第十一章第十一章 分子分子发光分析法光分析法一、分子一、分子荧光与磷光光与磷光产生生过程程luminescence process of luminescence process of molecular fluorescence molecular fluorescence phosphorescencephosphorescence二、激二、激发光光谱与与荧光光光光谱excitation spectrum and excitation spectrum and fluore-scence spectrumfluore-scence spectrum三、三、荧光的光的产生与分子构造关系生与分子构造关系 relation between relation between fluorescence and molecular fluorescence and molecular structurestructure四、影响四、影响荧光光强度的要素度的要素factor influenced factor influenced fluorescencefluorescence第一节 分子荧光与磷光molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence 一、一、荧光与磷光的光与磷光的产生生过程程 luminescence process of luminescence process of molecular fluorescence molecular fluorescence phosphorescencephosphorescence 由分子构造实际，主要讨论荧光及磷光的产活力理。
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ； 2.2.电子激子激发态的多重度的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规那么)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； S0→T1 禁阻跃迁；经过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小； 2.2.激激发态→→基基态的能量的能量传送途径送途径 电子处于激发态是不稳定形状，前往基态时，经过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传送途径传送途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁 激发态停留时间短、前往速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态； S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转换l 2T2内转换振动弛豫 非非辐射能量射能量传送送过程程( (去活化去活化过程〕程〕 振振动弛豫：同一弛豫：同一电子能子能级内以内以热能量交能量交换方式由高振方式由高振动能能级至低相至低相邻振振动能能级间的的跃迁。
迁发生振生振动弛豫的弛豫的时间10 -12 s10 -12 s 内内转换：同多重度：同多重度电子能子能级中中, ,等能等能级间的无的无辐射能射能级交交换 经过内内转换和振和振动弛豫，高激弛豫，高激发单重重态的的电子子跃回第一激回第一激发单重重态的最低振的最低振动能能级 外外转换：激：激发分子与溶分子与溶剂或其他分子之或其他分子之间产生相互作用而生相互作用而转移能量的非移能量的非辐射射跃迁；迁； 外外转换使使荧光或磷光减弱或光或磷光减弱或““猝猝灭〞系系间跨越：不同多重跨越：不同多重态, ,有重叠的有重叠的转动能能级间的非的非辐射射跃迁 改改动电子自旋，禁阻子自旋，禁阻跃迁，迁，经过自旋自旋——轨道耦合道耦合进展 辐射能量射能量传送送过程程 荧光光发射：射：电子由第一激子由第一激发单重重态的最低振的最低振动能能级→→基基态〔〔 多多为 S1→ S0 S1→ S0跃迁〕，迁〕，发射波射波长为 ‘2 ‘2的的荧光；光； 10-7 10-7～～10 10 -9 s -9 s 。
由由图可可见，，发射射荧光的能量比分子吸收的能量小，光的能量比分子吸收的能量小，波波长长；； ‘2 > ‘2 > 2 > 2 > 1 1 ；； 磷光磷光发射：射：电子由第一激子由第一激发三重三重态的最低振的最低振动能能级→→基基态〔〔 T1 → S0T1 → S0跃迁〕；迁〕； 电子由子由S0S0进入入T1T1的能的能够过程：〔程：〔 S0 → T1 S0 → T1禁阻禁阻跃迁〕迁〕 S0 → S0 →激激发→→振振动弛豫弛豫→→内内转移移→→系系间跨越跨越→→振振动弛豫弛豫→ T1→ T1 发光速度很慢：光速度很慢： 10-4 10-4～～100 s 100 s 光照停光照停顿后，可后，可继续一段一段时间 二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定第二单色器的波长(选最大发射波长),使测定的荧光(磷光)波长坚持不变，然后改动第一单色器的波长扫描，以测定出的相对荧光(磷光)强度为纵坐标，以相应的激发光波长为横坐标作图，所绘出的曲线就是该荧光(磷光)物质的激发光谱。
