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1、疫苗制备工艺疫苗制备工艺 在发展中国家，死亡总在发展中国家，死亡总人数的人数的30%50%死于传染死于传染病。病。 在发达国家，传染病死在发达国家，传染病死亡人数仅占死亡总人数的亡人数仅占死亡总人数的4%8%，主要得益于，主要得益于疫苗疫苗的广的广泛应用。泛应用。第一部分第一部分 疫苗疫苗概述概述疫苗与药物的不同点一般药物一般药物疫苗疫苗对象年龄目的种类结果病人健康人群不同年龄段的患者婴幼儿和儿童治疗疾病/减轻病人的症状通过免疫机制使健康人预防疾病天然药物、化学合成药物、生物药品等生物制品减轻病痛彻底控制消灭某一种疾病（如：天花、脊髓灰质炎）第一节第一节 疫苗概念的产生及其背景疫苗概念的产生及
2、其背景一、一、疫苗疫苗的的产生及其背景产生及其背景12世纪，中国开始用人痘接种预防天花世纪，中国开始用人痘接种预防天花 -疫苗可预防疾病的流行病学与预防学疫苗可预防疾病的流行病学与预防学 第第6版版（2000年年） 美国疾病控制与预防中心出版美国疾病控制与预防中心出版天花（天花（Smallpox）临床表现：临床表现：主要为严重毒血症状（寒战、高热、乏力、头痛、主要为严重毒血症状（寒战、高热、乏力、头痛、四肢及腰背部酸痛，体温急剧升高时可出现惊厥、四肢及腰背部酸痛，体温急剧升高时可出现惊厥、昏迷）、皮肤成批依次出现斑疹、丘疹、疱疹、昏迷）、皮肤成批依次出现斑疹、丘疹、疱疹、脓疱，最后结痂、脱痂，
3、遗留痘疤。脓疱，最后结痂、脱痂，遗留痘疤。传播途径传播途径：飞沫吸入或直接接触；：飞沫吸入或直接接触；来势凶猛，发展迅速，对未免疫人群感染后来势凶猛，发展迅速，对未免疫人群感染后15-20天内致死率高达天内致死率高达30。天花（天花（Smallpox）由由天花病毒天花病毒引起的一种引起的一种烈性传染病烈性传染病，患者在，患者在痊愈后脸上会留有麻子，故名痊愈后脸上会留有麻子，故名“天花天花”。天花病毒天花病毒：外观外观：呈砖形（：呈砖形（200纳米纳米300纳米）纳米）抵抗力较强：抵抗力较强：能对抗干燥和低温，能对抗干燥和低温，在痂皮、尘土和被服上，可生存数在痂皮、尘土和被服上，可生存数月至一年
4、半之久月至一年半之久天花天花的防治的防治-中国中国宋真宗时期宋真宗时期(998- 1023年年) ：人痘法人痘法-预防天花预防天花医者从医者从症状轻微的天花病人症状轻微的天花病人身上进行人工接染到健康身上进行人工接染到健康儿童，使其通过产生轻微症状的感染获得免疫力，避儿童，使其通过产生轻微症状的感染获得免疫力，避免天花引起的严重疾病甚至死亡免天花引起的严重疾病甚至死亡明朝隆庆年间明朝隆庆年间(1567-1572年年)：人痘法人痘法-趋于完善趋于完善人痘衣法、痘浆法、旱痘法和水苗法人痘衣法、痘浆法、旱痘法和水苗法等多种接种方法等多种接种方法人痘法的缺点人痘法的缺点：有时也会引起严重的天花有时也会
5、引起严重的天花天花天花的防治的防治-欧洲欧洲1721年，人症接种法传入英国年，人症接种法传入英国英国医生英国医生E. Jenner( 1749-1823)1796年年，利用，利用牛痘牛痘防治防治天花天花1798年，医学界年，医学界正式承认正式承认疫苗接种确实是一种行之疫苗接种确实是一种行之有效的免疫方法有效的免疫方法。1980年，世界卫生组织年，世界卫生组织(WHO)宣布宣布: 全球消灭了天花全球消灭了天花疫苗之父疫苗之父-法国免疫学家法国免疫学家 Louis Pasteur细菌的分离培养细菌的分离培养技术技术减毒菌株减毒菌株的获得的获得连续传代培养法连续传代培养法（1870年年）鸡霍乱弧菌鸡
6、霍乱弧菌减毒株减毒株（第一个细菌减第一个细菌减毒活疫毒活疫苗）苗）高温培养法高温培养法（ 1881年年）炭疸菌苗炭疸菌苗异体传代法异体传代法：将将狂犬病毒狂犬病毒在在兔兔体体内经连续传代内经连续传代，获得了减毒株获得了减毒株 巴氏减毒菌苗的发明巴氏减毒菌苗的发明：为实验免疫学建立了基础为实验免疫学建立了基础疫苗的定义疫苗的定义一切一切通过通过注射注射或或黏膜黏膜途径途径接种接种，可以诱导，可以诱导机体产生机体产生针对针对特定致病原特定致病原的的特异性抗体特异性抗体或或细胞免疫细胞免疫，从而，从而使机体获得使机体获得保护或消灭该保护或消灭该致病原致病原能力能力的生物制品，统称为疫苗的生物制品，统
7、称为疫苗包括包括: 蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子等因子等二、二、 疫苗的种类疫苗的种类1 1 . 按按所用材料所用材料分类：分类：细菌性疫苗细菌性疫苗（旧称：旧称：菌苗菌苗）病毒性疫苗病毒性疫苗（旧称：疫苗旧称：疫苗）类毒素类毒素2 .按按疫苗研制技术疫苗研制技术分类：分类：传统疫苗传统疫苗灭活疫苗灭活疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗亚单位疫苗亚单位疫苗：用天然微生物的某些成分制成用天然微生物的某些成分制成新型疫苗新型疫苗项目项目减毒活疫苗减毒活疫苗灭活疫苗灭活疫苗亚单位疫苗亚单位疫苗抗原抗原用减毒或无毒的全病原体用减毒或无毒的全病原体作为抗原作为抗原用化学或物
