《生物化学与基础分子生物学实验：聚合酶链式反应（PCR）及酶切鉴定转化产物》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学与基础分子生物学实验：聚合酶链式反应（PCR）及酶切鉴定转化产物（33页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）及酶切）及酶切鉴定转化产物鉴定转化产物 一、一、实验目的实验目的二、二、实验原理实验原理三、三、实验试剂实验试剂四、四、实验步骤实验步骤五、五、注意事项注意事项讲授内容讲授内容v学学习和掌握和掌握PCR的基本原理和的基本原理和实验技技术v学学习和掌握限制性内切和掌握限制性内切酶双双酶切切鉴定定转化化产物的基本原理和物的基本原理和实验技技术v掌握掌握琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳的基本原泳的基本原理和理和实验技技术一、实验目的一、实验目的v聚合聚合酶链反反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种通）是一种通过体外体外酶促反促反应大量、
2、快速、大量、快速、选择性地合成目的性地合成目的DNA片段的核酸合成技片段的核酸合成技术。v具有高度特异性、操作具有高度特异性、操作简单、高效快速、灵敏度高、高效快速、灵敏度高等特点，是最常用的分子生物学技等特点，是最常用的分子生物学技术之一。之一。二、实验原理二、实验原理PCR的基本原理的基本原理试管中进行的试管中进行的试管中进行的试管中进行的DNADNA复制反应，依据复制反应，依据复制反应，依据复制反应，依据DNADNA半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制的机理；的机理；的机理；的机理；体外体外体外体外DNADNA分子于不同温度下可分子于不同温度下可分子于不同温度下可分子于不同温度下可变
3、性和复性变性和复性变性和复性变性和复性的性质；的性质；的性质；的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使双链双链双链双链DNADNA变成单链变成单链变成单链变成单链，单链单链单链单链DNADNA与人工合成的与人工合成的与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火引物退火引物退火，DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶使使使使引引引引物物物物沿沿沿沿着着着着单单单单链链链链模模模模板板板板延延延延伸伸伸伸为为为为双双双双链链链链DNADNA。PCR原理原理5533d.NTPs耐热耐热DNA聚聚合酶合酶
4、引物5353535353535353添加反应混合液添加反应混合液及样本及样本变性变性535353535353退火退火加入试管中加入试管中延伸延伸53535353继续延伸继续延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环PCR原理原理5353535355335353第二个循环第二个循环4个拷贝个拷贝第三个循环第三个循环8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353第第n个循环个循环2n个拷贝个拷贝PCR原理原理PCR的反应体系的反应体系v参与参与PCR反反应的主要成份的主要成份:v模板、引物、模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合聚合酶和和缓冲液冲液
