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1、第七章 亲和纯化1分离工程第七章PPT课件w生物亲和作用生物亲和作用生物物质，特别是酶与抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力；这种识别并结合的能力具特异性，即能够区分结构和性质非常相近的不同分子，选择性地与其中一种分子结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用。通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。2分离工程第七章PPT课件w亲和纯化技术亲和纯化技术定义：利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术。应用：通常与其他分离纯
2、化技术相结合，如亲和层析技术、亲和膜分离技术等。3分离工程第七章PPT课件第一节 基本原理4分离工程第七章PPT课件一、亲和作用的本质w参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。5分离工程第七章PPT课件w蛋白质参与亲和作用的机理蛋白质参与亲和作用的机理一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点，呈凹陷或凸起结构。同时，具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是亲和作用特异性高的主要原因。6分离工程第七章PPT课件二、亲和作用体系w生物物质中常见的
3、亲和作用体系有：生物物质中常见的亲和作用体系有：w酶与其底物；含有糖基的酶或蛋白质分子通过糖基与植物凝集素结合；酶或蛋白质作为抗原与其抗体结合等。7分离工程第七章PPT课件8分离工程第七章PPT课件w外源凝集素是一种天然蛋白质，大多数可由植物中制取，外源凝集素具有类似抗体的活性，并于一些糖的残基或链段。有高度的亲和力，广泛用于糖蛋白，糖多肽，多糖化合物以及糖脂的检测，分析 和纯化。 w在亲合层析分离中，它们与层析剂结合，可用来分离整个细胞、细胞表面受体蛋白、细胞膜片段及各种含糖配基的生物大分子物质。9分离工程第七章PPT课件w亲和作用体系的特异性亲和作用体系的特异性高度特异性体系：一对一关系，
4、如抗原与其单克隆抗体的结合。群特异性体系：大多数亲和体系，如外源凝集素可与任何含有糖基的蛋白质结合。10分离工程第七章PPT课件三、亲和纯化原理w将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子（目标物质）容易从混合物中得到选择性分离纯化。11分离工程第七章PPT课件w亲和配基：亲和配基：亲和作用分子对中被固定的分子。w结合常数结合常数 EL = EL 其中：E、L和EL分别表示目标物质、配基和二者形成的复合体。 Keq一般为104108dm3/mol，太大洗脱回收困难，太小则难于有效吸附目标物质。12分离工程第七章PPT课件第二节
5、亲和层析13分离工程第七章PPT课件一、原理与操作w原理原理利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。14分离工程第七章PPT课件w操作操作包括进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。洗脱方法有特异性洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过竞争性结合作用，脱附目标产物。相当于顶替展开特点：条件温和，有利于保护目标产物的活性和提高纯度。15分离工程第七章PPT课件非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和作用，使之脱附。是较多采用的洗脱方法。要求操作对目标产物活性无影响。
6、16分离工程第七章PPT课件二、亲和吸附介质w一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基修饰固体粒子，制备所需的亲和吸附介质。该固体粒子通常称为配基的载体。w亲和配基：亲和配基：可选择的有酶的抑制剂、抗体、A蛋白、凝集素、辅酶和磷酸腺苷、三嗪类色素、过滤金属离子、组氨酸和肝素等。17分离工程第七章PPT课件w对载体的要求对载体的要求具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；粒径均一的球形粒子。18分离工程第七章PPT课件亲和吸附载体的种类种种种种 类类类类组组组组 成成成成性性性性 能能能能多
7、孔玻璃载体多孔玻璃载体硅酸盐硅酸盐坚硬、耐酸碱、易修饰坚硬、耐酸碱、易修饰聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶载体凝胶载体丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺亲水性好亲水性好可供活化基团多可供活化基团多纤维素载体纤维素载体多糖类物质多糖类物质来源丰富，但非特异性吸附来源丰富，但非特异性吸附及空间位阻强，对分离不利及空间位阻强，对分离不利葡聚糖凝胶载体葡聚糖凝胶载体经环氧丙烷交联的多糖类经环氧丙烷交联的多糖类理化性质稳定，但粒径太小理化性质稳定，但粒径太小19分离工程第七章PPT课件w常用制备亲和吸附介质的方法有：常用制备亲和吸附介质的方法有：CNBr活化法、环氧基活化法和硅胶的
8、活化。w间隔臂间隔臂当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。在配基与载体之间连接间隔臂，可增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。含有68亚甲基，亲和力最大。20分离工程第七章PPT课件Affinity adsorption21分离工程第七章PPT课件载体的活化和偶联w亲和吸附的载体通常是惰性的，往往不能直接与配基连接，偶联前需要先活化，活化的方法主要有： 溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳酸盐溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳酸盐 高碘酸活化法：氧化多糖，生成烷基胺高碘酸活化法：氧化多糖，
