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1、质粒质粒DNA的提取与电泳鉴定的提取与电泳鉴定1、质粒简介、质粒简介质质粒粒是是一一种种寄寄生生性性的的自自主主复复制制子子，存存在在于于细细菌菌等等细细胞胞中中，为为双双链链闭闭环环的的DNA分分子子，大大小小为为1kb200kb之之间间，具具有有自自主主复复制制和和转转录录的的能能力力，但但其其复复制制和和转转录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质。录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质。2、分离纯化质粒的原理、分离纯化质粒的原理分分离离纯纯化化质质粒粒DNA主主要要是是利利用用宿宿主主染染色色质质DNA与与质质粒粒DNA之间的差异来进行的。之间的差异来进行的。质粒质粒DNA的
2、提取与电泳鉴定的提取与电泳鉴定细细菌菌DNA与与质质粒粒DNA形形状状上上均均为为双双链链环环形形，但但二二者者的的分分子子量量相相差差较较大大，细细菌菌DNA的的分分子子量量在在109D左右，而质粒左右，而质粒DNA的分子量仅为的分子量仅为106 107D，提提取取纯纯化化质质粒粒的的过过程程中中，细细菌菌DNA大大多多断断裂裂成成线线状状分分子子，而而质质粒粒DNA则则多多数数仍仍为为双双链链环环状状，从从而而即可将二者分开。即可将二者分开。本本试试验验采采用用微微量量碱碱变变性性法法来来分分离离纯纯化化质质粒粒DNA，具体的分离纯化原理如下：具体的分离纯化原理如下：0 细菌细菌（含质粒）
3、（含质粒）溶菌酶溶菌酶破细胞壁破细胞壁SDS NaOH（ 细细 菌菌 DNA和和 质质 粒粒DNA均均通通过过碱碱变变性性成成为线状分子）为线状分子）破细胞膜破细胞膜冰醋酸冰醋酸细菌细菌DNA与变性蛋白和细胞碎片缠与变性蛋白和细胞碎片缠 绕在一起（不能复性）绕在一起（不能复性）质粒质粒DNA经复性后变为共价闭合环状经复性后变为共价闭合环状离心离心沉淀：细菌沉淀：细菌DNA、细胞碎片等细胞碎片等上清：质粒上清：质粒DNA、RNA、可溶性蛋白等可溶性蛋白等酚：氯仿酚：氯仿离心离心下层：酚，氯仿下层：酚，氯仿中层：变性蛋白中层：变性蛋白上清（水层）：质粒上清（水层）：质粒DNA、RNA等等无水乙醇无
4、水乙醇离心离心上清：可溶性杂质等上清：可溶性杂质等沉淀：质粒沉淀：质粒DNA、RNA等等RNase质粒质粒DNA质粒质粒DNA的提取与电泳鉴定的提取与电泳鉴定质质粒粒DNA的的天天然然结结构构为为共共价价闭闭环环（超超螺螺旋旋）结结构构，但但在在制制备备过过程程中中，由由于于各各种种因因素素的的影影响响，同同一一质质粒粒DNA的分子可能呈现出如下几种构型：的分子可能呈现出如下几种构型：超超 螺螺 旋旋 型型 （ 共共 价价 闭闭 环环 ） 质质 粒粒 DNA：（cccDNA）超螺旋状。）超螺旋状。开开环环质质粒粒DNA：（ocDNA）质质粒粒DNA的的两两条条链链中中有有一一条条链链发发生生一
5、一处处或或多多处处断断裂裂，从从而而形形成成松松弛弛的环状分子。的环状分子。线线状状质质粒粒DNA：（linearDNA）质质粒粒DNA的的两两条链在同一处断裂，从而变为线状分子。条链在同一处断裂，从而变为线状分子。质粒质粒DNA的提取与电泳鉴定的提取与电泳鉴定电电泳泳时时，由由于于分分子子形形状状的的不不同同，三三种种质质粒粒DNA的的泳泳动动行行为为不不同同，根根据据电电泳泳迁迁移移率率从从小小到到大大的的顺顺序序分分别别为为开开环环质质粒粒DNA、线线状状质质粒粒DNA和和超超螺螺旋旋质粒质粒DNA。3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理核核酸酸是是一一种种两两性性电
6、电解解质质（碱碱基基、磷磷酸酸），在在pH8.0下下，核核酸酸带带负负电电荷荷，电电泳泳时时向向正正极极移移动动，根根据据核核酸酸分分子子所所带带电电荷荷的的多多少少，分分子子的的大大小小及及构构型型的的差差异异，可可用用电电泳泳的的方方法法对对核核酸酸进进行行分分离离和和鉴鉴定。定。质粒质粒DNA的提取与电泳鉴定的提取与电泳鉴定电电泳泳中中所所使使用用的的支支持持介介质质有有聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶和和琼琼脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。不不同同浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶可可以以分分离离200bp50kb的的DNA片片断断，通通过过在在琼琼脂脂糖糖溶