〔图中曲线I 〕 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大； 2.2.荧光光光光谱( (或磷光光或磷光光谱) ) 固定第一单色器波长(选最大激发波长)，使激发光波长和强度坚持不变，然后改动第二单色器波长，进展扫描，得到化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III) 3.3.激激发光光谱与与发射光射光谱的关系的关系 a. a.斯托克斯〔斯托克斯〔StokesStokes〕位移〕位移 发射射光光谱〔〔荧光光〕〕的的波波长比比激激发光光谱的的长缘由由：：振振动弛弛豫豫和和内内转换去去活活过程程耗耗费了了部部分分激激发能能；；辐射射跃迁迁能能够使使激激发分分子子下下降降到到基基态的的不不同同振振动能能级，，然然后后经过振振动弛弛豫豫进一一步步损失；溶失；溶剂与激与激发态分子分子发生碰撞生碰撞导致能量致能量损失 b. b.发射光射光谱的外形与激的外形与激发波波长无关无关 电子子跃迁迁到到不不同同激激发态能能级，，吸吸收收不不同同波波长的的能能量量( (如如能能级图 2 2 , , 1)1)，，产生生不不同同吸吸收收带，，但但均均回回到到第第一一激激发单重重态的的最最低低振振动能能级再再跃迁迁回回到到基基态，，产生生波波长一一定定的的荧光光( (如如 ‘2 )‘2 )。
c. c. 镜像像规那么那么 通通常常荧光光发射射光光谱与与它它的的吸吸收收光光谱〔〔与与激激发光光谱外外形形一一样〕成〕成镜像像对称关系 镜像像规那么的解那么的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然 200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱 三、荧光的产生与分子构造的关系 relation between fluorescence and molecular structure 1. 1.分子分子产生生荧光必需具光必需具备的条件的条件〔〔1 1〕具有适宜的构造；〕具有适宜的构造；〔〔2 2〕具有一定的〕具有一定的荧光量子光量子产率 荧光量子光量子产率〔率〔〕：〕： 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射； 2.2.化合物的构造与化合物的构造与荧光光〔1〕跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；〔2〕共轭效应：提高共轭度有利于添加荧光效率并产生红移〔3〕刚性平面构造：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。
如荧光素和酚酞有类似构造，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有P348〔4〕取代基效应：芳环上有供电基，使荧光加强 四、影响荧光强度的要素 relation between fluorescence and molecular structure 影响荧光强度的外部要素(P350)1.溶剂的影响 除普通溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的构成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度添加，振动弛豫和外转换的几率添加因此，采用低温荧光分析法3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需求严厉控制； 4.4.各种散射光的影响各种散射光的影响 溶溶剂产生的与激生的与激发波波长有关的散射光，如瑞利散射有关的散射光，如瑞利散射﹑拉拉曼光散射曼光散射荧光光发射波射波长与激与激发波波长无关，只需改无关，只需改动激激发光光的波的波长就可防止散射挂光的干就可防止散射挂光的干扰5.5.激激发发光照射的影响光照射的影响 有些有些荧光物光物质的稀溶液在激的稀溶液在激发光的照射下容易光的照射下容易发生分解，生分解，引起引起荧光光强度的急度的急剧降低。
