精品课程项目三培养基的配制咸宁职业技术学院

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1、精品课程精品课程 项目三项目三 培养基的配制培养基的配制 咸宁职业技术学院咸宁职业技术学院培养基母液的配制培养基母液的配制培养器皿的清洗培养器皿的清洗54培养基的制作与灭菌培养基的制作与灭菌培养基的配制培养基的配制培养基的成分培养基的成分一一二二三三四四一、培养基的成分一、培养基的成分 植物激素植物激素 无机盐无机盐 有机物有机物 培养体支持材料培养体支持材料 辅助物质辅助物质 水水 分分 培培养养基基的的成成分分1、无、无 机机 盐盐元素名称元素名称添加形式添加形式大量元素大量元素 （0.5mmol/L ）NKNO3,NH4NO3 PKH2PO4 、NaH2PO4 K KCl 、KNO3Ca

2、CaCl2 2H2OMgMg2SO4 7H2O S Mg2SO4 7H2O微量元素微量元素（ 0.5mmol/L） Fe FeNa2-EDTA Zn Zn SO4 B H3BO3MnMnSO4 Cu CuSO4 MoNa2MoO4 2H2O Cl CaCl2 2H2O2、有、有 机机 物物v碳水化合物：碳水化合物：提供碳源和调节渗透压，主要是蔗糖。v维生素：维生素：以各种辅酶的形成参与多种代谢活动，对生长，分化等有很好的促进作用，常用的有 VB1和VB6。v天然复合物：天然复合物：促进某些愈伤组织和器官的生长，有椰子汁、香蕉泥、苹果汁等。v肌醇：肌醇：促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成，对组织

3、细胞繁殖、分化有促进作用。v氨基酸：氨基酸：是蛋白质的组成成分，为有机氮源，可直接被细胞吸收利用，培养基中常用的是甘氨酸。3、植物激素、植物激素 （1 1）生长素类）生长素类 种类：种类：NAA(萘乙酸萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)、IBA(吲吲 哚丁酸哚丁酸)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸) 作用：作用：促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。导形成愈伤组织，促进生根。 浓度：浓度：0.050.055mg/L5mg/L3、植物激素、植物激素 （2 2）赤霉素（）赤霉素（GAsGAs） 种类：种类：GA3 作用：作用：主要用于

4、诱导离体芽的萌发和伸长。 注意：注意：不耐热。不耐热。 3、植物激素、植物激素 （3 3）细胞分裂素（）细胞分裂素（CTKCTK） 种类：种类： KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、 ZT(玉米素)、2ip(异戊烯氨基嘌呤) 作用：作用：促进细胞分裂，诱导芽的形成和丛 芽产生. 浓度：浓度：0.0510.0mg/L3、植物激素、植物激素v（4 4）脱落酸（）脱落酸（ABAABA）：）：其作用与赤霉素相反,能促进芽和种子进入休眠状态,促进短日照的植物提前开花.v（5 5）乙烯：）乙烯：v乙烯对组织培养物的影响：乙烯对组织培养物的影响：v 组培中植物组织会释放少量乙烯，对培养物的生长、胚的

5、发生和芽的分化有抑制作用.v克服方法：克服方法：1.降低培养基中蔗糖的浓度或用葡萄糖、麦芽糖代替蔗糖；2.在培养基中加入5-15mg/L的硝酸银也能控制乙烯的形成。4、培养体支持材料、培养体支持材料 琼脂琼脂 用量：用量：610g/L 种类：种类：琼脂粉琼脂粉 琼脂条琼脂条 作用：作用：固化作用固化作用 其它其它 玻璃纤维、滤纸桥、海绵等。玻璃纤维、滤纸桥、海绵等。5、辅助性物质、辅助性物质抗生素：抗生素：防止外植体内生菌造成的污染。抗氧化物：抗氧化物：防止氧化。活性炭：活性炭：吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质；抑制外植体褐变；防止玻璃苗的产生；促进培养物生长和分化；促进生根。 培培 养养

