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1、实时荧光定量PCR原理与应用Gene Expression DivisionChina MarketingBio-Rad Laboratories提纲提纲PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用PCR目的及背景 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是年代中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝.分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。技术实际上是在模板， 引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应，技术的特异性取决于
2、引 物 和 模 板 结 合 的 特 异 性 。 反 应 分 三 步 ： 变 性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（ex tension），反应过程见图。传统 PCR传统 PCR传统 PCR通过凝胶电泳对终产物进行定性分析(30 cycles)传统 PCRRealityTheoretical increaseLog Target DNACycle #In theory, PCR reactions amplify exponentially, doubling every cycle and grow forever.In reality, PCR: 理论vs. 实际
3、 100 倍稀释普通PCR分析终产物特点108106102104提纲提纲PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用定量PCR通过通过Ct值值和和标准曲线标准曲线实现对实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析5模板Cycle 152X 模板4X模板30-40 循环Cycle 25555荧光检测FFFFFFFF荧光监测化学物质Log ViewLinear View本底期、指数扩增期、平台期 荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期）所经过的扩增循环次数循
4、环次数Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04C(t) value18.12 +/- 0.04C(t) value18.12 +/- 0.04荧光阈值与Ct值定量PCR分析初始模板特点108标准曲线106108标准曲线104108106标准曲线108106102104标准曲线108106102104T标准曲线标准曲线108106102104T标准曲线105 copies/well标准曲线Ct值特性ProductT = (Template
5、0)2n (n = # of cycles)120 ng60 ng 30 ng 15 ng24.38 0.0925.64 0.0926.68 0.0427.71 0.04Input C(t)ProductT = (Template0)23.32 = (Template0)101 X 106 1 X 105 1 X 104 1 X 103 1 X 10217.09 0.04 20.10 0.06 23.41 0.0526.68 0.0530.26 0.26Input C(t)定量PCR优点定量：对初始模板的绝对定量优点：更灵敏，宽广的动力学范围污染机会少：闭管化学没有后处理：不用杂交、电泳、拍照
6、操作简单：高度自动化用途广泛：既能定量又能定性灵活：既可多点测定，又可单点测定提纲提纲PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用非特异性标记SYBR Green IEva Green荧光化学物质特异性的荧光探针TaqMan分子信标(Molecular beacons)SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green Iq使用方便，只需要一对引物 不必设计复杂的荧光探针 q熔解曲线 鉴定PCR有无杂带、引物二聚体q便宜 q灵敏q无模板特异性 不能分辨非特异产物q不能做复合PCR扩增融解曲线反应程序1、融解曲线在定量P
7、CR反应完成之后2、软件自动分析结果，生成融解曲线图谱融解曲线分析-原始图谱融解曲线分析-导数图谱EvaGreen 饱和荧光染料非非饱和双和双链DNA荧光染料：光染料：e.g. SYBR GreenI饱和双和双链DNA荧光染料：光染料：e.g. Eva GreenSaturation DyesDye saturation leaves no room for relocation events during melting饱和染料特点和染料特点饱和型的专用DNA染料高浓度不抑制PCR反应当双链DNA局部解链时，游离下来的染料不会重新结合到DNA分子上去,荧光强度的降低精准可靠地反映出DNA分子
8、的解链情况Eva Green MixBio-RadPCR 抑制作用Source: Barrett et al., Quantace Ltd.1x1.5x染料重新分配Source: Barrett et al., Quantace Ltd.200bp1.2kb2.5kb200bp1.2kb2.5kb高分辨溶解曲线High Resolution Melt (HRM)vChemistry DNA binding dyes - LCgreen, EvaGreen and Syto9 (DNA饱和染料，低抑制作用)vHardware Able to resolve 0.1oC increments （仪
9、器在融解过程中更密集地收集数据）vSoftware Algorithm able to separate small difference in Tm（分析算法可以分辨Tm值的微小差异）Just import CFX Melt DataAutomatic selection of Pre- and Post- Melt regionsNormalize curvesJust check normalized plots and apply temperature shiftAutomatically detects clustersPrecision Melt - Genotyping Hom
10、ozygous - CCHomozygous - TTHeterozygous - CTSsoFast EvaGreen & SNP GenotypingGA Mutation() G:G Wild-type() A:A Homozygous Mutant() G:A HeterozygousDiscrimination of a Class 2 SNPMethylation Studies CGU (Taipei)Temperature shiftedDifference curveTAQMAN 探针TAQMAN 探针TAQMAN 探针q对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测q可以
11、在一个反应中进行两个基因的定量q荧光强度与反应物成正比q反应成本较高q设计复杂TaqMan探针小结提纲提纲PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用定量定量PCR应用应用I-I-实时定量实时定量病原体定量检测转基因拷贝数的检测DNADNA定量拷贝数研究（替代定量拷贝数研究（替代Southern BlotSouthern Blot）RNARNA定量基因表达差异（替代定量基因表达差异（替代Northern Blot)Northern Blot) 单个或多个基因地表达谱分析不同组织、器官不同时期不同处理定量定量PCR应用应用IIII：终点读板：终点读板 基因突变分析基因突变分析单基因遗传病诊断，如血友病、地贫单基因遗传病诊断，如血友病、地贫 SNPSNP扫描扫描疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNPSNP的的鉴定鉴定SNPSNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异的个体差异药物副反应的预防，如麻醉意外药物副反应的预防，如麻醉意外 物种鉴定、菌株鉴定物种鉴定、菌株鉴定各种病毒，细菌，病毒各种病毒，细菌，病毒病原体检病原体检测，如炭疽菌，测，如炭疽菌，E coli. O157E coli. O157