所降低所谓光分解作用，即物光分解作用，即物质遭到光遭到光线照射后，所吸收的能量使分子内的一个或几个照射后，所吸收的能量使分子内的一个或几个键发生断裂，生断裂，使使该物物质分解 最好采用最好采用强度度较低的激低的激发光，同光，同时缩短短测定定时间 6.6.溶液溶液荧荧光的猝光的猝灭灭 荧光物质与溶剂分子或其他溶质分子相互作用，引起荧光强度下降或消逝的景象称为荧光淬灭能引起荧光淬灭的物质称为淬灭剂 碰撞猝灭，单重激发态的荧光分子与猝灭剂碰撞后，以无辐射跃迁前往基态，引起荧光强度下降 猝灭剂分子与荧光分子发生作用，构成配合物或发生电子转移反响 7.7.重原子效应重原子效应• 荧光分子的芳环上被F， Cl，Br，I取代后，使系间窜跃加强，其荧光强度随卤素相对原子质量的添加而减弱，磷光相应加强，这种效应称为重原子效应 第十一章第十一章 分子分子发光分析法光分析法一、一、 仪器与构造流程器与构造流程instrument and general instrument and general process process 二、二、 荧光分析法和运用光分析法和运用fluorescence analysis fluorescence analysis and applicationand application三、三、 磷光分析法的运用磷光分析法的运用phosphorescence analysis phosphorescence analysis and applicationand application第二节 分子荧光与磷光分析法molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis 一、仪器构造流程 丈量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角 根本流程如根本流程如图：：单色色器器：：选择激激发光光波波长的的第第一一单色色器器和和选择发射射光光( (丈丈量量) )波波长的的第第二二单色色器器；；荧光光计采采用用滤光光片，片，荧光分光光度光分光光度计采用光采用光栅；；光光源源：：滤光光片片荧光光计采采用用高高压高高压汞汞灯灯，，荧光光分分光光光光度度计采采用用高高压氙灯；氙灯；试样池池：：低低荧光光的的石石英英材材质做做成成的方形或的方形或长方形池体；方形池体；检测器：光器：光电倍增管 磷光磷光检测 荧光计上配上磷光丈量附件即可对磷光进展丈量在有荧光发射的同时丈量磷光P353 丈量方法：〔1〕通常借助于荧光和磷光寿命的差别〔磷光比荧光寿命长〕，采用磷光镜的安装将荧光隔开〔2〕采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术 室温丈量时，不需求杜瓦瓶 二、二、荧光分析方法与运用光分析方法与运用1. 1. 特点特点〔〔1 1〕灵敏度高〕灵敏度高 比比紫紫外外- -可可见分分光光光光度度法法高高2 2～～3 3个个数数量量级；；为什么？什么？当当荧光光物物质溶溶液液的的浓度度c c一一定定时，，对吸吸光光光光度度法法：：吸吸光光度度A=KcL=-lgI/I0,A=KcL=-lgI/I0,添添加加I0,II0,I也也添添加加，，I/I0I/I0根根本本不不变化化，，A A根根本本恒恒定定。
而而对于于荧光光分分析析：： If If = = 2.3 2.3 I0 I0 b b c c，，添添加加I0I0，，相相对荧光光强度度If If 会会大大幅幅度度添添加加所所以以荧光光分分析析法的灵敏度要比吸光光度法高法的灵敏度要比吸光光度法高2 2～～3 3个数量个数量级 检测下限：下限：0.10.1～～0.10.1g/cm-3g/cm-3 相相对灵灵敏敏度度：：0.05mol/L 0.05mol/L 奎奎宁宁硫硫酸酸氢盐的硫酸溶液的硫酸溶液〔〔2 2〕〕选择性性强 既既可可根根据据特特征征发射射光光谱，，又又可可根根据据特特征征吸收光吸收光谱；；〔〔3 3〕〕试样量少量少 缺陷：运用范缺陷：运用范围小 2.2.定量根据与方法定量根据与方法(1)定量根据定量根据 荧光光强度度 If正正比比于于吸吸收收的的光光量量Ia和和荧光光量量子子效效率率 ：： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- b c ) If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3bc ) 浓度很低度很低时，将括号，将括号项近似近似处置后：置后： If = 2.3 I0 b c = Kc 〔〔2 2〕定量方法〕定量方法规范曲范曲线法：法： 配配制制一一系系列列规范范浓度度试样测定定荧光光强度度，，绘制制规范范曲曲线，，再再在在一一样条条件件下下丈丈量量未未知知试样的的荧光光强度度，，在在规范范曲曲线上求出上求出浓度；度；比比较法：法： 在性性范范围内内，，测定定标样和和试样的的荧光光强度度，，比比较；； 3.3.荧光分析法的运用光分析法的运用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机与有机试剂配合物后丈量；可丈量配合物后丈量；可丈量约6060多种元素。