5、等。等。PCR的反应条件的反应条件 v反应温度（变性、退火、延伸）反应温度（变性、退火、延伸）v反应时间（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）v循环次数（循环次数（PCR效率及产物量）效率及产物量）PCR反应条件的优化反应条件的优化v优化化的的目目的的主主要要有有两两个个，即即提提高高扩增增产物物特特异异性性和和提提高高产物物产量。量。v但在多数情况下，但在多数情况下，这两个目的却是互相矛盾的。两个目的却是互相矛盾的。v总体体来来说，适适当当减减少少模模板板、引引物物、聚聚合合酶、Mg2+的的浓度度和和适适当当提提高高退退火火温温度度、减减少少循循环次次数数，可可以以提提高高产物的特
6、异性，但相物的特异性，但相应会减少会减少产量；量；v反反之之，则可可以以提提高高产物物的的产量量，但但增增加加非非特特异异性性扩增增产物。物。v因因此此，应根根据据实验目目的的合合理理选择最最佳佳反反应条条件件，必必要要时可可进行多次行多次预实验反复摸索。反复摸索。1、引物设计、引物设计引物是决定引物是决定PCR成成败的最关的最关键因素。因素。 必必须保保证引物碱基序列的高度特异性；引物碱基序列的高度特异性； 引物引物长度一般度一般为15-30 bp，过短短则特异性降低；特异性降低； GC含量控制在含量控制在40-60%，且两个引物的，且两个引物的Tm值不得相差太大；不得相差太大； 引物自身不
7、得存在引物自身不得存在3 bp以上的互以上的互补碱基序列；碱基序列； 两条引物之两条引物之间不不应存在存在4个以上个以上连续的同源性或互的同源性或互补性碱基；性碱基； 避免避免4个以上同一碱基的个以上同一碱基的连续出出现； 引物合成引物合成质量要好，并需要量要好，并需要纯化；化； 反反应体体系系中中引引物物浓度度一一般般应控控制制在在0.2-1mol/L，过低低则产量量降降低低，过高高则导致非特异性致非特异性扩增。增。2、耐热、耐热DNA聚合酶聚合酶 通通常常Taq DNA聚聚合合酶用用量量为0.5-5U/100l，酶量量过大大会会导致非特异致非特异产物的增加；物的增加； 传统使使用用的的Ta
8、q DNA聚聚合合酶的的一一个个致致命命缺缺点点是是不不具具备 35校正外切校正外切酶活性，活性，错配率高配率高。 大大约每每聚聚合合9000个个核核苷苷酸酸发生生一一次次错误掺入入，经过约20个个循循环后后，扩增增产物物中中随随机机突突变率率大大致致为1/400-1/900， 导致致扩增增产物物发生生突突变。现已已有有多多种种高高保保真真耐耐热DNA聚聚合合酶（如如Pfu DNA聚聚合合酶、VENT DNA聚聚合合酶等）可供等）可供选择，用于某些精度要求高的，用于某些精度要求高的实验。3、模板、模板vPCR对模板的模板的质和量要求都不是太高。和量要求都不是太高。vRNA也可作也可作为模板，但
9、模板，但须先逆先逆转录为cDNA。v模模板板不不需需要要太太纯，但但不不能能混混有有任任何何蛋蛋白白酶、核核酸酸酶、Taq DNA聚合聚合酶抑制抑制剂以及能以及能结合合DNA的蛋白。的蛋白。v对于于扩增增哺哺乳乳动物物基基因因组中中单拷拷贝序序列列，模模板板DNA的加入量一般的加入量一般为0.2-2 g。v对于于质粒粒DNA模模板板只只需需要要20ng。模模板板量量过多多，会会增加非特异性增加非特异性扩增机会。增机会。4、Mg2+浓度：浓度：vMg2+是是维持持Taq DNA聚聚合合酶活活性性所所必必需需的的，还影影响响DNA的的Tm值、产物物的的特特异异性性及及引引物物二二聚聚体体的的形形成
10、。成。vMg2+浓度度过低低时，酶活活性性显著著降降低低，使使产量量降降低低；过高高时，易生成非特异性，易生成非特异性扩增增产物。物。v由由于于模模板板DNA、引引物物、EDTA和和dNTP均均可可与与Mg2+结合合而而降降低低游游离离Mg2+浓度度，因因此此Mg2+的的浓度度应比比dNTP高高0.2-2.5 mmol/L，模模板板的的DNA应溶溶于于10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)/0.1 mmol/L EDTA中。中。5、dNTPsvdNTP具有具有较强的酸性，使用前的酸性，使用前应调节pH至至7.0-7.5。v浓度度范范围为20-200 mol/L，高高浓度度dNTPs
