二章基因工程及其在食品科学中的应用

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1、第二章第二章 基因工程及其在食品科学中的应用基因工程及其在食品科学中的应用uu基因工程基础基因工程基础基因工程基础基因工程基础uu基因工程研究方法基因工程研究方法基因工程研究方法基因工程研究方法uu基因工程在食品科学中的应用基因工程在食品科学中的应用基因工程在食品科学中的应用基因工程在食品科学中的应用钻藐弊拌滚帜妨豫挝莫文集柒硕拒戌翌从肤稠激吧频擂环如鸟嘿目噶雨口二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用第一节第一节 基因工程基础基因工程基础一、基因工程的定义、意义及研究内容一、基因工程的定义、意义及研究内容一、基因工程的定义、意义及研究内容一、基因工程的定义、意义及

2、研究内容 （一）基因工程的定义（一）基因工程的定义（一）基因工程的定义（一）基因工程的定义 gene engineeringgene engineering genetic engineeringgenetic engineering recombinant DNA technique recombinant DNA technique Molecular cloningMolecular cloning（二）基因工程的意义（二）基因工程的意义（二）基因工程的意义（二）基因工程的意义 基因工程基因工程基因工程基因工程是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特是现代生物工程的主体核心技术。基

3、因工程的最大特是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特点是可打破生物点是可打破生物点是可打破生物点是可打破生物种属界限种属界限种属界限种属界限，进行生物种，进行生物种，进行生物种，进行生物种( (属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界) )内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。 遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管

4、病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症症、骨质疏松症症、骨质疏松症症、骨质疏松症吵拿姑殷库绣爵抢护宅抱哈葡彬淑砸汕侥摔励夸卷惨黑汪柴押牵忠湘烬杠二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用（三）基因工程的研究内容（三）基因工程的研究内容（三）基因工程的研究内容（三）基因工程的研究内容 制备目的基因制备目的基因构建重组构建重组DNA 获得转化体获得转化体 筛选出重组转化体阳性克隆筛选出重组转化体阳性克隆 筛目的基因在受体生物筛目的基因在受体生物细胞中高效表达隆细胞中高效表达隆 虾躇拼筛散徒躺榨谷搓抬四

5、丫腊惯乔匿标辆灿闺割呕佳晴闽疑浙卿捶贤胞二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用言痞瓦惜谤界允歌捕穿呜衅罪唐倔鲁忿名欣惹峨嘻券官腐片丈贩童拆制态二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶 基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的关关关关键键键键技技技技术术术术之之之之一一一一就就就就是是是是先先先先将将将将目目目目的的的的基基基基因因因因DNADNA从从从从供供供供体体体体生生生生物物物物体体体体中中中中分分分分离离离离出出出出来来来来，再再再再与与与与合合合合

6、适适适适载载载载体体体体DNADNA连连连连接接接接重重重重组组组组等等等等，这这这这些些些些分分分分子子子子操操操操作作作作涉涉涉涉及多种不同的及多种不同的及多种不同的及多种不同的酶酶酶酶。主要包括：。主要包括：。主要包括：。主要包括： 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 DNA DNA甲基化酶、甲基化酶、甲基化酶、甲基化酶、 DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 依赖于依赖于依赖于依赖于DNADNA的的的的RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 连接酶连接酶连接酶连接酶 激酶激酶激酶激酶 磷酸酶磷酸酶磷酸酶磷酸酶 核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 谰淆刊萨矩碰疡言磅窍

7、夺僻峡蜂奉烷瞎赖每瓷嫡坪樱义又刽有湘五抚拄陀二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与DNADNA甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶1 1、定义、定义、定义、定义 restriction endonuclease restriction endonuclease：指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶 DNA methylase DNA methylase ：是指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶 2 2、限制

