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1、肠道病原菌的分离与鉴定二肠道病原菌的分离与鉴定二l肠道病原菌的分离鉴定（肠道病原菌的分离鉴定（2）l肥达氏反应结果观察肥达氏反应结果观察l细菌的生长状态及菌落观察细菌的生长状态及菌落观察l细菌的药敏试验细菌的药敏试验l实验动物感染试验实验动物感染试验肥达氏反应结果观察肥达氏反应结果观察l试验管自第试验管自第1管看起，如有凝集管看起，如有凝集(阳性反应阳性反应)时则于管底呈圆片状、边缘时则于管底呈圆片状、边缘不整齐的凝集物，轻轻摇动，可见凝块或颗粒浮起，上清透明或有不同不整齐的凝集物，轻轻摇动，可见凝块或颗粒浮起，上清透明或有不同程度的混浊。其凝集的强弱可用程度的混浊。其凝集的强弱可用“+”号表
2、示如下：号表示如下： “+” 细菌全部凝集，液体澄清，有大片状，边缘不整齐的凝集块。细菌全部凝集，液体澄清，有大片状，边缘不整齐的凝集块。 “+” 细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊，凝集块较小些。细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊，凝集块较小些。 “+” 细菌部分沉淀于管底，液体半澄清，凝集块呈颗粒状。细菌部分沉淀于管底，液体半澄清，凝集块呈颗粒状。 “+” 细菌仅少量凝集，液体混浊。细菌仅少量凝集，液体混浊。 “-” 不凝集，液体混浊与对照管相似。不凝集，液体混浊与对照管相似。l记录结果并判定凝集效价。通常以能产生明显凝集记录结果并判定凝集效价。通常以能产生明显凝集(+)的血清最大稀释的血清最
3、大稀释倍数做为该血清的凝集效价。倍数做为该血清的凝集效价。结果分析结果分析l首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价才有诊断意首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价才有诊断意义。义。l真正的伤寒病人真正的伤寒病人O凝集素出现常较凝集素出现常较H凝集素为早，存在于血清内时间凝集素为早，存在于血清内时间较短；较短；H凝集素产生较慢但效价较高，存在时间较长，可达数年。凝集素产生较慢但效价较高，存在时间较长，可达数年。l过去曾接种过伤寒菌苗或患过伤寒病，近期又感染流感或布鲁氏菌病过去曾接种过伤寒菌苗或患过伤寒病，近期又感染流感或布鲁氏菌病时，可产生高效价的时，可产生高效价的H凝集
4、素及较低的凝集素及较低的O凝集素，此种反应称为非特凝集素，此种反应称为非特异回忆反应，其他如结核病、败血症、斑疹伤寒、肝炎等也可出现类异回忆反应，其他如结核病、败血症、斑疹伤寒、肝炎等也可出现类似反应。似反应。 l确诊为伤寒的患者中，约有确诊为伤寒的患者中，约有10肥达氏反应始终为阴性，故阴性结果肥达氏反应始终为阴性，故阴性结果不能完全排除伤寒的诊断。不能完全排除伤寒的诊断。 l采血时间不同，肥达氏反应的阳性率也不同，发病第一周采血时间不同，肥达氏反应的阳性率也不同，发病第一周50，第二，第二周周80，第四周，第四周90以上。恢复期凝集价最高，以后逐渐下降。一般以上。恢复期凝集价最高，以后逐渐
5、下降。一般以双份血清以双份血清(急性期和恢复期急性期和恢复期)对比，凝集价有明显上升者作为新近感对比，凝集价有明显上升者作为新近感染的指征。染的指征。菌落观察菌落观察l大小大小 大菌落大菌落(直径在直径在5mm以上以上) 中等大菌落中等大菌落(直径在直径在3mm左右左右) 小菌落小菌落(直径在直径在1mm左右左右) l形状：点状、圆形、卵圆形、叶状等。形状：点状、圆形、卵圆形、叶状等。l边缘：整齐、锯齿状、毛发状等。边缘：整齐、锯齿状、毛发状等。l表面：光滑、皱纹、湿润、干燥等。表面：光滑、皱纹、湿润、干燥等。l隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。l结构：均质性、颗
