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1、实验四实验四 血凝及血凝抑制血凝及血凝抑制实验实验 实验目的实验目的n1.1.了解血凝及血凝抑制实验原理了解血凝及血凝抑制实验原理n2.2.掌握血凝及血凝抑制试验方法掌握血凝及血凝抑制试验方法n3.3.掌握基本操作技术掌握基本操作技术, ,了解其实用价值了解其实用价值实验原理实验原理n凝集试验：颗粒性抗原与相应抗体结合后发生凝凝集试验：颗粒性抗原与相应抗体结合后发生凝集的集的血清学血清学试验。试验。n抗原与抗体复合物在电解质作用下，经过一定时抗原与抗体复合物在电解质作用下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块。间，形成肉眼可见的凝集团块。n试验可在玻板上进行，称为试验可在玻板上进行，称为玻板凝
2、集试验玻板凝集试验，可用，可用已知抗原检查未知抗体，或用于已知抗体诊断未已知抗原检查未知抗体，或用于已知抗体诊断未知抗原，；知抗原，；n亦可在试管中进行，称亦可在试管中进行，称试管凝集试验试管凝集试验，主要用于，主要用于抗血清效价测定。抗血清效价测定。 实验原理实验原理某些病毒具有凝聚某些动物红细胞的能力，某些病毒具有凝聚某些动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称为血球验称为血球凝集试验凝集试验，以此来推测被检材，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是料中有无病毒存在，是非特异性的非特异性的，但是，但是病毒的血凝可为相应的特异性抗体所抑制，
3、病毒的血凝可为相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制实验，具即血球凝集抑制实验，具有特异性有特异性，通过，通过HA-HIHA-HI实验，可用已知的血清来鉴定未知实验，可用已知的血清来鉴定未知的病毒的病毒 血凝试验原理血凝试验原理n血凝素（血凝素（hemagglutinin HAhemagglutinin HA）：）： （HAHA，从，从H1H15),H1H15),呈柱状由呈柱状由病病毒基因编码的糖蛋白刺突。毒基因编码的糖蛋白刺突。n功能：功能：吸吸附附细细胞胞：与与细细胞胞上上受受体体结结合合, ,使病毒侵入细胞使病毒侵入细胞凝凝集集多多种种动动物物的的红红细细胞胞（血血凝凝试试验验）： HA
4、HA能能与与人人或或其其它它动动物物多多种种红红细细胞胞表表面面N N乙乙酰酰神神经经氨氨酸酸酶酶受受体体结结合合引引起起红红细胞凝集细胞凝集具具抗抗原原性性：其其抗抗体体能能中中和和病病毒毒-中中和和抗抗体体：抑抑制制血血凝凝（血凝抑制试验）（血凝抑制试验）血凝素（HA）柱状流感病毒结构模式图流感病毒结构模式图血凝原理血凝抑制原理血凝抑制试验原理血凝抑制试验原理病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝红细胞表面的受体上，用免
5、疫血清阻止红细胞凝集的现象，称为集的现象，称为血凝抑制血凝抑制实验材料实验材料器材：器材：U U型或型或V V型微量反应板、微量移液器、枪头型微量反应板、微量移液器、枪头试剂：试剂：1%1%鸡红细胞、鸡红细胞、NDIVNDIV血凝素、血凝素、NDIVNDIV抗血清、抗血清、生理盐水生理盐水实验步骤实验步骤1.1.取取9696孔孔V V型反应板型反应板1 1块置于水平实验台上，在第块置于水平实验台上，在第1 1排排1-101-10孔内加入孔内加入25ul25ul生理盐水，第生理盐水，第1111孔不加。第孔不加。第1212孔加孔加25ul25ul生理盐水生理盐水2.2.在第在第1 1孔内加入血凝素
6、孔内加入血凝素25ul25ul，混匀后吸出，混匀后吸出25ul25ul加入加入第第2 2孔内，再混匀后吸出孔内，再混匀后吸出25ul25ul加入第加入第3 3孔内，依次类推孔内，依次类推至第至第1010孔时弃掉孔时弃掉25ul25ul。第。第1212孔不加作阴性对照孔不加作阴性对照孔孔。n3.3.在在1-121-12孔均加入孔均加入25ul25ul的生理盐水。的生理盐水。n4.4.在每孔内加入在每孔内加入25ul1%25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡，的鸡红细胞悬液，震荡，室温静止感作室温静止感作15-30min15-30min，每，每5min5min观察一次结果。观察一次结果。n5.5.计算血
7、凝效价，稀释使成为四价备用计算血凝效价，稀释使成为四价备用n以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为即为1个血凝单位，实验时采用个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如个血凝素单位，例如血凝素效价为血凝素效价为1 320，为，为1个单位，个单位，4个单位即为个单位即为1 80稀释。下面前经校对取稀释。下面前经校对取4个血凝单位用于实验个血凝单位用于实验 血凝试验结果判定血凝试验结果判定n效价判定：效价判定： 凝集特别显著：凝集特别显著：“” 凝集现象次之：凝集现象次之：“” 凝集清楚可见：凝集清楚可见：“” 稍显凝集者：稍显凝集者：“”