8、性酶（甲基化酶）的命名和分类、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类(1) (1) 限制酶限制酶限制酶限制酶( (甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶) )的命名的命名的命名的命名 其命名主要是参照其命名主要是参照HOSmith和和D. Nathans提出的待命名提出的待命名酶的供体微生物的属名酶的供体微生物的属名与与种名种名相结合的原则进行的，具体如下：相结合的原则进行的，具体如下： 验簇纶侧席沮椿疯绿眼邱一逻妈触赂校连院还恼存当任攀妊鲍铸燥搓都棋二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 以属名的第一个字母

9、(大写)和种名的最前两个字母(小写)组成的三字母符号为其基本形式 如：如：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶用Eco表示；来源于流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的用Hin表示 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母 如：如：来自Haemophilus parainfluenzae (副流感嗜血杆菌)的用Hpa表示，而来自同一属的Haemophilus parahaemolyticus (副溶血嗜血杆菌)的则用Hph表示。双烯姚页纷储苇到

10、阐羔龙搞乘抚断车澳保恳上乔教左归添统瞅荤渊扒殃贬二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 当微生物具有特殊名称时，则将代表该特殊名称的符号置于上述三字母符号之后 如：如：如：如：来自Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae的Rd株的用Hind表示；来自Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae的Rf型的用Hinf表示。 当不止一种限制酶(甲基化酶)分离纯化自同一微生物株系时，则依其被分离的先后顺序以罗马数字(大写)置于上述命名符号之后 如：如：如：如：来自Haemophil

11、us aegytiusHaemophilus aegytius的三种酶分别用Hae I、Hae和Hae表示；来自Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae的Rd株的三种酶分别用Hind I、Hind和Hind表示。悯澳倡砸藉矗孺坍杆玖熙诞辰醇亩熟枯砖责素映衣胃当掘放泪兆悟魂棕豹二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 为了区别起见，在上述命名名称之前加R表示限制酶类限制酶类限制酶类限制酶类；在上述命名名称之前加M表示甲基化酶类基化酶类基化酶类基化酶类 如：如：如：如：来自Haemophilus influenzaeHae

12、mophilus influenzae的Rd株的第三种限制性内切核酸酶为R. Hind，其相应的DNA甲基化酶则为M. Hind。大鼠生长激素基因大鼠生长激素基因转入小鼠转入小鼠步庶污鼓侮琳遍匡耳攒焙酷唐鸡契群疯惶券犁伸溶姑掐檬去膛搽喳郝急序二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用(2) 限制酶的分类限制酶的分类 根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型: I型型: 三种三种不同亚基组成；辅助因子为不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及及S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸 其切割位点距其识别位点至少1000bp；且切割作用是切割作用是随

13、机的随机的 型型: 两个两个相同亚基组成；辅助因子仅为相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；其识别位点常具；其识别位点常具旋转旋转 对称性对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近附近；且切割作；且切割作 用用特异性强特异性强 型型: 两种两种不同亚基组成；辅助因子为不同亚基组成；辅助因子为ATP和和Mg2+，也受，也受S-腺苷甲硫腺苷甲硫 氨酸激活氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点3端端 2426bp处处 繁亢闽梗疟锥淑谅芽片徽脐滔戚鹰镣卒搂缀淖缸囊李弹孽凝肉欺荣讫举滴二章基因工程及其在食品科学中的应

14、用二章基因工程及其在食品科学中的应用PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5 限制性内切酶的旋转对称性限制性内切酶的旋转对称性 需要指出的是需要指出的是，I型和型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性内切核酸酶及其相应的DNA甲基化酶对DNA有相同的识别序列。脱辊荒局旋糟饱矿酒逮盘医凤屡逃岗拢硝欠耶批钝像普羔生铆蘸声烫札液二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 (3)型限制性内切核酸

