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1、地贫筛查的检测技术地贫筛查的检测技术 解放军解放军解放军解放军第三第三第三第三0 0三医院血液科三医院血液科三医院血液科三医院血液科张新华张新华背景信息背景信息地中海贫血是广西新生儿出生地中海贫血是广西新生儿出生缺陷的首位重要遗传病！缺陷的首位重要遗传病！地中海贫血是广西婚前检查医地中海贫血是广西婚前检查医务人员首位要关注的疾病！务人员首位要关注的疾病！背景信息背景信息 健康夫妇生下的胎儿中唐氏健康夫妇生下的胎儿中唐氏综合症的出生率约为综合症的出生率约为1/7501/750，而，而重重型和中间型地贫（包括型和中间型地贫（包括和和 地地贫）胎儿的出生率超过贫）胎儿的出生率超过1010 ，相，相差
2、十多倍。但实际上地贫的受重差十多倍。但实际上地贫的受重视的程度远不如唐氏综合症。视的程度远不如唐氏综合症。背景信息背景信息广西地贫基因携带率高达广西地贫基因携带率高达25%25%以上。以上。新生儿缺陷率高，死亡率高，约有新生儿缺陷率高，死亡率高，约有1/21/2是地贫。是地贫。重视不够，措施不得力。重视不够，措施不得力。从事地贫防治人员少，投入少。从事地贫防治人员少，投入少。开展基因诊断的医院也少，开展地贫产前诊断的开展基因诊断的医院也少，开展地贫产前诊断的 医院更少。医院更少。各级医院地贫相关设备落后。各级医院地贫相关设备落后。地贫防治工作特别。地贫防治工作特别。市民地贫知识匮乏。市民地贫知
3、识匮乏。 认识地中海贫血认识地中海贫血地贫的病理基础地贫的病理基础 地贫：地贫：珠蛋白基因缺失或缺陷使珠蛋白基因缺失或缺陷使珠珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制，造成蛋白链的合成受到部分或完全抑制，造成链链的合成减少，过剩的的合成减少，过剩的链聚合成四聚体，在红链聚合成四聚体，在红细胞内沉积，使红细胞变形性降低，不易通过细胞内沉积，使红细胞变形性降低，不易通过微循环及脾窦与脾索间的基膜而造成红细胞的微循环及脾窦与脾索间的基膜而造成红细胞的过度破坏。过度破坏。 地贫：地贫：珠蛋白基因突变导致珠蛋白基因突变导致珠蛋白链珠蛋白链合成受到部分或完全抑制，过剩的合成受到部分或完全抑制，过剩的链聚合成链聚合
4、成不稳定的四聚体，在红细胞内沉积，造成无效不稳定的四聚体，在红细胞内沉积，造成无效造血和红细胞的过度破坏。造血和红细胞的过度破坏。1.1.地中海贫血分类：主要有地中海贫血分类：主要有地地 贫和贫和地贫两大类。地贫两大类。2.2.地中海贫血的分级：均分为重地中海贫血的分级：均分为重 型、中间型、轻型和静止型基型、中间型、轻型和静止型基 因携带者四级。因携带者四级。 地贫：以缺失地贫：以缺失基因数基因数 或突变或突变 基因数分等级基因数分等级 重型重型地贫：又叫地贫：又叫HbBartsHbBarts水肿综合征，水肿综合征，4 4个个基因都缺失了基因都缺失了(-(-SEASEA /- /-SEASE
5、A) ) ，在孕，在孕后期或出生后即死亡。后期或出生后即死亡。中间型中间型地贫：缺失地贫：缺失3 3个个基因基因( ( -/ /-SEA) )或缺或缺2 2个个基因另有一个基因另有一个基基因突变因突变( ( T T/ /-SEA) ) ，又叫又叫HbHHbH病，电泳大多可病，电泳大多可见见HbHHbH区带。区带。HbHb大多在大多在 T T60-100g/L60-100g/L左右。左右。轻型轻型地贫：缺失地贫：缺失2 2个个基因基因( /( /-SEA) )(-/ / -)或或2 2个个基基因突变因突变( ( T T / / T T ) ) T T T或缺或缺1 1个个基因另有一个基因另有一个
