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1、实验六实验六 观察血清中谷丙转氨酶的活力变化观察血清中谷丙转氨酶的活力变化Experiment 6 Observing Enzyme Activity Changes of Alanine Aminotransferase in Sample一、目的要求一、目的要求1、了解血清谷丙转氨酶活力变化的意义、了解血清谷丙转氨酶活力变化的意义2、掌握血清谷丙转氨酶活力的测定方法、掌握血清谷丙转氨酶活力的测定方法二、相关知识点二、相关知识点1. 转氨作用转氨作用 transamination2. 氨基转移酶氨基转移酶 转氨酶（转氨酶（aminotransferase，transaminase） 催化氨基
2、酸与酮酸之间氨基转移的一类酶催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶 谷丙转氨酶谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT谷草转氨酶谷草转氨酶 glutamic oxaloacetic transaminase GOT又称天冬氨酸转氨酶又称天冬氨酸转氨酶 aspartate transaminase, AST3.转氨作用的机制：转氨作用的机制：4转氨作用的意义转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低力很低GOT以以心
3、脏细胞心脏细胞中活力最大，其次为中活力最大，其次为肝脏细胞肝脏细胞GPT则以则以肝脏细胞肝脏细胞中活力最大中活力最大正常组织正常组织异常组织异常组织心脏心脏 肝脏肝脏心脏心脏 肝脏肝脏细胞细胞中酶活力中酶活力GOT高高 GOT/GPT高高细胞破损酶溢出细胞破损酶溢出血清血清中酶活力中酶活力GOT低低 GOT/GPT低低GOT升高升高 GOT/GPT 升高升高 5.谷丙转氨酶的临床意义谷丙转氨酶的临床意义如果如果GPT血清值超过正常上限血清值超过正常上限23倍，并持续两倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。ALT的正常上限是的正常上限是40单位，单位，2
4、.5倍为倍为100单位，单位，20倍为倍为800单位。单位。三、实验原理三、实验原理SUBSTRATEPyruvate dinitrate phenylhydrazone2,4-dinitrate phenylhydrazinealanine-ketoglutarateRed brownpyruvic acidpyrivic acid glutamic acidSALT单位的定义是：单位的定义是：1ml 血清在血清在37与底物作用与底物作用30min，每产生，每产生2.5g丙酮酸所需酶的量为一个丙酮酸所需酶的量为一个SALT单位。单位。四、实验操作四、实验操作1.标准曲线的绘制标准曲线的绘制试
5、剂 管号管号012345丙丙酮酸酸标准液，准液，mlSALT底物溶液底物溶液，ml磷酸磷酸缓冲液，冲液，ml0.000.500.100.050.450.100.100.400.100.150.350.100.200.300.100.250.250.1037水浴中保温水浴中保温10min2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼 0.500.500.500.500.500.5037水浴保温水浴保温20min 氢氧化钠氢氧化钠ml555555室温下静置室温下静置10min 10min 蒸馏水调零点，于蒸馏水调零点，于520nm520nm处测吸光度处测吸光度 1.为什么在制作标准曲线时要加入底物溶液为什么在制作标
6、准曲线时要加入底物溶液2.为什么加入底物溶液的体积不同，对反应没有影响为什么加入底物溶液的体积不同，对反应没有影响3.怎么计算丙酮酸的质量怎么计算丙酮酸的质量丙酮酸微克数丙酮酸微克数- -吸光度标准曲线吸光度标准曲线2 SALT活力测定：洁净干燥试管活力测定：洁净干燥试管4支，即支，即测定管、对照管各测定管、对照管各2支支 试剂测定管定管对照管照管血清，血清， mlSALT底物溶液，底物溶液， ml0.10.50.1_37水浴水浴30min2,4-二硝基苯二硝基苯肼溶液，溶液， mlSALT底物溶液，底物溶液， ml0.5_0.50.537水浴水浴20min0.4mol/L氢氧化氧化钠溶液，溶
7、液， ml5.05.0室温下静置室温下静置10min 1.4根干燥试管的用途是什么？根干燥试管的用途是什么？2.样品测定为什么要使用对照管？样品测定为什么要使用对照管？3.样品测定的酶反应怎样终止？样品测定的酶反应怎样终止？4.血清样品和底物在使用前最好提前放置于水浴中预热，血清样品和底物在使用前最好提前放置于水浴中预热，保证反应时的温度的准确性保证反应时的温度的准确性5.反应温度和计时要准确反应温度和计时要准确SALT活力活力=测定管微克数测定管微克数对照管微克数对照管微克数 2.50.1 （单位）（单位） 五、注意事项五、注意事项1. 2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙二硝基
8、苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙2. 吸量应准确，严格控制反应时间和温度。吸量应准确，严格控制反应时间和温度。3. 在测定在测定SALT活力时，应事先将底物、血清在活力时，应事先将底物、血清在37水浴中恒温水浴中恒温4. 溶血标本不宜采用，因血细胞内转氨酶活力较高，影响测定溶血标本不宜采用，因血细胞内转氨酶活力较高，影响测定结果。结果。5在测定时，如酶活力较大（大于在测定时，如酶活力较大（大于100单位），应将样品稀释单位），应将样品稀释后再进行测定。后再进行测定。六、专业词汇六、专业词汇 glutamic-pyruvic transminase GPT alanine aminotrans
9、ferase ALTglutamic oxaloacetic transaminase GOT aspartate transaminase, ASTenzyme activityserumAminotransferase/ transaminasecatalyzealanine-ketoglutarateglutamic acidpyruvic acidalkalisubstrateABSTRACT Observing Enzyme Activity Changes of Alanine Aminotransferase in Sample Abstract: Objetcive: To d
10、etermine the activity of serum ALT in sample. Method: SALT was measured by Reitman-Frankel colorimetric end point method Results: The normal SALT activity is ( ) unit, the abnormal SALT activity is ( ) unit. Conclusion: The activity of SALT in abnormal sample is much higher than that in normal sampl
11、e Key Words: alanine aminotransferase， aspartate transaminase, enzyme activity, serum, -ketoglutarate, substrate,（1）draw calibration curvetubesAdd standard pyrivic acid solution, SALT substrate solution and phosphate bufferWater bathing at 37 for 10Add 2,4-dinitrate phenylhydrazine and water bath at
12、 37 for 20Add NaOH solution and keep in room temperature for 10Assay at 520nm（2）determining the activity of SALTNormal tubesAbnormal tubesseraSALT substrate solutionsera_Water bathing at 37 for 30Water bathing at 37 for 302,4-dinitrate phenylhydrazine2,4-dinitrate phenylhydrazine_SALT substrate solutionWater bathing at 37 for 20Water bathing at 37 for 20Add NaOH solution and keep in room temperature for 10Add NaOH solution and keep in room temperature for 10Assay at 520nmAssay at 520nm