8、n血凝效价血凝效价：呈：呈“”凝集时的最高稀释度。凝集时的最高稀释度。此时的稀释度即为此时的稀释度即为1 1个血凝单位个血凝单位。结果判定结果判定1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定 血凝反应强度示意图血凝反应强度示意图“4” 红红细细胞胞呈呈片片状状凝凝集集，均均匀匀布布满满孔孔底底，边边缘缘有有时时不不整整齐齐或或皱皱缩。缩。“3” 红细胞呈片状凝集，但面积略小于红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。“2” 红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。“” 红细胞大部分沉于孔底中央，周
9、围有少量散在凝集颗粒。红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。“” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。2.对对照照孔孔正正常常的的情情况况下下，红红细细胞胞凝凝集集100%的的稀稀释释度度为为判判定定血血凝凝价价的的终终点点。凡凡能能使使鸡鸡红红细细胞胞完完全全凝凝集集的的病病毒毒最最高高稀稀释释倍倍数数为为病病毒毒的的凝凝集集价。价。血凝抑制血凝抑制1.取取96孔孔V型反应板型反应板1块置于水平实验台上，在块置于水平实验台上，在第第1排排1-10孔内加入孔内加入25ul生理盐水，第生理盐水，第11孔不加。孔不加。第第12孔加孔加25ul生理
10、盐水。生理盐水。2.在第在第1孔内加入被检血清孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出，混匀后吸出25ul加入第加入第2孔内，再混匀后吸出孔内，再混匀后吸出25ul加入第加入第3孔内，依次类推至第孔内，依次类推至第10孔时弃掉孔时弃掉25ul。第。第12孔孔不加作阴性对照孔。不加作阴性对照孔。n3.3.在在1-121-12孔内均加入孔内均加入“四价四价”血凝素血凝素25ul25ul，震荡后，室温静止，震荡后，室温静止作用作用5min5min。n4.4.在在1-12 1-12 孔内均加入孔内均加入1%1%的鸡红细胞悬液的鸡红细胞悬液25ul25ul，震荡，室温感作，震荡，室温感作15-30min15
11、-30min，每，每5min5min观察一次结果。观察一次结果。n5.5.观测结果，记录实验数据观测结果，记录实验数据血凝抑制试验结果判定血凝抑制试验结果判定n测定孔测定孔 RBCRBC沉于孔底中心，呈纽扣状。沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)(+) 凝集凝集 （- -）n病毒对照孔：凝集病毒对照孔：凝集nRBCRBC对照孔：无自凝对照孔：无自凝n血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制的最高血清血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制的最高血清稀释度。稀释度。 思考问题思考问题n1.1.计算出计算出病毒的凝集价、血凝抑制价病毒的凝集价、血凝抑制价n2.2.血凝试验中为什么要加补充液？血凝试验中为什么要加补充液？
12、n3.3.为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？n4.4.病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应? ? 血血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应? ? 为什么为什么? ?孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(+)12（-)HA稀释度248163264128256、弃生理盐25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素x生理盐水2525252525252525252525251%鸡红细胞2525252525252525
13、25252525结果预测+-+_孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(+)12（-)HI稀释度248163264128256、弃生理盐25252525252525252525X25待检血清2525252525252525252525x4HA血凝素2525252525252525252525251%鸡红细胞252525252525252525252525结果预测-+ +-+凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液0.25ul为一个病毒凝集单位。凡能使4个凝集单位的病毒凝集红细胞的作用完全受到抑制的血清最高稀释倍数，称为血凝抑制价