6、基因突变基因突变(-/ / -) ，又叫又叫地贫地贫1 1。轻度贫血。轻度贫血或不贫血。或不贫血。 静止型静止型地贫：缺失地贫：缺失1 1个个基因基因( (/-) 或或1 1个个基因突变基因突变( (/T T ) ) 又叫又叫地贫地贫2 2，不会贫血。，不会贫血。 T T地贫：以临床贫血程度分级地贫：以临床贫血程度分级重型重型地贫：地贫：HbHb在在60g/L60g/L以下。纯合子地贫或以下。纯合子地贫或 双重杂合子地贫。双重杂合子地贫。中间型中间型地贫：地贫：Hb60-100g/LHb60-100g/L之间。双重杂合之间。双重杂合 子或杂合子地贫。子或杂合子地贫。轻型轻型地贫：贫血但在地贫：
7、贫血但在100g/L100g/L以上，杂合子以上，杂合子 地贫。地贫。静止型静止型地贫：不贫血，杂合子地贫。地贫：不贫血，杂合子地贫。 地中海贫血的检测技术地中海贫血的检测技术必须掌握的几项地贫相关指标必须掌握的几项地贫相关指标平均红细胞体积平均红细胞体积 79fl79fl血红蛋白电泳血红蛋白电泳 未见异常区带未见异常区带血红蛋白血红蛋白A2 3.5%A2 3.5%或或4%4%地贫基因地贫基因 未检出未检出地贫基因地贫基因 未检出未检出地贫相关的临床检测技术地贫相关的临床检测技术1.1.红细胞脆性试验红细胞脆性试验2.2.血细胞分析血细胞分析3.3.血红蛋白分析血红蛋白分析4.4.地贫基因检测
8、地贫基因检测 第1-31-3项为筛查项目项为筛查项目1.1.红细胞脆性试验红细胞脆性试验 红细胞脆性试验在基层单位可红细胞脆性试验在基层单位可用，但在有血细胞分析仪的单位就用，但在有血细胞分析仪的单位就不应该单用于地贫筛查，不应该单用于地贫筛查，此项检测此项检测误漏诊率高，误漏诊率高，且英美地贫筛查指南且英美地贫筛查指南中均没有此项目。中均没有此项目。2.2.血细胞分析血细胞分析 平均红细胞体积平均红细胞体积（MCVMCV）79fl4%4%。HbFHbF量量: :中间型和重型中间型和重型地明显增高。地明显增高。异常波型：各种异常血红蛋。异常波型：各种异常血红蛋。HPLCHPLC不能做不能做Hb
9、HHbH和和HbBartsHbBarts定量，不能以脐血诊断定量，不能以脐血诊断地贫。地贫。（所有的（所有的地贫和中间型地贫和中间型地贫（血红蛋白地贫（血红蛋白H H病）可病）可明确诊断，静止型明确诊断，静止型基因携带者、轻型基因携带者、轻型地贫不能地贫不能诊断）诊断）3.1高效液相色谱法高效液相色谱法3.23.2血红蛋白电泳法血红蛋白电泳法 电泳法是比较普及的方法，我国内地电泳法是比较普及的方法，我国内地绝大数单位用电泳法诊断地贫，优于绝大数单位用电泳法诊断地贫，优于HPLCHPLC的是可用于做新生儿脐血的是可用于做新生儿脐血HbBartsHbBarts定量，定量，诊断诊断地贫，地贫，HbB
10、artsHbBarts达达1%-2%为为 静止静止型型地地贫基因携带者贫基因携带者 ，HbBartsHbBarts达达5%-15% 为轻型为轻型地贫地贫 ，HbBartsHbBarts达达25%为为HbH病病 。 电泳法电泳法多种方法优缺点的比较多种方法优缺点的比较1.1.检验结果的准确性检验结果的准确性2.2.检验操作技术的难度检验操作技术的难度3.3.设备的投入与产出比设备的投入与产出比4.4.设备的实用性设备的实用性四种血红蛋白分析设备对比 按上述ROC确定的诊断地贫杂合子HbA2截断值判断238样本中173例健康成人误诊例数和65例地贫杂合子漏诊例数分别为HPLC为0和1例，Sebia
11、为各1例，Sang Te为2和4例，醋酸纤维膜法为32和4例。1.1.正常新生儿正常新生儿 9.9.轻型轻型地中海贫血地中海贫血2.2.胎儿水肿综合征胎儿水肿综合征 10.10.异常异常HbDHbD杂合子杂合子3.3.地中海贫血地中海贫血1(1(脐血脐血) ) 11.11.异常异常HbGHbG杂合子杂合子4.HbCS-HbH4.HbCS-HbH病型病型 12.12.轻型轻型地中海贫血复合地中海贫血复合HbEHbE5.5.重型重型地中海贫血复合地中海贫血复合HbEHbE 13. 13.正常成人正常成人 6.6.轻型轻型地中海贫血地中海贫血 14.14.正常成人正常成人 7.7.异常异常HbKHb