9、生成烷基胺 环氧化法环氧化法：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，再与氨基偶联化合物，再与氨基偶联 甲苯磺酰氯法：双功能试剂法甲苯磺酰氯法：双功能试剂法 二乙烯砜二乙烯砜22分离工程第七章PPT课件环氧化法表氯醇Activation23分离工程第七章PPT课件配基偶联方法w载体经活化后，就可以进行与配基的偶联反应。具体方法如下： 碳二亚胺缩合法碳二亚胺缩合法( (脱水脱水) ) 酸酐法酸酐法 叠氮化法叠氮化法 重氮化法重氮化法24分离工程第七章PPT课件三、应用w最初用于蛋白质特别是酶的分离和精制上，后来发展到大规模应用在酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离
10、精制上。w思考题：制备亲合吸附介质时，为什么需要在配基与载体之间引入间隔臂？25分离工程第七章PPT课件第三节 亲和膜26分离工程第七章PPT课件一、原理w利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜亲和层析。27分离工程第七章PPT课件w微滤膜比喻为固定床，则膜厚即为床层高度。亲合配基固定在膜孔表面。流体在透过膜过程中目标蛋白质与配基接触而被吸附。28分离工程第七章PPT课件二、应用及特点w应用：应用：如单克隆抗体的纯化、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的纯化等。w实验证明：Cibacron Blue F3GA（活性染料，与NAD 结构类似）是许多
11、酶的和蛋白质极有效的吸附剂：如与辅酶A有关的酶。磷酸激酶，脱羧酶，DNA和RNA的核酸酶和聚合酶以及干扰素等。29分离工程第七章PPT课件30分离工程第七章PPT课件w特点特点优点传质阻力小，达到吸附平衡时间短，配基利用率高；压降小，流速高，设备体积小，配基用量低。31分离工程第七章PPT课件缺点理论板数很低，吸附和清洗效率低；膜的污染会使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降。思考题：简述亲和膜层析的原理和特点32分离工程第七章PPT课件第四节 亲和错流过滤33分离工程第七章PPT课件34分离工程第七章PPT课件一、原理和操作w原理：原理：ACFF又称亲和过滤或亲和超滤，是生物亲和作用与膜分离
12、相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术，是亲和层析的另一种变形。w利用被膜截留的水溶性高分子化合物或不溶性微粒为载体的固定亲合配基。亲合吸附目标蛋白从而增大目标分子和杂蛋白尺寸差别。分子量差10倍才能完全分离。35分离工程第七章PPT课件w操作：操作：一般包括进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。 36分离工程第七章PPT课件亲和膜分离操作方式w亲和超滤过程（分离目标物的同时，浓缩其他亲和超滤过程（分离目标物的同时，浓缩其他成分）成分）37分离工程第七章PPT课件w微孔亲和过滤过程（仅分离目标物）微孔亲和过滤过程（仅分离目标物）38分离工程第七章PPT课件二、应用和特点w应用：应用：如伴刀豆球蛋
13、白（con A）的纯化，连续亲和循环提取（CARE）纯化-半乳糖苷酶等。39分离工程第七章PPT课件w亲和膜过滤纯化伴刀豆蛋白亲和膜过滤纯化伴刀豆蛋白A A的实验装置的实验装置40分离工程第七章PPT课件w特点特点优点以压差为推动力，速度快，易于放大和实现连续化操作；选择性高，纯化水平接近或达到亲和层析；载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快；不需使用高压设备，可弥补高效亲和层析设备昂贵、放大困难的缺点。41分离工程第七章PPT课件缺点相当于层析过程的一个理论板，分离效率较低。思考题：简述亲合错流过滤技术分离蛋白质的操作过程？42分离工程第七章PPT课件第
14、五节 其他亲和纯化技术43分离工程第七章PPT课件一、亲和双水相分配w原理：原理：利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。w操作：操作：包括亲和分配（进料）、杂蛋白反萃取（清洗）和目标产物反萃取（洗脱）等步骤。44分离工程第七章PPT课件二、亲和反胶团萃取w原理：原理：在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。
15、w一般将含配基的助表面活性剂称为亲合助表面剂。45分离工程第七章PPT课件46分离工程第七章PPT课件47分离工程第七章PPT课件48分离工程第七章PPT课件三、亲和沉淀w定义：定义：生物亲和作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术。w原理原理一次作用亲和沉淀水溶性化合物分子上偶联两个或两个以上亲和配基，与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质产生亲和交联，进而增大为较大的交联网络而沉淀。49分离工程第七章PPT课件二次作用亲和沉淀利用在物理场（如pH、离子强度、温度和添加金属离子等）改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。亲和介质结合目
16、标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀。50分离工程第七章PPT课件w优点优点亲和结合作用在自由溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快；配基利用率高；利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大；51分离工程第七章PPT课件可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物的纯化，因此可在分离操作的较初期采用，有利于减少分离操作步骤，降低成本。同时，在分离过程的早期阶段除去对目标产物有害的杂质（如蛋白酶），有利于提高目标产品质量和收率。52分离工程第七章PPT课件思考题w1、什么是亲和反胶团萃取？w2、什么是亲和沉淀？53分离工程第七章PPT课件本章内容到此结束本章内容到此结束谢谢大家谢谢大家谢谢大家谢谢大家54分离工程第七章PPT课件