8、理方法将病用化学或物理方法将病原体杀死原体杀死以化学方法获得病原体以化学方法获得病原体的某些具免疫原性的成的某些具免疫原性的成分分免疫机免疫机理理接种后病原体在体内有一接种后病原体在体内有一定生长繁殖能力，类似隐定生长繁殖能力，类似隐性感染，产生细胞、体液性感染，产生细胞、体液和局部免疫和局部免疫病原体失去毒力但保持病原体失去毒力但保持免疫原性，接种后产生免疫原性，接种后产生特异抗体或致敏淋巴细特异抗体或致敏淋巴细胞胞接种后能刺激机体产生接种后能刺激机体产生特异性免疫效果特异性免疫效果优缺点优缺点接种次数少，反应小，免接种次数少，反应小，免疫效果持久。疫效果持久。稳定性较差，并应考虑减稳定性较
9、差，并应考虑减毒株毒力返祖问题毒株毒力返祖问题一般要接种一般要接种2 2- -3 3次，反次，反应较大，维持时间较短。应较大，维持时间较短。稳定性好，较安全稳定性好，较安全制品纯度较高，副反应制品纯度较高，副反应小，需多次接种小，需多次接种常用疫常用疫苗苗卡介苗、麻疹、鼠疫、脊卡介苗、麻疹、鼠疫、脊髓灰质炎减毒活疫苗髓灰质炎减毒活疫苗伤寒、霍乱、百日咳、伤寒、霍乱、百日咳、乙脑、脊髓灰质炎灭活乙脑、脊髓灰质炎灭活疫苗疫苗白喉、破伤风类毒素，白喉、破伤风类毒素，A A群脑膜炎球菌多糖疫苗群脑膜炎球菌多糖疫苗新型疫苗新型疫苗基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗基因工程载体疫苗基因工程载体疫苗核酸疫
10、苗核酸疫苗基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗重组疫苗重组疫苗合成肽疫苗合成肽疫苗抗独特型抗体疫苗抗独特型抗体疫苗新型疫苗新型疫苗基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗-灭活疫苗灭活疫苗基因工程载体疫苗基因工程载体疫苗-活疫苗活疫苗核酸疫苗核酸疫苗-特殊的疫苗特殊的疫苗基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗-灭活疫苗灭活疫苗重组疫苗重组疫苗-灭活疫苗灭活疫苗合成肽疫苗合成肽疫苗-灭活疫苗灭活疫苗抗独特型抗体疫苗抗独特型抗体疫苗-灭活疫苗灭活疫苗疫苗的发展疫苗的发展经典的病毒疫苗和细菌疫苗经典的病毒疫苗和细菌疫苗 寄生虫疫寄生虫疫苗、肿瘤疫苗、避孕疫苗等苗、肿瘤疫苗、避孕疫苗等; ;预防性疫苗预防性疫苗 治疗性疫苗
11、。治疗性疫苗。三、疫苗的基本成分、性质和特征三、疫苗的基本成分、性质和特征1 1. 疫苗的基本成分疫苗的基本成分抗原抗原佐剂佐剂防腐剂防腐剂稳定剂稳定剂灭活剂灭活剂缓冲液、盐类等非活性成分缓冲液、盐类等非活性成分（1）抗原抗原:疫苗最主要的有效活性成分疫苗最主要的有效活性成分基本条件基本条件异物性异物性一一定的理化特性定的理化特性特异性特异性灭活病毒或细菌灭活病毒或细菌活病毒或细菌活病毒或细菌/减毒株减毒株病毒或菌体提纯物病毒或菌体提纯物有效蛋白成分有效蛋白成分类毒素类毒素细菌多糖细菌多糖合成多肽合成多肽DNA。（2） 佐佐 剂剂理想的佐剂理想的佐剂：增强抗原免疫应答增强抗原免疫应答无毒、安全
12、无毒、安全在非冷藏条件下保持稳在非冷藏条件下保持稳定定作用作用机制机制改变抗原的物理形状，延改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内长抗原在机体内保留时间保留时间；刺激单核吞噬细胞对抗原刺激单核吞噬细胞对抗原的提的提呈呈能力；能力；刺激淋巴细胞分化，增加刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力扩大免疫应答能力。常规免疫佐剂：常规免疫佐剂：常规免疫佐剂：铝盐类佐剂、蜂胶常规免疫佐剂：铝盐类佐剂、蜂胶佐剂、油水乳剂。佐剂、油水乳剂。 新型免疫佐剂：新型免疫佐剂：新型免疫佐剂：细胞因子、新型免疫佐剂：细胞因子、CpGCpG DNADNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物、基因工程减毒素、免疫刺激复合物(IS
13、COM)(ISCOM)、脂质体。脂质体。按物理性质生物学性质佐剂在体内的存留时间颗粒性佐剂非颗粒性佐剂微生物及其组分非微生物物质贮存型佐剂非贮存型佐剂其他分类：其他分类：1.1.铝盐类佐剂铝盐类佐剂2.2.蜂胶佐剂蜂胶佐剂3.3.油水乳剂油水乳剂（一）常规免疫佐剂（一）常规免疫佐剂常规佐剂1：铝盐类佐剂 1 1）氢氧化铝胶：）氢氧化铝胶：铝胶铝胶。 2 2）明矾：硫酸铝钾制成）明矾：硫酸铝钾制成10%10%溶液，高压灭菌；调菌溶液，高压灭菌；调菌液液pHpH至至8 80.10.1，加入明矾液，加入明矾液12%12%，充分混匀。，充分混匀。 3 3）磷酸三钙：在疫苗中加入氯化钙和磷酸氢二钠，）磷