6、 基基 类类 型型 完全培养基完全培养基 初代培养基初代培养基 继代培养基继代培养基 固体培养基固体培养基 液体培养基液体培养基 基本培养基基本培养基 诱导培养基诱导培养基 增殖和生根培养基增殖和生根培养基按营养水平按培养阶段按培养进程按态相基本培养基种类基本培养基种类基本基本培养基培养基SH培养基培养基N6培养基培养基MS培养基培养基Miller培养基培养基B5培养基培养基White培养基培养基MS培养基培养基v无机盐浓度高无机盐浓度高v高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐v含有一定数量的铵盐含有一定数量的铵盐v营养丰富营养丰富v不需要添加更多的有机附加物不需要添加更多的

7、有机附加物Miller培养基培养基v无机元素用量是无机元素用量是MS的的1/31/2 v微量种类少微量种类少 v无肌醇无肌醇White培养基培养基v无机盐浓度较低无机盐浓度较低v使用广泛使用广泛v在生根培养、胚胎培养中有良好的效果在生根培养、胚胎培养中有良好的效果B5培养基培养基v含较低的铵，硝酸盐和盐酸硫胺素用量较含较低的铵，硝酸盐和盐酸硫胺素用量较高。高。 v适合双子叶植物，适合双子叶植物， 尤其木本植物组培。尤其木本植物组培。SH培养基培养基v特点与特点与B5相似，硫酸铵改用磷酸二氢铵。相似，硫酸铵改用磷酸二氢铵。 v无机盐浓度较高无机盐浓度较高N6培养基培养基v成分简单成分简单 v硝酸

8、钾和硫酸铵含量高硝酸钾和硫酸铵含量高 v适合花粉、花药培养适合花粉、花药培养 二、培养器皿的清洗二、培养器皿的清洗v1、洗涤场所及用具：、洗涤场所及用具：v场所：场所：洗涤室洗涤室 v用品：用品：水池、塑料盆、塑料桶、下水用过滤网，水池、塑料盆、塑料桶、下水用过滤网，各种规格刷子。各种规格刷子。v2、洗涤液：、洗涤液： v 洗衣粉洗衣粉 洗洁精洗洁精 高锰酸钾高锰酸钾 稀盐酸稀盐酸 v 重铬酸钾重铬酸钾+浓硫酸混合液浓硫酸混合液v3、洗涤标准：、洗涤标准： 透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。4、清洗方法、清洗方法洗洁精洗洁精洗涤洗涤清清 水水冲冲 洗洗4-

9、5次次晾干晾干/烘烘干备用干备用已用过的已用过的培养器皿培养器皿新购置新购置 培养器皿培养器皿1%稀HCl浸浸泡泡12h污染瓶污染瓶高高 压压 灭灭 菌菌确定培养基确定培养基称量称量计算计算溶解溶解分装分装定容定容贴标签贴标签保存保存（一）母液备制流程：（一）母液备制流程：准准备备工工作作三、培养基母液配制三、培养基母液配制（二）母液配制方法（二）母液配制方法v1、营养成分的配制、营养成分的配制v 根据药品性质将母液配制成以下四类：根据药品性质将母液配制成以下四类：v（1）大量元素）大量元素v 可以混在一起配制成可以混在一起配制成1020倍液，倍液，注意离子注意离子之间沉淀，如之间沉淀，如Ca

10、Ca2+2+和和S0S04 42-2-，CaCa2+2+、MgMg2+2+和和POPO4 43-3-一起一起溶解后，会产生沉淀，一定要溶解后，会产生沉淀，一定要分别单独配制分别单独配制充分充分溶解再放入母液中。溶解再放入母液中。1、营养成分的配制、营养成分的配制v（2）微量元素）微量元素v可配成可配成100200倍混合母液。倍混合母液。v（3）铁盐）铁盐v硫酸亚铁和硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀，需单独配制，配成钠盐易沉淀，需单独配制，配成100200倍鳌合剂不易沉淀。倍鳌合剂不易沉淀。v（4）有机化合物）有机化合物v维生素、肌醇、氨基酸等一起配成维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或或200倍

11、液，倍液，也可分别配制。也可分别配制。2、植物生长调节物质的配制、植物生长调节物质的配制u植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱，浓度一植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱，浓度一般为般为0.51mg/ml。uIAAIAA、IBAIBA、GAGA等先溶于少量的等先溶于少量的9595的酒精中，再加的酒精中，再加水定容。水定容。uNAANAA可先溶于热水或少量可先溶于热水或少量9595的酒精中，再加水定容。的酒精中，再加水定容。u2 2，4-D4-D可用少量可用少量0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH溶解后，再加水定溶解后，再加水定容。容。2、植物生长调节物质的配制、植物生长调节物质