11、易易产生生错误掺入，而入，而浓度太低度太低则降低反降低反应物的物的产量。量。v四四种种dNTP应等等当当量量配配制制，其其中中任任何何一一种种浓度度偏偏高高或或偏偏低低，都都会会诱导错误掺入入，降降低低合合成成速速度度，过早早终止反止反应。v决决定定最最低低dNTP浓度度的的因因素素是是靶靶序序列列DNA的的长度度和和组成。成。v在在100 L反反应体体系系中中，20 mol/L dNTPs基基本本满足足合合成成2.6 g DNA，50 mol/L dNTPs可可以以合合成成6.6 g DNA，而而200 mol/L dNTPs则足以合成足以合成25 gDNA。6、变性温度和时间、变性温度和时
12、间 v模板模板DNA充分充分变性是性是PCR顺利利进行的前行的前 提。提。v在在PCR扩增开始的第一次增开始的第一次变性性时， 应给予足予足够的的时间和温度，使基因和温度，使基因组DNA充分充分变性。性。v通常采用通常采用94-95 C变性性1分分钟。v一般在第一般在第1次次热循循环前前预先先94 C变性性5-10分分钟，然后，然后再再进入循入循环过程的程的94 C变性性阶段。段。7、复性温度与时间、复性温度与时间v这是决定是决定PCR成成败的又一个关的又一个关键因素，它直接因素，它直接决定了决定了扩增增产物的特异性。物的特异性。v合适的复性温度合适的复性温度应低于低于PCR条件下真条件下真实
13、Tm值。v降低温度可提高降低温度可提高产量，但增加非特异性量，但增加非特异性扩增；增；反之反之则提高特异性但降低提高特异性但降低产量。量。8、延伸温度与时间、延伸温度与时间 v延伸温度一般延伸温度一般为72 C。v延伸延伸时间主要主要视目目标DNA片段片段长度而定。正常度而定。正常掺入速度入速度为35-100 nt/秒，一般情况下秒，一般情况下30-60秒就足秒就足够，时间过长也增加非特异性也增加非特异性扩增。增。v但最后一个循但最后一个循环可将可将时间延延长到到4-10分分钟。9、循环次数、循环次数v在在PCR反反应后期，由于底物和引物的消耗、后期，由于底物和引物的消耗、酶活性的活性的下降、
14、下降、终产物（双物（双链DNA、焦磷酸）的堆、焦磷酸）的堆积等原因，等原因，导致致产物从原来以指数物从原来以指数级增加的形式增加的形式转变为线性形式，性形式，即所即所谓平台效平台效应。v所以即便再增加循所以即便再增加循环数，由于数，由于产物的增加量有限，反物的增加量有限，反而会增加非特异性而会增加非特异性扩增的机会。增的机会。v常常规循循环数数为25-40，多数，多数为30次左右。次左右。v如果要如果要进一步提高一步提高产量，可将量，可将样品稀品稀释1000-10000倍倍后后进行第二行第二轮PCR扩增增v限制性内切限制性内切酶:v是一是一类能能识别和切割双和切割双链DNA 分子内分子内特定碱
15、基特定碱基顺序序的的核酸内切核酸内切酶，为原核生物所特有，用于抵抗外来原核生物所特有，用于抵抗外来DNA 的侵的侵袭。v目前，限制性内切目前，限制性内切酶被广泛运用于基因分子克隆技被广泛运用于基因分子克隆技术中，中，是体外剪切是体外剪切DNA 片段的主要工具。片段的主要工具。v由于外源由于外源DNA 片段插入片段插入质粒中，是在两个限制性内切粒中，是在两个限制性内切酶酶切位点中切位点中进行的，因此，可以使用行的，因此，可以使用单酶切或双切或双酶切切手段手段对转化化筛选得到的得到的重重组子子进行行鉴定定。三、实验材料三、实验材料1、实验器材：器材：v微微量量移移液液器器，硅硅烷化化的的PCR管管