14、酸三钙：在疫苗中加入氯化钙和磷酸氢二钠，使在疫苗中化合成磷酸三钙，吸附抗原后沉淀。使在疫苗中化合成磷酸三钙，吸附抗原后沉淀。常规佐剂常规佐剂2 2：蜂胶：蜂胶( (propolispropolis) ) 蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其它植物幼芽分泌的树脂，蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其它植物幼芽分泌的树脂，并混入蜜蜂上颚腺分泌物，以及蜂蜡、花粉、其它一些有机并混入蜜蜂上颚腺分泌物，以及蜂蜡、花粉、其它一些有机和无机物的一种天然物质。是一种天然的免疫增强剂。和无机物的一种天然物质。是一种天然的免疫增强剂。常规佐剂常规佐剂3 3：油水乳剂佐剂：油水乳剂佐剂 由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂，
15、是制由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂，是制备兽用灭活疫苗时广泛运用的备兽用灭活疫苗时广泛运用的另一种佐剂另一种佐剂。免疫刺激复合物免疫刺激复合物细胞因子类细胞因子类CpGCpG DNA DNA（二）新型免疫佐剂（二）新型免疫佐剂（3）防腐剂防腐剂目的：目的：防止外来微生防止外来微生物的污染物的污染大多数的灭活疫苗都大多数的灭活疫苗都使用防腐剂使用防腐剂硫柳汞硫柳汞硫柳汞硫柳汞副作用：副作用：接触性皮炎接触性皮炎、变应性变应性结膜炎结膜炎、耳毒性耳毒性（4） 稳定剂稳定剂保证作为抗原的病毒或其他微生物存活保证作为抗原的病毒或其他微生物存活，并保持免疫原性并保持免疫原性；冻干疫苗中常用的
16、乳糖、明胶、山梨醇等。冻干疫苗中常用的乳糖、明胶、山梨醇等。 灭活（灭活（inactivationinactivation）：）：破坏微生物的生物学活破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但不损害其免疫原性，用以性、繁殖能力和致病性，但不损害其免疫原性，用以制备灭活疫苗。制备灭活疫苗。 灭活方法：灭活方法：物理方法：加热、紫外线和射线照射物理方法：加热、紫外线和射线照射 化学方法：化学试剂，如甲醛，化学方法：化学试剂，如甲醛，- -丙内酯等。甲醛是最常用的灭活剂。丙内酯等。甲醛是最常用的灭活剂。 灭活剂（灭活剂（inactivatorinactivator）：）：用于灭活微生物的化用于灭活
17、微生物的化学试剂如甲醛溶液、烷化剂、苯酚、结晶紫、学试剂如甲醛溶液、烷化剂、苯酚、结晶紫、- -丙丙酰内脂等。酰内脂等。（5）灭活剂灭活剂( (一一) )甲醛溶液甲醛溶液 (Formaldehyde solution)(Formaldehyde solution) 甲醛为无色气体，有强烈的刺激性，对眼、鼻黏膜和上甲醛为无色气体，有强烈的刺激性，对眼、鼻黏膜和上呼吸道有刺激性。易溶于水合乙醇。其水溶液（呼吸道有刺激性。易溶于水合乙醇。其水溶液（36%36%40%40%）称）称为福尔马林为福尔马林(Formalin)(Formalin)。 甲醛甲醛最古典的灭活剂，但也是目前最主要的灭活剂。最古典的
18、灭活剂，但也是目前最主要的灭活剂。 灭活机理：灭活机理：甲醛的醛基与蛋白质的氨基、羧基、羟基和甲醛的醛基与蛋白质的氨基、羧基、羟基和巯基反应，分别形成羟甲基胺、亚甲基二醇单酯、羟甲基酚巯基反应，分别形成羟甲基胺、亚甲基二醇单酯、羟甲基酚和硫代亚甲基二醇等，使病毒、细菌等微生物的蛋白质构象和硫代亚甲基二醇等，使病毒、细菌等微生物的蛋白质构象发生改变，从而使其失活。但对其免疫原性无明显影响。发生改变，从而使其失活。但对其免疫原性无明显影响。 另外，甲醛还可以与核酸中的碱基（另外，甲醛还可以与核酸中的碱基（A A、G G和和C C）上的氨基）上的氨基反应，与核糖体蛋白的氨基反应，从而影响核酸和核糖体
19、的反应，与核糖体蛋白的氨基反应，从而影响核酸和核糖体的功能。功能。无囊膜的二十无囊膜的二十面体对称病毒面体对称病毒有囊膜的二十有囊膜的二十面体对称病毒面体对称病毒有囊膜的螺旋对称病毒甲醛与蛋白的氨基结甲醛与蛋白的氨基结合形成羟甲基或二羟合形成羟甲基或二羟甲基衍生物，后者与甲基衍生物，后者与酰胺或胍基团反应导酰胺或胍基团反应导致蛋白变性。致蛋白变性。甲醛与核酸中含氨基的A、G、C反应使核酸变性。灭活用甲醛浓度：灭活用甲醛浓度： 基本原则：浓度随不同微生物而异。基本原则：浓度随不同微生物而异。 1 1）需氧菌：）需氧菌：0.1%0.1%0.2%0.2%。 2 2）厌氧菌：）厌氧菌：0.4%0.4%
20、 0.5%0.5%。 3 3）病）病 毒：毒：0.05%0.05% 0.4%0.4% 。 其他灭活条件：其他灭活条件：3737，24244848hrshrs。有时灭活时间会更。有时灭活时间会更长，如破伤风类毒素用长，如破伤风类毒素用0.4%0.4%的甲醛，的甲醛，3737需灭活需灭活2121 2323天。天。（二）烷化剂（二）烷化剂 (alkylating agent)1.AEI：N-乙酰基乙烯亚胺2.BEI：二乙烯亚胺 3.GDA：缩水甘油醛烷化剂的灭活机制：烷化剂的灭活机制： 1 1）烷化）烷化DNADNA分子中的分子中的G G或或A A，引起单链断裂或双链交联，引起单链断裂或双链交联，改