15、酶的基本特性型限制性内切核酸酶的基本特性 识别序列与切割位点识别序列与切割位点 型限制性内切核酸酶可识别长度为型限制性内切核酸酶可识别长度为47bp的双链的双链DNA特定序特定序列，该识别序列列，该识别序列(识别位点识别位点)常呈常呈旋转对称性旋转对称性 切割方式切割方式 平齐末端平齐末端 、5磷酸端磷酸端25个核苷酸突出单链黏性末端个核苷酸突出单链黏性末端 、3-羟基端羟基端25个核苷酸突出单链黏性末端个核苷酸突出单链黏性末端 谓孩何棘琵仑桓睦乎叮院悼承很牌乖初椅仍诲啃老事啄聊贰酗鞠而甄惯钱二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 5 33 5 5 33 55突出

16、突出3突出突出 平端平端5 33 5型限制性内切核酸酶切割方式型限制性内切核酸酶切割方式赎单缠拐前忽昼磊叫巫乱弯凳遣避戒觉版泻妙光染拿苛产溢扎援比在茎柠二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 同裂酶与同尾酶同裂酶与同尾酶isoschizomer ：在型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者 如：如：Hpa和Msp I两者的识别序列都是CCGG，切割方式也相同，因此二者为同裂酶 isocaudamer ：来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能形成相同黏性末端者 如：如：BamH I、Bcl I、Bgl、Mbo I、Sau3A I及Xho切割DNA

17、后都形成相同的GATC四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶 需要指出的是需要指出的是，由同尾酶同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。析门郡弯壬善逸叔鸟府傅凸琶监仍缅院丸屹芭赏滥符梢捍鼓率沼范癣苔处二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 限制性片段长度与切割频率限制性片段长度与切割频率限制性片段长度与切割频率限制性片段长度与切割频率 经限制性内切核酸酶切割后产生的DNA片段称为限制性片段限制性片段限制性片段限制性片段(restriction fragment)。一般不同限制酶切割DNA后所形成

18、的限制性片段长度不一 假设在某DNA分子中，A或T出现的频率为X，G或C出现的频率为Y，那么某限制酶在该DNA分子上的切割位点出现频率(切割频率或位点频率) F可用下式表示： F=XnYm 式中：n该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数目；m该限制酶识别序列中双链G=C碱基对的数目 睁秘郁喻翌面辛仓完狼棘煌酱芹锡守玖良盲赡浇跑粘田痘基殊皖伞衡几厄二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 如果构成某DNA分子的碱基对总数目(B)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知，那么该限制酶在该DNA分子上的理论切割位点数目(N)为： N=BF 假定在某DNA分子中四种核苷酸残基数

19、量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)4，即1256，也即平均256个碱基对出现1个切割位点。 同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)6，即14096，也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。 需要指出的是：需要指出的是：实际情况与理论不相符鄂就蚤斥盯场禽怒面峦体锗熔饰哮钵颠氓迅张纷宪儒过卢钢镶度肘一簇缘二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用 (4) 影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略 底物底物DNA制备物的纯度制备物的纯度：蛋

20、白质、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。 底物底物DNA的甲基化程度：的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。 底物底物DNA的结构构型：的结构构型：环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的DNA时，环状双螺旋DNA所需酶量为线性DNA的1020倍。 酶反应缓冲液的组成：酶反应缓冲液的组成： 酶反应的最适温度：酶反应的最适温度： 闸银段欢笑滑战豺苦稗滔菏忙钞枯毁首速医旋妖捂昆棉伞邮枪盟蜕联蜡寻二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用为了

21、提高限制酶对底物为了提高限制酶对底物DNA低纯度制备物的反应效率，一般低纯度制备物的反应效率，一般采用如下方法采用如下方法：a 增加限制酶的用量(平均每g底物DNA可用10IU甚至更多些)；b 延长酶催化反应的保温时间，使酶解更完全；c 扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被稀释，以减弱其抑制作用；d 在反应液中加入适量亚精胺(一般应用浓度为12.5mmolL)，以利限制酶对基因组DNA的酶解作用。相旅忍皑遥墟陀八巧呐物捌撤疑愉青地昼乾卑组窃凌坛傈劈商砾丧荒茸腑二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用(5) 限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点限制性内切核

