劝溢际瓦值龟丧法渣忙子戮卑琉凰棺突佛哈男词抽猛玉处桶匪丧嗽摊棒第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD聚合酶聚合酶l酶及其浓度酶及其浓度 目前有两种目
56、前有两种Taq DNA聚合酶聚合酶供应，供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U(指总反应体积为指总反应体积为100ul时时)，浓度过，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。成产物量减少。 垦总猜依仰慢衷勉兄褐偷抬炕僧夺幻玫沧项烙伴癸痰末讫彤铀当哮婚啼樊第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDDNADNA聚合酶的问题？聚合酶的问题？ 常温酶不耐热常温酶不耐热 耐热耐热DNA
57、DNA聚合酶的分离：聚合酶的分离： 19881988年年Cetus Cetus 公公司司从从美美国国黄黄石石国国家家公公园园的的温温泉泉中中分分离离到到一一株株耐耐热热的的水水生生细细菌菌YT-1YT-1（Thermus Thermus aquaticus aquaticus strain strain YT-1YT-1），其其DNADNA聚聚合合酶酶耐耐热热，命名为命名为Taq Taq 酶。酶。壤帝讥社暑虑揉晾绕界驼职忆嚎蛊甭现熊柞淀愚靖坷蝇沙倒巩哎君钨暇暮第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDdNTP的质量与浓度ldNTPdNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCRPCR扩增效率有
58、密切关扩增效率有密切关系，系，dNTPdNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。失去生物学活性。dNTPdNTP溶液呈酸性，使用溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量分装，时应配成高浓度，小量分装， -20 -20冰冻冰冻保存。多次冻融会使保存。多次冻融会使dNTPdNTP降解。在降解。在PCRPCR反应反应中，中，dNTPdNTP应为应为5050200 umol/L200 umol/L，浓度过低，浓度过低又会降低又会降低PCRPCR产物的产量。产物的产量。dNTPdNTP能与能与Mg2+结结合，使游离的合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度降低。 权缅悯政垫泣
59、罪景险票之盲掺像呸鸭迁杠烷青叉爱颖拂骗桩怠肺撬授川孪第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD模板(靶基因)核酸l模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键成败与否的关键环节之一，传统的环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用纯化方法通常采用SDS和蛋和蛋白酶白酶K来消化处理标本。来消化处理标本。l SDS的主要功能是：的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能
60、能水解消化蛋白质，特别是与水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模核酸。提取的核酸即可作为模板用于板用于PCR反应。反应。曰旷叔痢瞩炊德鄂笋磺枢地藻焙待讫恍官匣吼塔犯愈椒昏怨膝讯惦佐睡誉第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDMg2+浓度lMg2+对对PCR扩增的特异性和产量有显著扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的的影响，在一般的PCR反应中，各种反应中，各种dNTP浓度为浓度为200umol/L时，时，
61、 Mg2+浓度为浓度为1.52.0mmol/L为宜。为宜。 Mg2+浓度过高，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，聚合酶的活性，使反应产物减少。使反应产物减少。 江哲凑辞壬剔聂所侩桌布贩省漫痪队床早般存氏拭奖谈偿捧酚榨浙肢倡祷第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDPCR反应条件的选择lPCR反应条件为反应条件为温度、时间和循环次数温度、时间和循环次数。 l温度与时间的设置：温度与时间的设置： 基于基于PCR原理三步原理三步骤而设置变性骤而设置变性-退火退火-延伸三个温度点。延伸三个温度点。l
62、在标准反应中采用三温度点法，双链在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在在9095变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至然后快速升温至7075，在，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。槐瓶柞蔗史酥深晕坏佣喂局候薪汀试灸朝绕函打根崖垃型羊铬蘑玄搏弟者第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDl变性温度与时间：变性温度与时间：l变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的失败的最主要原因。一般情况下，最主要原因。一般情况下，9394lmin
63、足以使模板足以使模板DNA变性，若低于变性，若低于93则则 需延长需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致产物完全变性，就会导致PCR失败。失败。 钱饭丸殷宙傣鼻条锣暮逢酵舀杰蒋拔赵锯懂郡鳃酝腺智喊侍颠渺绣哭练澎第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDl退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：l退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060，可使引，可使引物和模板