21、变改变DNADNA的结构而破坏其功能。的结构而破坏其功能。 2 2）可与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。）可与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。 这类灭活剂能破坏病毒的核心，使病毒完全丧失感染这类灭活剂能破坏病毒的核心，使病毒完全丧失感染力，一般不损害其衣壳蛋白，故能维持其免疫原性。力，一般不损害其衣壳蛋白，故能维持其免疫原性。灭活机制：使微生物的蛋白质变性，或抑制灭活机制：使微生物的蛋白质变性，或抑制微生物的特异酶系统，使其失去活性。微生物的特异酶系统，使其失去活性。制备疫苗时的用量：制备疫苗时的用量：0.3%0.3%0.5%0.5%。（三）苯酚（三）苯酚 (phenol)(pheno
22、l)（四）结晶紫（四）结晶紫 (crystal violet)(crystal violet) 一种碱性染料。一种碱性染料。 灭活机制：其阳离子与微生物蛋白质带负电的羟基形成灭活机制：其阳离子与微生物蛋白质带负电的羟基形成弱电性化合物，妨碍微生物的正常代谢。弱电性化合物，妨碍微生物的正常代谢。（五）（五）- -丙内酯丙内酯( (propiolactonepropiolactone, , -PL)-PL) 一种良好的病毒灭活剂，但具有致癌性一种良好的病毒灭活剂，但具有致癌性 作用机理：可能是作用于病原体的作用机理：可能是作用于病原体的DNADNA和和RNARNA，而不直接，而不直接作用于蛋白，有
23、利于维持病毒的免疫原性。作用于蛋白，有利于维持病毒的免疫原性。 19841984年被选为狂犬病灭活苗的制备。年被选为狂犬病灭活苗的制备。筛选灭活剂的基本原则：筛选灭活剂的基本原则： 选择合适的灭活剂，或研发更为优良的灭活剂是生物制选择合适的灭活剂，或研发更为优良的灭活剂是生物制品行业的一项重要工作。目前，甲醛最常用，品行业的一项重要工作。目前，甲醛最常用，N-N-乙酰基乙烯乙酰基乙烯亚胺亚胺(AEI)(AEI)和二乙烯亚胺和二乙烯亚胺 (BEI)(BEI)也被使用。也被使用。筛选原则：筛选原则： 1 1）病原体完全灭活：安全性好）病原体完全灭活：安全性好 2 2）最大限度的保持病原体的抗原性：
24、在消除病原体感染）最大限度的保持病原体的抗原性：在消除病原体感染性的同时，维持其蛋白质天然的三维结构和抗原表位等。性的同时，维持其蛋白质天然的三维结构和抗原表位等。 3 3）灭活步骤更为简单有效。）灭活步骤更为简单有效。（6）缓冲液、盐类缓冲液、盐类 缓冲液的缓冲液的种类种类、盐类的、盐类的含量含量都可影响疫都可影响疫苗的效力、纯度和安全性，因此都有严格苗的效力、纯度和安全性，因此都有严格的质量标准的质量标准第二部分第二部分 疫苗制备工艺疫苗制备工艺 菌种的选择 菌液培养 灭活 配苗 浓缩 菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多，
25、但制造的基本程序差别不大。 一、细菌性疫苗制备工艺一、细菌性疫苗制备工艺细菌性灭活疫苗制造细菌性灭活疫苗制造（一）菌种与种子一）菌种与种子 1.菌种 制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。 各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。 2.2.种子培养种子培养 将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进行增殖培养，经检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定的
26、使用期限。 菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗（二）菌液培养二）菌液培养 大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机械化或自动化的培养方式。 机械化或自动化的培养方式通称为反应缸培养法，可供选择的菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。 菌液培养也可采用固体培养法，该方法易获得高浓度的细菌悬液，易稀释成不同浓度，且含培养基的成分较少，所以比较适用于制备诊断用的抗原。 菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗（三）灭（三）灭 活活 灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行，几种灭
27、活菌苗的灭活方法如表所示。 表表 几种灭活菌苗的灭活方法几种灭活菌苗的灭活方法 菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗（四）浓（四）浓 缩缩 为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。 常用的浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法 离心沉降法 羧甲基纤维沉淀法 以上方法可使菌液浓缩一倍以上。 菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗 （五）配苗与分装五）配苗与分装 由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。 氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化