22、酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点 (二二) DNA聚合酶聚合酶 最常用的依赖于最常用的依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶有有大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I(全全酶酶)、大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段(Klenow片段片段)、T4噬菌体编码噬菌体编码的的DNA聚合酶聚合酶、耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶(TaqDNA聚合酶聚合酶)等等 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶，即聚合酶，即逆转录酶逆转录酶，优先以，优先以RNA为模板为模板，也可以也可以DNA为模板，因此该聚合酶能以为模板，因此该聚合酶能以RNA为模板催化合成双链为模板催化合成双链DNA 怜钳呛宜柯岿和挚胚磅汾编

23、丁吃艳魄人醇墩拳川腔参吮锄淫平诛戴自肪如二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用1 1、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I( I(全酶全酶全酶全酶) ) 来源：来源：来源：来源：大肠杆菌； 分子量：分子量：分子量：分子量：109103的多肽链 （1 1）作用）作用）作用）作用 具有53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物； 53外切核酸酶活性，从5端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链(RNA酶H活性)； 35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA。（

24、2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 以切刻平移法(nick translation)标记DNA。在所有聚合酶中，只有该酶能用于此反应，因为只有其具有53外切核酸酶活性。 对DNA分子的3突出尾进行末端标记。宵届具饵搀汐辩肉槛卖馅呀墓斗疲猪嘛锚掉腥象俞硼忻蓟焊义詹担极螟溃二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用DNA 聚合酶聚合酶颅聘指珍茹渣佯巷湿反悸鸿赂高婚凌耻梦屈庶葛亩牡栗康夫赶犀异香被琉二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用2 2、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I大片段大片

25、段大片段大片段(Klenow(Klenow片段片段片段片段) ) 来源：来源：来源：来源：由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得，也可通过克隆技术获得。 分子量：分子量：分子量：分子量：76103的多肽链（1 1）作用）作用）作用）作用 53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物； 35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 补平限制酶切割双链DNA所产生的3凹端； 如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端，那么可对DNA分子进行末端标记； 对DNA分子的3突出尾进行末端标记；

26、 在cDNA克隆中，合成cDNA第二链； 应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序。 喳沙盒派搐橱桶无蚂约毋宙咏脂氢振买沃汾错皖殿桑蔓狠梳矮旱蚌贱派讶二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用Klenow 酶的作用方式酶的作用方式 函哟炯灌链巴窑垢丫沪亲咆衙汝幅征擂至匠浓盅愧每猴朴毅酌横燃魁颂眯二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用3 3、T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 来源：来源：来源：来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：分子量：分子量：分子量：114103（1 1）作用）作用）作用）作

27、用 53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物； 35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA；（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 补平限制酶切割双链DNA产生的3凹端； 如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端，那么可对DNA分子进行末端标记； 对DNA分子的3突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类末端标记的首选酶； 将双链DNA的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链DNA时，经常利用这一特性。捶硫来吗霜霹飘打摇淫狈崖扔苹化痪奏膛曝匹缝昨平黍兴匆契框咯厚杀朴二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在

28、食品科学中的应用4、TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 来源：来源：来源：来源：水生栖热菌(Thermus aquaticusThermus aquaticus)，现可由基因工程途径来生产 分子量：分子量：分子量：分子量：65103，是一种非常耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。（1 1）作用）作用）作用）作用 具有53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 对DNA进行测序； 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)对DNA分子的特定序列进行体外扩增。卸竹冷还

29、另畏锅辖逾蔑茬惟金滋姐馈顾忱诫俩娥崇诞忍机柱隋莽抿抛天真二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用5 5、逆转录酶、逆转录酶、逆转录酶、逆转录酶( (依赖于依赖于依赖于依赖于RNARNA的的的的DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶) ) 来源：来源：来源：来源：一种来自禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，分子量为170103； 一种来自能表达克隆化的表达克隆化的表达克隆化的表达克隆化的MoloneyMoloney鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒(Mo-MLV)逆逆逆逆 转录酶基因的大肠杆菌转录酶基因的大肠杆菌转录