64、发生结合。由于模板物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。远高于模板互补链之间的碰撞。l退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于度。对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引物，的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。为选择最适退火温度的起点较为理想。 蛙滋玻途惶实因斯戴颈迷焦苍由捂饶垃彤任椒懒粪赘争杯菩衣槐讳列到圃第11章DNA合成BFD第11章DNA合成
65、BFDl延伸温度与时间延伸温度与时间：lPCR反应的延伸温度一般选择在反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为之间，常用温度为72，过高的延伸温度，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般一般1Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min是足够是足够 的。的。34kb的靶序列需的靶序列需34min；扩增扩增10Kb需延伸至需延伸至15min。延伸进间过长。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸
66、时间要稍长些。模板的扩增，延伸时间要稍长些。 鸭墟丛邵片委距弘鳃口帆磨兄阴拆传宪雁鲁形鸣甄犬馅萝猿赠炬翔赵随棋第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDl循环次数循环次数 l循环次数决定循环次数决定PCR扩增程度。扩增程度。PCR循环次数循环次数主要取决于模板主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次的浓度。一般的循环次数选在数选在3040次之间，循环次数越多，非特次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。异性产物的量亦随之增多。 拜炬艺角钓捶剁锣瞎寥睁葛憨遭汉戌看旺桅析枷猖鞋匹几紊籍汐烈描绍雕第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDPCR扩增产物分析lPCR产物是否为特异
67、性扩增产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 l凝胶电泳分析凝胶电泳分析：PCR产物电泳，产物电泳，EB溴乙锭染色溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预，应用多对引物，其产物片断
68、都应符合预计的大小，这是起码条件。计的大小，这是起码条件。 疵尹跋凿囊词汛碍尿浚媚炼累母渠亨敬铀嘿办渐贞绷悍牧归公惧攒破综敌第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFDl琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳： 通常应用通常应用12%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，供检测用。供检测用。 l聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。科研及检测分析。 l酶切分析酶切分析：根据：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合
69、理论的片用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。型，还能进行变异性研究。 l分子杂交分子杂交：分子杂交是检测：分子杂交是检测PCR产物特异性的有产物特异性的有力证据，也是检测力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。产物碱基突变的有效方法。 lSouthern印迹杂交印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡在两引物之间另合成一条寡核苷酸链核苷酸链(内部寡核苷酸内部寡核苷酸)标记后做探针标记后做探针菏齿贾银沿仕逻阀竞投涡凉寻跑臂锈匀刨痕赠戮赞瘤还廖变增午钻携狈佣第11章DNA合成BFD
70、第11章DNA合成BFDPCR的特点的特点l1、对对DNA模模板板要要求求不不高高，纯纯度度也也不不严严，用用量量很低；很低；l2、引引物物设设计计十十分分重重要要，它它决决定定了了PCR扩扩增增片片段的大小及特异性，段的大小及特异性，l3、 碱基配对原则；碱基配对原则；l4、需需要要一一个个耐耐热热的的DNA聚聚合合酶酶。 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。聚合酶合成反应的忠实性。lPCR技技术术已已成成为为 分分子子生生物物学学、医医学学、生生物物工工程、法医学及考古学等领域不可缺少的工具。程、法医学及考古学等领域不可缺少的工具。恼愚习捕漠赏哈嘛扩急坟作蒸停邱畔啼枯梨庐观错运瞻咆片挡眺器条愧兽第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD PCR的步骤的步骤90-95 变性变性5min，然后，然后9530sec、55-6530sec、7230sec，共，共30-45个循环，最后个循环，最后72再延伸再延伸5min。销肋烯甘干浮裁宁宁小枚捍炼贝剑漂哭冯剂鸳觅哨钉装玩栖伏涸说刚病潮第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD佑棒悦戚睹雍瓦蚜桥龙茂帆钡喉溢谢筷岗技驾价沁聊杂蹋乌蛀虫锦厌寸锨第11章DNA合成BFD第11章DNA合成BFD