6、粒状等。结构：均质性、颗粒状等。l色调：无色、白色、黄色、褐色等。色调：无色、白色、黄色、褐色等。l透明度：透明、半透明、不透明等。透明度：透明、半透明、不透明等。 细菌的药物敏感性试验l原理：将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种原理：将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种一定量某种细菌的琼脂平板上。经培养后，可在纸片周围出一定量某种细菌的琼脂平板上。经培养后，可在纸片周围出现无细菌生长区，称抑菌环。测量抑菌环的大小，即可判定现无细菌生长区，称抑菌环。测量抑菌环的大小，即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。目的是使学生学会此实验方该细菌对某种药物的敏感程度。目的是使学生学会此实
7、验方法并了解其在临床治疗上的意义。法并了解其在临床治疗上的意义。l材料材料 普通琼脂平板培养基普通琼脂平板培养基 金黄色葡萄球菌分离培养物金黄色葡萄球菌分离培养物 大肠杆菌分离培养物大肠杆菌分离培养物 药物纸片药物纸片 酒精酒精 镊子镊子l方法方法 1按无菌操作法用接种环从分离培养平板上已选好的菌按无菌操作法用接种环从分离培养平板上已选好的菌落沾取细菌，反复交叉密涂于平板培养基上，以便生长出落沾取细菌，反复交叉密涂于平板培养基上，以便生长出均匀的菌苔均匀的菌苔(注意不要划破培养基注意不要划破培养基)。 2用沾酒精点燃灭菌的小镊子取药物纸片按下图贴于平用沾酒精点燃灭菌的小镊子取药物纸片按下图贴于
8、平板培养基上，并轻轻按压贴紧。板培养基上，并轻轻按压贴紧。 3做好标记，放做好标记，放37温箱培养过夜温箱培养过夜(不超过不超过17h)。 结果观察结果观察l观察纸片周围有无抑菌环，并测其直径大小。最观察纸片周围有无抑菌环，并测其直径大小。最终判断细菌对每种抗菌药物的敏感程度，记录和终判断细菌对每种抗菌药物的敏感程度，记录和报告结果。报告结果。l 判定标准：实验条件不同判定标准可有所不同。判定标准：实验条件不同判定标准可有所不同。一般抑菌环直径在一般抑菌环直径在15mm以上者为高度敏感，以上者为高度敏感，1015mm为中度敏感，为中度敏感，10mm以下为低度敏感，无以下为低度敏感，无抑菌环者为
9、耐药。抑菌环者为耐药。 肺炎球菌对小白鼠的传染试验肺炎球菌对小白鼠的传染试验 l实验动物的接种实验动物的接种 1首先将两种菌悬液做涂片，革兰色染色和镜检，以便与后述首先将两种菌悬液做涂片，革兰色染色和镜检，以便与后述死亡动物尸体的细菌学检查结果对比。死亡动物尸体的细菌学检查结果对比。 2用消毒好的注射器，按无菌操作法抽取菌悬液后，再用无菌用消毒好的注射器，按无菌操作法抽取菌悬液后，再用无菌镊子夹一灭菌棉花纸包，将针头刺入棉花纸包内，排出注射器镊子夹一灭菌棉花纸包，将针头刺入棉花纸包内，排出注射器内的气体，然后将注射器平置于试管架上。内的气体，然后将注射器平置于试管架上。 3固定小白鼠：用右手轻
10、拖鼠尾，使其爬行于金属网盖上，再固定小白鼠：用右手轻拖鼠尾，使其爬行于金属网盖上，再突然用左手拇食两指抓紧小白鼠颈项部及两耳，将鼠体搜入手突然用左手拇食两指抓紧小白鼠颈项部及两耳，将鼠体搜入手掌中，再用左手无名指和手掌夹住小白鼠尾根，以无名指和小掌中，再用左手无名指和手掌夹住小白鼠尾根，以无名指和小指夹住其左腿。指夹住其左腿。 4以无菌镊子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用镊以无菌镊子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用镊子取下注射器针头上的棉花纸包，放入消毒罐中。左手子取下注射器针头上的棉花纸包，放入消毒罐中。左手倾斜，使小白鼠头部向下，然后将注射器针头自小白鼠倾斜，使小白鼠头部向下，然后将注射器针头自小白鼠左侧腹股沟部刺入皮下，使针头在皮下组织内前进约左侧腹股沟部刺入皮下，使针头在皮下组织内前进约l cm左右，再直立注射器，轻轻向左右，再直立注射器，轻轻向F刺入腹腔内，注入菌刺入腹腔内，注入菌液液02ml后再将针头拔出。将小白鼠用染料涂抹做好标后再将针头拔出。将小白鼠用染料涂抹做好标记，放入动物罐中。记，放入动物罐中。