30、酶基因的大肠杆菌转录酶基因的大肠杆菌，分子量为84103。（1 1）作用）作用）作用）作用（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途6 6、末端脱氧核苷酸转移酶、末端脱氧核苷酸转移酶、末端脱氧核苷酸转移酶、末端脱氧核苷酸转移酶( (末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶) ) 来源：来源：来源：来源：小牛胸腺小牛胸腺小牛胸腺小牛胸腺 分子量：分子量：分子量：分子量：6010360103 （1 1）作用）作用）作用）作用（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途黎诅烟蜘号蚀漱植敢放吞佳症椅厚韭岳久碉阮最私不课岳静扔谤峦酗韧衅二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科

31、学中的应用( (三三三三) ) 依赖于依赖于依赖于依赖于DNADNA的的的的RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶1 1、SP6SP6噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 来源：来源：来源：来源：SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌LT2株。（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即53 RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性启动子，并且以此双链DNA为模板合成RNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 合成单链RNA，制备杂交探针； 合成单链RNA作为体外翻译系统中的功能性mRNA或体外剪接反应的底物。熬焕韶迸悦狂稀箩让气牟湍

32、角赃瓣感不绘爪丫畸焊诞端爱阜贼宇器椎誓凯二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用2 2、T7T7或或或或T3T3噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 来源：来源：来源：来源：T7或T3噬菌体感染的大肠杆菌。（1 1）作用）作用）作用）作用该类酶主要具有一种活性，即53 RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性的启动子，并以此双链DNA为模板合成RNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 合成单链RNA，制备杂交探针； 合成单链RNA作为体外翻译系统中的功能性mRNA或体外剪接反应的底物； 利用带有T7噬菌体启动子

33、的载体在大肠杆菌和酵母中表达克隆化基因。掉邢体嗽殴稍韵共和黍泣劝客锭操肾钱锤竭突吝梯沽渊遂撞绦瓢晦捶欺明二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用( (四四四四) ) 连接酶、激酶及磷酸酶连接酶、激酶及磷酸酶连接酶、激酶及磷酸酶连接酶、激酶及磷酸酶 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶(DNA ligase)：是指将两段DNA拼接起来的酶类。在基因工程中，最常见的DNA连接酶为T4噬菌体DNA连接酶。 RNARNA连接酶连接酶连接酶连接酶(RNAligase)：能使含5磷酸基端及3羟基端的单链RNA(或DNA)共价连接起来。该酶主要用于对RNA进行3 末端标记，即将3

34、2P标记的3，5二磷酸单核苷(pNp)加到RNA的3羟基端。孺珠魁邑湍瘤蝴豫譬抗伤法蛆轴葡皖冯毙凯题张吕侈钥挺颂沟话膨肥氨狈二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用1 1、T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 来源：来源：来源：来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：分子量：分子量：分子量：68103（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即催化DNA的5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端DNA、平齐末端DNA、带切刻的DNA等。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 连接带匹配黏性末

35、端的DNA分子。 使平齐末端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。这类反应要比黏性末端连接慢得多。 寿掏匀嗜库挤嘴傍陛窒泄躯抿忠展碎径宋帐烤拦秤驭丰夜烂赣琅扮抓颅矛二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用2 2、T4T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶 来源：来源：来源：来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌（1 1）作用）作用）作用）作用 具有激酶磷酸化活性，催化ATP的广磷酸基转移至DNA或RNA的5末端； 具有3磷酸酶活性，该酶的核酸底物为双链DNA、单链RNA或DNA、DNA切刻或缺口、寡核苷酸等。（2 2）主要用途）主