28、铝胶配苗。 有的厂油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、 11.4m1Span-85、3.6ml Tween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。 配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。 菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。将检定合格的菌种接种于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，经检查合格者即可作为种子液。种子
29、液通常在04C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。 细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。（一）菌种与种子（一）菌种与种子细菌性活疫苗制造细菌性活疫苗制造菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养浓缩浓缩配苗配苗按1%3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求进行培养。如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗下制成菌液菌液于04C暗处保存，待抽样经活菌数等检查合格后使用。（二）菌液培养二）菌液培养菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养浓
30、缩浓缩配苗配苗 经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。 分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。 （四）配苗与冻干（四）配苗与冻干 为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2% 0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作活菌数等检查。（三）浓缩（三）浓缩菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养浓缩浓缩配苗配苗流程图流程图1细菌疫苗制造工艺流程细菌疫苗制造
31、工艺流程蛋白质、肉浸液等原料蛋白质、肉浸液等原料培养基培养基细菌分离细菌分离菌菌 种种弱毒菌种弱毒菌种配置、灭菌鉴定减毒检验配制灭菌检验配制灭菌原原 料料佐佐 剂剂灭活菌液灭活菌液配苗、乳化配苗、乳化灭活疫苗灭活疫苗培培 养养菌苗原液菌苗原液配配 苗苗活疫苗活疫苗保护剂保护剂菌菌 液液分装、冻干分装、冻干分分 装装灭活原原 料料活化活化种子种子举例 白喉疫苗外毒素外毒素对神经对神经系统损系统损害害细菌产生细菌产生的外毒素的外毒素对心肌损对心肌损害害外毒素外毒素对肾脏对肾脏损害损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病它是
32、由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病主要临床表现为上呼吸道发炎，主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，白喉流行三个特点传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的 细菌没有中间宿主，病人及带细菌没有中间宿主，病人及带 菌者是一的传染原。菌者是一的传染原。传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也 可通过被污的器具和食物传可通过被污的器具和食物传 播。播。易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1 1 岁时白喉易感性达高峰。岁时白喉易感性达高峰。二、