12、K杂合子杂合子 15.HbH 15.HbH病病8.8.异常异常HbJHbJ杂合子杂合子 4.4.基因分析基因分析 静止型静止型基因携带者只有基因分基因携带者只有基因分析才能诊断（析才能诊断（ 缺失型的缺失型的 / - / -4.24.2 ,/-,/-3.73.7 , ,非缺失型的非缺失型的HbCsHbCs、HbQsHbQs、HbWsHbWs）基因分析的注意事项基因分析的注意事项 基因分析的全过程都很重要，其中的一步出错都会导致结果的错误。可从下述几方面注意：1.血标本的采集、运送和储存全过程不出问题。2.血样处理、DNA/RNA制备、扩增、电泳/杂交不出 问题。3.结果判断要联系血常规和电泳结
13、果。还要注意医生开单的项目的准确性。 地贫筛查后哪些情况地贫筛查后哪些情况需做地贫基因检测！需做地贫基因检测！1.Hb正常或轻度下降，MCV下降，但 电泳没有阳性发现的（HbA2检测 误差，轻型或静止型地贫 ）， 要做地贫基因检测。2.夫妇双方一方确定为（ ）地贫 ，另一方做地贫基因。地贫的基因分析地贫的基因分析 只能检测三种常见的缺失型和五种非缺失型地贫基因。 只能检测17种国内常见的地贫基因。临床上特别要注意这样的检验结果 实验室检测的质量控制实验室检测的质量控制实验室检测出错的来源操作人员的因素 主要是责任心的问题技术因素 即所采用的技术、试剂（试剂盒）的准确性、稳定性如何。样品因素 样
14、品方面的原因比较复杂，归根到底就是样品有没有错。问题可能发生在以下几个方面的原因1实验室的污染2 样品错位 这可能有三个方面的原因 样品标识错误。 样品处理过程中标记或放置错误。 实验过程中，稀释样品/加样时取错或加错试管或微孔。实验室检测出错的防范实验室检测出错的防范一一. .对技术人员的要求：要有高度责任心和对技术人员的要求：要有高度责任心和 高风险意识高风险意识上岗前培训和考核：即须经过严格的培训和考核之后方可从事地贫筛查和产前诊断工作。严格遵守各项规章制度：严格遵守操作规程，既不要创新，也不要取巧。对于产前诊断的项目，必须由两个人独立平行检测同一份样品，且最好用不同的方法，当两人所做的
15、结果完全吻合时，方可发出产前诊断报告。二.对技术或方法的要求1科学性 即有文献根据的。2可靠性 即实验室反复操作后证明准确性、灵敏性和稳定性都好。对于自己实验室创建的方法，也应该在发表文章得到公认后方可用于临床，并且在应用于临床以前得到本单位的伦理委员会审查，获得批准后方可应用。3方法或技术的互相验证 通过应用两套不同的检测方法或技术进行产前诊断以控制偶然误差应该作为常规。由于实验的环节很多，每个环节上的疏漏或者不可预测的差异，都会出现结果和事实不符的事件发生，同时由于个体差异，也不可避免出现某种不匹配的情况。三三. .对于样品因素要求对于样品因素要求 1严格样品核收程序 2养成良好的实验习惯
16、 接收样品时立即在原始样品管上编上实验室样品流水号，留存部分样品在原始管中妥善保存，以便日后核对，亦可作为将来样品原始差错的证据。 样品处理过程中，尽量减少转移的次数，这样样品发生差错的可能性较小。样品处理后，一分为二，一管作为储存管，低温保存，轻易不要使用；另一管作为工作管，进行后续实验用。 标记要清晰，步步要核对。 在加样过程中，采用移位法。四四. .实验室实行全面质量管理，平时做好实验室实行全面质量管理，平时做好 室内质控和室间比对。室内质控和室间比对。小小 结结1.广西地贫基因携带率很高（25%），地贫是广西危害最大发病率最高的遗传病，是优生工作中的重中之重。2.平均红细胞体积下降（MCV低于79fl）即地贫表型阳性，地贫机率很大。电泳或基因检测可诊断。3.轻型和静止型a地贫要基因分析才能确诊。4.双方均携带同类型地贫基因需做产前诊断。5.严把质量关，确保检测结果准确。 谢谢！地贫防治网站：地贫防治网站：联系电话：联系电话：28702952870295（地贫检验）（地贫检验） 28701352870135（地贫输血）（地贫输血） 28706402870640（遗传咨询）（遗传咨询）28706402870640（药物邮购（药物邮购）