36、要用途）主要用途）主要用途 标记DNA的5端，以供Maxam-Gilbert法测序、S1核酸酶分析以及其他必须使用末端标记DNA操作之需； 对准备用于连接但缺乏5磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化。 坝予兑字馆痴乏采撕梳揖祁屑貌铝一销琶啡帕红醋硫根擞静秒横爪烛膘吊二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用3 3、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶 来源：来源：来源：来源：大肠杆菌及牛小肠（1 1）作用）作用）作用）作用 这两种来源的碱性磷酸酶，即细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶(bacteri alalkaline phosphata

37、se，BAP)和牛小肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)均具磷酸酶活性，催化去除5磷酸的反应。该酶的底物为单链或双链DNA及RNA、rNTP和dNTP。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 在用32P 标记5末端前，去除DNA或RNA分子的5磷酸； 去除DNA片段5磷酸，以防自身环化。享隙赔汉途捆伏盔秤明总旋损楷罗惶实宪除俐哗涟砍谩耍涎嫉袁半裴辑些二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用（五）核酸酶（五）核酸酶（五）核酸酶（五）核酸酶 1 1、BAL31BAL31核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 来源：

38、来源：来源：来源：埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejianaAlteromonas espejiana)BAL31。（1 1）作用）作用）作用）作用（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 2 2、S1S1核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 来源：来源：来源：来源：米曲霉(Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae) （1 1）作用）作用）作用）作用（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途谤魁风血聪甚篙认久潦谊妒监山铃睡宦妒行养丰宽恰用伐靳嗣阜销市丛善二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用3 3、核糖核酸酶、核糖

39、核酸酶、核糖核酸酶、核糖核酸酶A(RNAA(RNA酶酶酶酶A)A) 来源：来源：来源：来源：牛胰脏（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶活性，特异地作用于RNA分子上嘧啶残基(C和U)的3端，切割其与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。在低盐浓度下，其可切割单链、双链RNA及DNA-RNA杂交体中的RNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 从DNA-RNA杂交体和RNA-RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。 确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。RNA-DNA杂交体或RNA-RNA杂交体中的单碱基错配可被该酶识别并切割 型闰茂损乓翰坷医瞎辞挎脉调蜀芽熊

40、炳撰浚樱疚腊搐烟趁舔练皑颁椭娘暗二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用4 4、核糖核酸酶、核糖核酸酶、核糖核酸酶、核糖核酸酶H(RNAH(RNA酶酶酶酶H) H) 来源：来源：来源：来源：大肠杆菌（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶活性内切核糖核酸酶活性内切核糖核酸酶活性内切核糖核酸酶活性，特异地水解DNA-RNA杂交体中RNA的磷酸二酯键，但不降解单链或双链的DNA或RNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 特异地降解cDNA第一链合成时产生的RNA-DNA双链中的mRNA分子，以利双链cDNA的合成； 通过合

41、成DNA及与RNA形成局部的RNA-DNA杂交体，诱发该酶催化特异性的RNA降解。疼蹬芥澡卡宾骄歇膊翁腮鸽昨脆唤叛貌廖犹德蔓昧珐吴咱木秤汝缆咳煞篓二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用5 5、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶I(DNAI(DNA酶酶酶酶1) 1) 来源：来源：来源：来源：牛胰脏（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即内切核酸酶活性内切核酸酶活性内切核酸酶活性内切核酸酶活性，优先从嘧啶核苷酸处水解双链DNA或单链DNA。在Mg2+存在下，该酶可独立作用于双链DNA的每一条链，且切割位点呈随机分布；在Mn2+存在下，该酶可在双链DNA两条链的大致相同位置切割，产生平齐末端DNA片段或只带12个核苷酸单链突出的DNA片段。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 在以切刻平移法进行DNA标记时，可用该酶在双链DNA上产生随机切刻； 建立随机克隆，以便利用M13噬菌体载体进行测序； 分析蛋白质-DNA复合物(DNA酶足迹法)。埔廉揖岗财拜埋泅度梧写六沁灿层偷那线授沿栗横披颊挝捍藐毫澄瞥横怕二章基因工程及其在食品科学中的应用二章基因工程及其在食品科学中的应用