33、病原学白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈棒状，有白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈棒状，有 着着色色 较深的异染颗粒，革兰氏染色阳性，白喉杆菌较深的异染颗粒，革兰氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚膜，不行成芽孢。无动力，无荚膜，不行成芽孢。白喉杆菌是需氧菌，最适温度为白喉杆菌是需氧菌，最适温度为3435。能分。能分解葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原解葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸盐，不产生吲哚，不消化蛋白。硝酸盐，不产生吲哚，不消化蛋白。白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和红霉素极敏感；对消毒剂抵抗力弱，红霉素极敏感；对消毒剂抵抗
34、力弱，1石碳酸石碳酸1min或或3苯酚苯酚10min可将该菌杀死。不耐热，可将该菌杀死。不耐热，58 10min或或100 1min即可被杀死。白喉是由白即可被杀死。白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的三、白喉毒素白喉毒素对人和动物都引起致死性毒性，白喉毒素对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均受到损害。等均受到损害。白喉毒素是单一多肽，由白喉毒素是单一多肽，由560560个氨基酸组成，个氨基酸组成，分子量为分子量为62kDa,62kDa,等电点等电点pH4.1pH4.1，在，在pH6pH6
35、时加时加热热5555很快失活。很快失活。通过物理和化学方法将其纯化。通过物理和化学方法将其纯化。四、白喉类毒素细细菌菌毒毒素素甲醛甲醛类毒素类毒素类毒素：类毒素：用用0.3%0.3%0.4%0.4%甲醛溶液对外毒素进行脱毒处理后甲醛溶液对外毒素进行脱毒处理后获得的失去毒性但仍保留其免疫原性（抗原性）的生物制品。获得的失去毒性但仍保留其免疫原性（抗原性）的生物制品。白喉和破伤风疫苗是两种常用的基于类毒素的疫苗制剂。白喉和破伤风疫苗是两种常用的基于类毒素的疫苗制剂。在白喉毒素生产的最初阶段需要培养白喉棒状杆菌，在白喉毒素生产的最初阶段需要培养白喉棒状杆菌，然后处理产生的毒素来制备类毒素。破伤风的生
36、产工艺类似。然后处理产生的毒素来制备类毒素。破伤风的生产工艺类似。影响脱毒因素甲醛甲醛浓度浓度温度温度PH脱毒脱毒 温度、温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果和甲醛浓度等均影响脱毒效果温度越高脱毒越快，超过温度越高脱毒越快，超过40影响抗原性，影响抗原性，一般一般3738 。在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，可导致脱毒过甚；在碱性时脱毒快，但可导致脱毒过甚；在碱性时脱毒快，但 抗原性损失较大，一般采用弱碱性。抗原性损失较大，一般采用弱碱性。甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。 五、白喉疫苗工艺流程示意图五、白喉疫苗工艺流程示
37、意图 菌种（菌种（ PW8PW8株株 ） 传代扩增传代扩增 3 34 4代代 发酵罐培养发酵罐培养 34343535培养培养404048h48h对数生长对数生长 末期收获，甲苯杀菌。末期收获，甲苯杀菌。 离心去菌体离心去菌体 收集清液收集清液 超滤浓缩超滤浓缩 3 3万分子量超滤浓缩万分子量超滤浓缩 硫酸铵盐析硫酸铵盐析 两段盐析两段盐析 除盐除菌除盐除菌 氨离子及无菌检查氨离子及无菌检查 脱毒脱毒 0.50.5甲醛液甲醛液 37 4037 405050天天 脱毒试验（家兔）脱毒试验（家兔） 原液原液 检定（浓度、纯度、安全等）检定（浓度、纯度、安全等） Al(OH)Al(OH)3 3吸附吸附
38、 成品成品 检定（安全、检定（安全、效价等）效价等）二、二、病毒疫苗制造病毒疫苗制造 病毒性禽胚培养疫苗制造 病毒性细胞培养疫苗制造 病毒性动物组织疫苗制造 病毒性禽胚培养疫苗制造病毒性禽胚培养疫苗制造 痘痘病病毒毒、正正粘粘病病毒毒、副副粘粘病病毒毒和和疱疱疹疹病病毒毒等等一一类类生生物物制制品品，目目前前仍仍然然利利用用禽禽胚胚特特别别是是鸡鸡胚胚制制备备，如如鸡鸡新新城城疫疫苗苗、禽禽流流感感疫疫苗苗、犬犬瘟瘟热热鸡鸡胚胚弱弱毒毒疫疫苗苗等。等。 禽禽胚胚疫疫苗苗生生产产的的原原材材料料来来源源方方便便、质质量量比比较较容容易易控控制制，制制造造程程序序简简单单，不不需需要要过过高高的的
39、设设备备条条件，生产的疫苗质量可靠件，生产的疫苗质量可靠。鸡胚选择鸡胚选择种毒与毒种继代种毒与毒种继代接毒与收获接毒与收获配苗配苗（一）鸡胚选择（一）鸡胚选择 受精卵应来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。 从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接毒培养。 （二）种毒与毒种继代（二）种毒与毒种继代 目前适应于鸡胚的种毒多系弱毒，包括自然弱毒与人工培育的弱毒两类。各种制苗用的种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保存，保存的种毒多为冻干毒。 冻干毒种需按规定要求在
