植物细胞大规模培养

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1、第十一章 植物细胞大规模培养 植物次生代谢产物：植物次生代谢产物：植物中一大类并植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。谢。（一）、概述（一）、概述 植物产生代谢产物的类型植物产生代谢产物的类型 根据分子结构不同大致分为：根据分子结构不同大致分为： 酚类化合物：酚类化合物：黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜类化合物

2、：萜类化合物：三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物：含氮化合物：生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺）生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺） 非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸 生氰甙生氰甙 多炔类、有机酸多炔类、有机酸 植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。等领域具有重要意义。 李时珍在本草纲目中所开列的李时珍在本草纲目中所开列的18921892种药种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约物绝大多数是植物药物，目前仍有约2525的法定的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。药品来自植物。其药物的有效

3、成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害是理想以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害是理想的环保产品。的环保产品。 自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产方式 生产周期生产周期 紫草宁含量（干重）紫草宁含量（干重）完整植物完整植物 23年年 12植物细胞培养植物细胞培养 3周周 14植物次生代谢产品的市场潜能植物次生代谢产品的市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）产品成分用途

4、年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病长春花碱治疗白血病1820（美国）（美国）奎宁治疗疟疾奎宁治疗疟疾510（美国）（美国）致热素杀虫剂致热素杀虫剂20（全世界）（全世界）毛地黄心脏病药毛地黄心脏病药2055（美国）（美国） 植物细胞大规模培养的技术要求：植物细胞大规模培养的技术要求： 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。的控制和调节系统。 从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件：

5、个条件： 1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。恒定的产物。 2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。内能得到较高产量的终产物。 3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。好能将其释放到培养基中。（二）、植物细胞规模化培养体系的建立（二）、植物细胞规模化培养体系的建立 1、种子细胞的选择、种子细胞的选择 （1）准确选择能产生目的化合物的植物种类；）准确选择能产生目的化合物的植物种类； （2）尽量选

6、择自然状态下产生天然产物的组织器官）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官 为外植体；为外植体； (3)(3)高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将 单细胞扩增形成的愈伤组织分单细胞扩增形成的愈伤组织分2份，份，1份成分含份成分含 量分析，另量分析，另1份保留培养。份保留培养。2、种子细胞系的增殖与放大培养、种子细胞系的增殖与放大培养 种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。值

7、后，应转移至体积较小的生物反应器培养。3、大规模培养体系的建立、大规模培养体系的建立 （1 1）成批培养：）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。 （2 2）连续培养：）连续培养：在培养过程中，不断向反应器在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。中取出培养基的方式。 (3)(3)半连续培养：半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬

8、液，只保留小部分细胞从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。养基进行培养的方式。(三三)生物反应器类型及特点生物反应器类型及特点 大规模培养系统基本原理方法与上述大规模培养系统基本原理方法与上述实验室悬浮培养一致，但大规模培养所采实验室悬浮培养一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。要复杂的多。 植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模力弱、易

9、团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，所以，植物细培养的目的是生产天然产物，所以，植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。 总体上，适合植物细胞培养的反应器应具总体上，适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。切力。机械搅拌式培养系统机械搅拌式培养系统机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其罐的基础上改进设计的，根

10、据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般为便于取样观察，一般还设计有取样口。还设计有取样口。 生物反应器生物反应器

11、气压式培养系统气压式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。 旋转式培养系统旋转式培养系统一般用于产品中试或某些必需裂解细一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。 1、利用细胞培养生产有用物质的

12、一般程序、利用细胞培养生产有用物质的一般程序 （1）选材）选材应注意以下条件：应注意以下条件： 药效肯定；药效肯定； 对其有效成分有充分的了解；对其有效成分有充分的了解； 有测定有效成分和药理的可靠方法；有测定有效成分和药理的可靠方法； 市场短缺或价格昂贵；市场短缺或价格昂贵； 取有药效成分的部位，且该部位较取有药效成分的部位，且该部位较 易形成愈伤组织。易形成愈伤组织。（四）利用细胞培养生产有用物质（四）利用细胞培养生产有用物质（2）细胞株系建立）细胞株系建立 将诱导产生的愈伤组织进行分离，建立悬将诱导产生的愈伤组织进行分离，建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）。浮细胞繁殖体系（液体培养）。 在

13、工厂化生产中，为了提高有用物质产品的在工厂化生产中，为了提高有用物质产品的产量和质量，对细胞培养的选择有两个基本要求：产量和质量，对细胞培养的选择有两个基本要求： 有用物质的合成积累能力强有用物质的合成积累能力强 生长速度快生长速度快 （3）大量培养）大量培养 将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产作为细胞工厂化培养的生产“种子种子”，进行，进行大量培养。大量培养。 （4）产品提取与纯化）产品提取与纯化 从从植植物物细细胞胞培培养养物物中中提提取取和和纯纯化化有的产品。有的产品。2、提高有用物质生产效率的技术因素提高有用物质生产效率的技术因素筛

14、选高产细胞系筛选高产细胞系 从实验材料中筛选高产的细胞株系是提高从实验材料中筛选高产的细胞株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。特异的次生生产率、降低生产成本的重要因素。特异的次生代谢产物往往是特异的器官中形成的。因此，用代谢产物往往是特异的器官中形成的。因此，用特异器官为材料，建立特异功能的细胞系，并从特异器官为材料，建立特异功能的细胞系，并从中反复多代培养选择有效的、高产的细胞株。中反复多代培养选择有效的、高产的细胞株。 筛筛选选出出的的高高效效、高高产产细细胞胞株株系系，有有的的植植物物细细胞胞系系其其高高效效、高高产产性性能能稳稳定定多多年年，但但有有的的植植物物细细胞胞系系不不稳

15、稳定定，因因此，还需要定期检测，更新细胞株系。此，还需要定期检测，更新细胞株系。 第一步：解决生物量生产（促进细胞分裂）；第一步：解决生物量生产（促进细胞分裂）； 第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。于次生物质的积累。 、二步培养法、二步培养法、培养基中添加前体、培养基中添加前体 前体：有用次生代谢物的前驱物。前体：有用次生代谢物的前驱物。 烟草愈伤组织培养中，将前体物烟草愈伤组织培养中，将前体物质质烟碱酸加入，会增加烟碱的生成烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。量。 、培

16、养基中生长调节剂的作用、培养基中生长调节剂的作用 植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与再分化，而且能影响次生代谢物质的产与再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。如烟草愈伤组织培养中，培养基中添生。如烟草愈伤组织培养中，培养基中添加加IAA，能合成烟碱，而在含有，能合成烟碱，而在含有2,4-D的培的培养基上，烟碱合成受阻。养基上，烟碱合成受阻。 、培养条件的影响、培养条件的影响 光照、温度等影响次生代谢。在胡光照、温度等影响次生代谢。在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。并且低温条件下，生成量高。 、采用固相细胞培养系统、采用固相细胞培养系统 细细胞胞生生长长分分裂裂旺旺盛盛时时，次次生生代代谢谢物物产产量量低低。采采用用固固相相培培养养，将将细细胞胞培培养养在在惰惰性性基基质质中中，细细胞胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。