16、，PCR仪，琼脂脂糖糖凝凝胶胶电泳泳所所需需设备，台台式式高高速速离离心心机机，凝凝胶胶成成像像仪，制制冰冰机，各种玻璃机，各种玻璃仪器以及塑料离心管、器以及塑料离心管、枪头等。等。三、实验材料三、实验材料2、试 剂DNA模板（模板（0.5-1.0 g/l）20 umol/L 上游引物上游引物/下游引物下游引物rTaq DNA polymerase50TAE缓冲液：冲液：Tris碱碱242 g，冰乙酸，冰乙酸57.1 mL，EDTA-Na22H2O 37.2 g，三蒸水，三蒸水补足足1L。 工作液工作液浓度度为1TAE。四、实验步骤四、实验步骤1.在在0.2 ml PCR管中加入管中加入2.混
17、匀后短暂离心混匀后短暂离心3.将离心管置于将离心管置于PCR仪中，盖上盖子。仪中，盖上盖子。129四、实验步骤四、实验步骤4.设定定热循循环参数：参数：5.进行行扩增反增反应（约1.5小小时）v限制性内切限制性内切酶酶切：切：在实际实验中，为避免超微量操作，通常采用预混部分试在实际实验中，为避免超微量操作，通常采用预混部分试剂再最后混匀的方式进行加样，预混试剂已由教师提前准剂再最后混匀的方式进行加样，预混试剂已由教师提前准备好：备好：v（3） 混匀，低速离心，避免残留液体挂壁；混匀，低速离心，避免残留液体挂壁；v（4） 37oC 水浴水浴10min；v（5） 酶切切产物留待物留待PCR 反反应
18、结束后一起束后一起进行行琼脂糖脂糖电泳泳检测。四、实验步骤四、实验步骤6. 配制配制1%琼脂糖凝胶：脂糖凝胶： 称取称取0.25 g琼脂糖粉末，与脂糖粉末，与25mL 1TAE混合后，微波炉中加混合后，微波炉中加热溶解，溶解，待冷却至待冷却至60 oC左右左右时加入加入2.5 LGold View染色（染色（1 L/10 mL）轻轻摇匀，倒入匀，倒入洁净的模具中制胶。室温静置半小的模具中制胶。室温静置半小时左右，待凝胶完左右，待凝胶完全凝固后拔出梳子，并将胶全凝固后拔出梳子，并将胶块放入倒放入倒满1TAE的的电泳槽中准泳槽中准备电泳。泳。7.1% 琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳鉴定：定： 取出取出P
19、CR及及酶切反切反应管，取管，取18L产物加入物加入10上上样缓冲液冲液2 L中混中混匀，同匀，同时以以DNA分子量分子量标准准为对照，分照，分别上上样后后90V电泳泳30 min，用凝胶成像用凝胶成像仪照相，与照相，与Dna分子量分子量标准准对照分析，在相当于照分析，在相当于产物大物大小的位置小的位置应出出现荧光光产物。物。五、注意事项五、注意事项vPCR非常灵敏非常灵敏, 操作操作应该在一个没有在一个没有DNA污染的干染的干净环境中境中进行。行。v吸吸头、离心管、离心管应高高压灭菌菌, 每次吸每次吸头用用毕应更更换, 不要不要互相互相污染染试剂。 v加加试剂前前, 应短促离心短促离心10秒
20、秒钟, 然后再打开管盖然后再打开管盖, 以防手以防手套套污染染试剂及管壁上的及管壁上的试剂污染吸染吸头侧面。面。 vPCR的的样品品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。在冰浴上化开，并且要充分混匀。v应设含除模板含除模板DNA所有其它成分的所有其它成分的负对照照。问题与讨论问题与讨论1.降低或提高退火温度降低或提高退火温度对PCR反反应是否有影响？是否有影响？为什么什么？2.延延长加加热变性性时间对PCR反反应有何影响？有何影响？3.PCR反反应有哪些主要有哪些主要应用？用？试通通过查阅资料料举例例说明。明。4.酶切反切反应中，中，“星号活性星号活性”代表什么意思？如何避免代表什么意思？如何避免产生生“星号活性星号活性”？5.如何根据待分离如何根据待分离DNA 的大小的大小选择合适的合适的琼脂糖凝胶脂糖凝胶浓度？度？DNA Marker (ladder)