40、鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定符合标准后方可作为生产疫苗的毒种，毒种检定内容包括无菌检验、毒价测定和其他项目的检定等。 种毒与毒种继代种毒与毒种继代鸡胚选择鸡胚选择接毒与收获接毒与收获配苗配苗（三）接毒与收获（三）接毒与收获 鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。 接种途径：绒毛尿囊膜接种 1112日龄胚 尿囊腔接种 911日龄胚 羊膜腔接种 1012日龄胚 卵黄囊接种 58日龄胚 如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10-3稀释毒种0.1ml，后者接种10-4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊膜接种
41、50-100倍稀释毒0.2ml。1.1.接毒接毒接毒与收获接毒与收获鸡胚选择鸡胚选择种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗 鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标准与内容物依不同的病毒和不同的疫苗而异。 如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.539C、相对湿度60%70%条件培养增殖，收集接毒后2448h内死亡胚，置010C冷却424h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿苗用。 也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻干苗。 鸭 瘟 鸡 胚 化 弱 毒 疫 苗 ， 则 收 集 接 毒 后48120h内死亡的鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用。 2.2.培养收获培养收
42、获 按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进行配苗。 1.1.湿苗湿苗 通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素5001000U，放置010C 冷暗处处理后分装。 2.2.冻干苗冻干苗 经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素5001000U，混合后分装冻干。 3.3.灭活苗灭活苗 收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液，按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫苗，放置4-10C保存。（四）配（四）配 苗苗配苗配苗鸡胚选择鸡胚选择种毒与毒种继代种毒与毒种
43、继代接毒与收获接毒与收获流流程程图图2病病毒毒性性禽禽胚胚疫疫苗苗制制造造工工艺艺流流程程受精卵受精卵禽禽 胚胚毒毒 株株种种 毒毒灭活病毒液灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原原 料料佐佐 剂剂配苗、乳化配苗、乳化灭活疫苗灭活疫苗含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒悬液含病毒悬液配配 苗苗活疫苗活疫苗保护剂保护剂分装、冻干分装、冻干分分 装装灭活原原 料料种种 子子扩增收获配制纯化病毒悬液纯化病毒悬液接种病毒性细胞培养疫苗制造病毒性细胞培养疫苗制造 细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造程序既有相同之处
44、，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细胞及细胞培养方法也有所不同接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备（一）种毒与毒种继代（一）种毒与毒种继代 用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门检定分发。 领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种，制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种，或为冻干毒种。 制造疫苗用的细胞大体为原代细胞和传代细胞两类，根据病毒种类、疫苗性质与工艺流程选择不同的细胞。 选择的依据包括：病毒的适应性高、毒价高、细胞来源方便、制备简单、生命力强。 如猪瘟兔化