7、溶液液中中加加入入低低浓浓度度的的莹莹光光染染料料溴溴乙乙锭锭（EB），在在紫紫外外光光下下即即可可检检测测出出10ng的的DNA条带。条带。当当用用琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳法法检检测测质质粒粒DNA样样品品时时，根根据据条条带带的的位位置置即即可可知知道道质质粒粒分分子子的的三三种种构构型型及及其其比例，比例，质粒质粒DNA的提取与电泳鉴定的提取与电泳鉴定此此外外，还还可可了了解解质质粒粒样样品品中中的的杂杂质质，如如RNA、染染色色体体DNA、蛋蛋白白质质等等的的污污染染程程度度。电电泳泳时时如如用用已已知知分分子子量量的的核核酸酸作作对对照照，还还可可测测定定样样品品核核酸酸的的分分
8、子量。子量。4、材料与试剂、材料与试剂、试验材料、试验材料含有含有pUC系列、系列、PSK等高拷贝质粒的菌株。等高拷贝质粒的菌株。、试验试剂、试验试剂试试验验试试剂剂及及使使用用时时的的注注意意事事项项解解说说详详见见P144及及P147。质粒质粒DNA的提取与电泳鉴定的提取与电泳鉴定5、操作步骤、操作步骤、质粒的提取、质粒的提取质粒提取的操作方法及注意事项解说详见质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。、电泳鉴定、电泳鉴定胶浓度：胶浓度：0.7%各步操作方法及注意事项解说详见各步操作方法及注意事项解说详见P148。6、实验结果及处理、实验结果及处理仔细观察纯化过程中各步试验现象。仔细观
9、察纯化过程中各步试验现象。仔仔细细观观察察电电泳泳后后荧荧光光带带的的显显示示情情况况，据据此此绘绘制制电电泳图谱并对图谱进行简要说明。泳图谱并对图谱进行简要说明。（二）、质粒（二）、质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定1、限制性内切酶简介、限制性内切酶简介限限制制性性内内切切酶酶或或限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶（Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease）是是指指能能辨辨认认双双螺螺旋旋DNA分分子子中中的的特特异异碱碱基基序序列列，并并在在此此特特异位点处以内切方式将双链异位点处以内切方式将双链DNA切断的一类酶。切断的一类酶。根根据据它它们
10、们的的作作用用特特点点，可可将将其其分分为为三三类类：类类和和类类酶酶，在在同同一一种种酶酶分分子子中中兼兼有有切切割割和和修修饰饰（甲甲基基化化）作作用用，类类酶酶由由于于切切割割位位点点随随机机，类类酶酶则则由由于于切切割割位位点点不不对对称称，因因此此这这两两类类酶酶的的作作用用都都不大。不大。（二）、质粒（二）、质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定类类酶酶由由两两种种酶酶组组成成，一一种种为为限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶，另另一一种种为为独独立立的的甲甲基基化化酶酶。其其中中，对对我我们们最最为为有有用的是用的是类酶中的限制性核酸内切酶。类酶中的限制性核酸内切酶。限限制制性性核核酸酸内内
11、切切酶酶广广泛泛存存在在于于原原核核生生物物中中，1968年年由由Meselen和和Yuan从从大大肠肠杆杆菌菌中中第第一一次次分分离离得得到，现已发现近几百种到，现已发现近几百种(498种种)。该该类类酶酶能能识识别别DNA分分子子中中的的特特异异序序列列，并并在在此此序序列处切断列处切断DNA双链。双链。（二）、质粒（二）、质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定绝绝大大多多数数限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别序序列列为为4个个6个个碱碱基基对对，该该序序列列具具回回文文对对称称结结构构，且且富富含含GC。（即即旋旋转转1800后后与与原原来来结结构构相相同同），少少数数酶酶可可识识别别更更长长