12、的配制uKTKT和和BABA先溶于少量先溶于少量0.1mol/L0.1mol/L的的HCIHCI中再加水定容。中再加水定容。u玉米素先溶于少量玉米素先溶于少量9595的酒精中，再加热水到一的酒精中，再加热水到一定浓度。定浓度。3、药品用量的计算、药品用量的计算v配制母液时药品用量配制母液时药品用量(mg)=配方用量配方用量(mg)浓缩倍浓缩倍数数制备容量（制备容量（L） （三）配制时注意事项（三）配制时注意事项1、配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。、配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。2、药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。、药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。3、将配制好的母液分别贴好标签，存放在

13、低温、将配制好的母液分别贴好标签，存放在低温冰箱内备用，用时再按比例稀释。冰箱内备用，用时再按比例稀释。培养基母液的配制培养基母液的配制化化 合合 物物名名 称称原配方量原配方量mg扩大扩大 倍数倍数称取量称取量mg母液体积母液体积(ml)配制配制1升培养基应升培养基应移取量移取量(ml)母液母液名称名称43165010165001000100大量元大量元素母液素母液319001019000CaCl2H2O44010 4400MgSO4 7H2O370103700KH2PO417010 1700MnSO4H2O22.31002230100010微量元微量元素母液素母液ZnSO47H2O8.61

14、00860CoCl6H2O0.0251002.5CuSO45H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MO42H2O0.25100 25KI0.83100 83FeSO47H2O28.71002870100010铁盐铁盐母液母液Na2-EDTA37.31003730烟酸烟酸(Vpp)0.5502550010有机物有机物母液母液盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.55025盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.1505肌醇肌醇100505000甘氨酸甘氨酸250100量取母液量取母液 培养基熬制培养基熬制 灭菌灭菌称取蔗糖、琼脂称取蔗糖、琼脂 封封 口口 分分 装装 定定 容容接接 种种确定配方确定配方四

15、、培养基制作与灭菌四、培养基制作与灭菌调调PH值值 流流 程程（一）培养基制作流程（一）培养基制作流程v1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出，混合。母液取用量的计算。将母液取出，混合。母液取用量的计算。v 制备培养基时母液取用量（制备培养基时母液取用量（ml）=1000浓缩倍浓缩倍数数制备培养基数量（制备培养基数量（L）v2、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制培养基数量，约终体积的培养基数量，约终体积的2/3-3/4，接通电源加热。，接通电源加热。v3、向加热容器中加入称量好的琼脂。搅拌

16、加热，、向加热容器中加入称量好的琼脂。搅拌加热，至完全溶化。至完全溶化。（一）培养基制作流程（一）培养基制作流程v4、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖，加入加热容、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖，加入加热容器中至溶解。器中至溶解。v5、将母液混合液加入到加热容器中，搅拌混匀。、将母液混合液加入到加热容器中，搅拌混匀。v6、蒸馏水定容至所需体积。、蒸馏水定容至所需体积。v7、测试培养基溶液的、测试培养基溶液的PH值，过高滴加值，过高滴加0.1mol/L的的HCL调整，过低滴加调整，过低滴加0.1mol/L的的NaOH调整，调整，调成调成pH值值5.8左右。左右。 v8、迅速分装到培养瓶中，封口灭菌备用

17、、迅速分装到培养瓶中，封口灭菌备用。（二）培养基灭菌（二）培养基灭菌u培养基分装封口后立刻培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在进行灭菌，至少在24h内内完成灭菌程序。完成灭菌程序。u一般采用的是高压湿热一般采用的是高压湿热灭菌，要求压力灭菌，要求压力0.105MPa（温度（温度121）时）时,保持保持15-20分分钟。钟。u某些激素、维生素采用某些激素、维生素采用过滤灭菌。过滤灭菌。（三）培养基的保存（三）培养基的保存防尘：防治灰尘污染。防尘：防治灰尘污染。避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。恒温：恒温：4 可保存可保存36周，室温下两周内周，室温下两周内用完。用完。定期更新：不易长期保存。定期更新：不易长期保存。