多种元素 铍、、铝、、硼硼、、镓、、硒硒、、镁、、稀稀土土常常采采用用荧光光分分析析法；法； 氟、硫、氟、硫、铁、、银、、钴、、镍采用采用荧光熄光熄灭法法测定；定； 铜、、铍、、铁、、钴、、锇及及过氧氧化化氢采采用用催催化化荧光光法法测定；定； 铬、、铌、、铀、碲采用低温、碲采用低温荧光法光法测定；定； 铈、、铕、、锑、、钒、、铀采用固体采用固体荧光法光法测定定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表表 三、磷光分析法的运用三、磷光分析法的运用1.1.稠稠环芳芳烃分析分析 采采取取固固体体外外表表室室温温磷磷光光分分析析法法快快速速灵灵敏敏测定定稠稠环芳芳烃和和杂环化化合合物物〔〔致致癌癌物物质〕〕；；见表表2.2.农药、生物碱、植物生、生物碱、植物生长激素的分析激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，烟碱、降烟碱、新烟碱，2 2，，4-D4-D等分析等分析 检测限限0.01 0.01 g/cm-3 g/cm-3 3.3.药物分析和物分析和临床分析床分析 见表表 第十一章 分子发光分析法一、根本原理一、根本原理principle principle 二、化学二、化学发光分析的特点光分析的特点characteristicscharacteristics三三 安装与技安装与技术instrument and technologyinstrument and technology第三节 化学发光分析法molecular luminescenceanalysischemiluminescenceanalysis 一、根本原理 principle1. 1. 化学化学发光反响光反响 在在化化学学反反响响过程程中中，，某某些些化化合合物物接接受受能能量量而而被被激激发，，从从激激发态前前往往基基态时，，发射出一定波射出一定波长的光。
的光 A +B = C + D* A +B = C + D* D* → D + h D* → D + h 〔〔1 1〕〕可可以以发光光的的化化合合物物大大多多为有有机机化化合合物物，，芳香族化合物；芳香族化合物；〔〔2 2〕〕化化学学发光光反反响响多多为氧氧化化复复原原反反响响，，激激发能与反响能相当能与反响能相当 E=170E=170～～300 300 kJ/molkJ/mol；；位位于于可可见光区；光区；〔〔3 3〕〕发光光继续时间较长，反响，反响继续进展；展； 化化学学发光光反反响响存存在在于于生生物物体体( (萤火火虫虫、、海海洋洋 发 光光 生生 物物 ) )中中 ，， 称称 生生 物物 发 光光(bioluminescence)(bioluminescence) 2. 2. 化学与生物化学与生物发发光分析的运用光分析的运用〔 〔1〕 〕 该发该发光反响速度慢，某些金属离子可催化反响；利用光反响速度慢，某些金属离子可催化反响；利用这这一一景象可景象可间间接接测测定定这这些金属离子。
可些金属离子可测测痕量的痕量的Cu2+ 、、Mn2+、、Co2+、、V4+、、Fe2+、、 Fe3+、、 Ni2+、、Ag+、、Au3+、、Hg2+等等〔 〔2〕 〕 可可检测检测低至低至 10-9 mol/L 的的H2O2；；〔 〔3〕 〕 间间接接测测定某些生物定某些生物试样试样 氨基酸氨基酸 + O2 酮酸酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 + H2O2 经过测定生成的定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量确定氨基酸、葡萄糖含量葡萄糖氧化酶 生物生物发光分析运用光分析运用 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反响 ：NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2NADH脱氢酶FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h黄素酶最大发射波长495 nm； 二、特点 characteristics1. 1. 灵敏度极高灵敏度极高 例例：：荧光光素素酶和和磷磷酸酸三三腺腺甙(ATP)(ATP)的的化化学学发光光分分析析，，可可测定定2 210-1710-17。
Mol/LMol/L的的ATPATP，，即即可可检测出出一个一个细菌中的菌中的ATPATP含量含量2. 2. 仪器器设备简单 不需求光源、不需求光源、单色器和背景校正；色器和背景校正；3. 3. 发射光射光强度丈量无干度丈量无干扰 无背景光、散射光等干无背景光、散射光等干扰；；4. 4. 线性范性范围宽5. 5. 分析速度快分析速度快缺缺陷陷：：可可供供发光光用用的的试剂少少；；发光光反反响响效效率率低低〔〔大大大低于生物体中的大低于生物体中的发光〕；机理研光〕；机理研讨少 。