12、的序列或兼并序列。的序列或兼并序列。限限制制性性内内切切酶酶切切割割后后的的DNA片片断断，有有的的产产生生粘粘性性末端，有的产生平末端。如：末端，有的产生平末端。如：、产生粘末端的酶、产生粘末端的酶（二）、质粒（二）、质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定BamH：G G A T T C C Hind：A A G C T T C C T A A G G T T C G A A 两两条条链链的的断断裂裂位位置置是是交交错错地地担担又又对对称称地地围围绕绕着着一一个对称轴排列。个对称轴排列。、产生平末端的酶：、产生平末端的酶：Hae：G G C C C C G G两两条条链链的的断断裂裂位位置置处处在在
13、一一个个对对称称结结构构的的中中心心。常常用限制性内切酶的酶切位点可参见有关书藉。用限制性内切酶的酶切位点可参见有关书藉。（二）、质粒（二）、质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定限限制制性性内内切切酶酶由由于于能能识识别别特特异异顺顺序序并并进进行行切切割割，因因而而在在基基因因重重组组、序序列列分分析析、基基因因组组甲甲基基化化分分析析及基因物理图谱的绘制等技术中被广泛应用。及基因物理图谱的绘制等技术中被广泛应用。2、质粒、质粒pUC19的酶切图谱的酶切图谱质粒质粒pUC19的酶切图谱见的酶切图谱见图图1.2。（二）、质粒（二）、质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定由图可见，实验所用的由图可见，实验所用
14、的BamH和和Hind在质粒在质粒pUC19上均为单切点的限制性内切酶，上均为单切点的限制性内切酶， pUC19经经这两种酶切割后可产生大小二片段，大片段为这两种酶切割后可产生大小二片段，大片段为2.656bp，小片段为小片段为30bp。如为完全酶切，电泳后如为完全酶切，电泳后应产生这两个片段的电泳图谱，由此即可对提取应产生这两个片段的电泳图谱，由此即可对提取的质粒进行鉴定。的质粒进行鉴定。3、影响限制性酶切反应的因素、影响限制性酶切反应的因素DNA纯度、缓冲液、温度及限制酶本身都会影响纯度、缓冲液、温度及限制酶本身都会影响酶的活性。酶的活性。（二）、质粒（二）、质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定
15、为避免污染，每次吸取限制酶时都需用新的吸管为避免污染，每次吸取限制酶时都需用新的吸管头。头。应注意，如采用两种限制酶进行切割，则必须分应注意，如采用两种限制酶进行切割，则必须分别提供各自的最适盐浓度。别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同种缓冲液，则可同时水解，否则低若两者可用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，待调节盐浓度后，再盐浓度的限制酶必须先用，待调节盐浓度后，再用高盐浓度的限制酶水解。用高盐浓度的限制酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，将第一个酶变性也可在第一个酶切反应完成后，将第一个酶变性除去后再进行第二个酶切反应。除去后再进行第二个酶切反应。（二）、质粒（二）、质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定3、操作方法、操作方法试验步骤及注意事项参试验步骤及注意事项参P149。4、实验结果及处理、实验结果及处理仔仔细细观观察察电电泳泳后后荧荧光光带带的的显显示示情情况况，据据此此绘绘制制电电泳泳图图谱谱并并对对图图谱谱进进行行简简要要说说明明。注注意意与与未未经经酶酶切切的质粒的电泳图谱相比较。的质粒的电泳图谱相比较。