45、弱毒牛睾丸细胞疫苗采用犊牛睾丸原代细胞；脊髓灰质炎活疫苗选择vero细胞；狂犬病弱毒细胞适应疫苗采取BHK21细胞增殖病毒等。（三）细胞制备（三）细胞制备 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备 培养细胞和增殖病毒用的营养液又称培养液，通常分为细胞培养用的生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的之处通常只是生长液内含有5%-10%的血清；维持液血清浓度为2%-5%。 不同细胞所需的营养成分和生长条件不尽相同。 目前常用的细胞培养方法为静止培养和转瓶培养，至于微载体培养和悬浮培养在我国尚处于试验之中。 （四）接毒与收获（四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步之分
46、，前者在细胞分装同时或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%-2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现70%-85%以上细胞病变时即可收获。 病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后供配苗用。 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备（五）配（五）配 苗苗 1 1灭活疫苗灭活疫苗 不同灭活剂
47、对不同病毒的作用也不同。向细胞毒液内按规定加入灭活剂，在一定的温度下作用一定的时间，有的灭活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。2 2冻干苗冻干苗 细胞毒液内按比例加入保护剂或稳定剂，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备流流程程图图3病病毒毒性性细细胞胞疫疫苗苗制制造造工工艺艺流流程程动物或胚胎动物或胚胎组组 织织毒毒 株株种种 毒毒灭活病毒灭活病毒消化鉴定培育培养检验检验配制原原 料料佐佐 剂剂传代细胞传代细胞配配 苗苗（混匀、乳化）（混匀、乳化）灭活疫苗灭活
48、疫苗细胞悬液细胞悬液生长细胞生长细胞配配 苗苗活疫苗活疫苗保护剂保护剂原原 苗苗分装、冻干分装、冻干分分 装装灭活原原 料料原原 料料细胞培养液细胞培养液配制剪碎种种 子子鉴定扩增收获配制灭菌病毒性动物组织疫苗制造病毒性动物组织疫苗制造 病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病毒的量却有很大的差异，利用病毒增殖迅速、含毒量高的组织制造的疫苗称为组织疫苗(tissue vaccine)。 动物组织疫苗包括动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。观察
49、与收获观察与收获观察与收获观察与收获动物选择动物选择动物选择动物选择配苗配苗配苗配苗种毒与接种种毒与接种种毒与接种种毒与接种（一）动物选择（一）动物选择 动物质量直接影响到组织疫苗的质量，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用，动物必须符合下列标准： (1)应该是清洁级(二级)以上的等级实验动物，即无规定的人兽共患性病原体动物； (2)应是对所接种病毒易感性高的动物，即在品种、年龄和体重方面合乎要求的实验动物。 种毒既可用抗原性优良、致死力强的自然毒株脏器组织毒或强毒株增殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。无论何种种毒都须经纯粹、抗原性和免疫原性检查合格后使用。 接种途径依病毒性质和目的而异，
50、例如猪瘟结晶紫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾淋毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内途径感染。 （二）种毒与接种（二）种毒与接种观察与收获观察与收获观察与收获观察与收获动物选择动物选择动物选择动物选择配苗配苗配苗配苗种毒与接种种毒与接种种毒与接种种毒与接种几种动物常用的接种途径如下： 1. 脑内注射：颅前后中线5mm平行线与瞳孔横线交叉处。 2. 静脉注射：家兔由耳静脉注入；鸡自翅下肢静脉注入。 3. 肌肉注射：选择腿部、胸部、臀部等肌肉丰满处注射。 4. 皮下注射：家兔和豚鼠可选择在腹部或后腿内注射。 5. 腹腔注射：家兔与豚鼠可选腹股沟处刺入腹腔。 动物在
51、接种感染后应每天观察和检查规定的各项指标，指标或项目因不同病毒而异。常规观察、检查的项目如食欲、精神和活动状态、体温、粪便、尿和血液变化等。 根据观察的征象和检查的结果选出符合要求的发病动物按规定方式剖杀，采取收集含毒量高的器官组织。如猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液制备；兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产；狂犬病疫苗利用发病羊的羊脑组织制造。（三）观察与收获（三）观察与收获观察与收获观察与收获观察与收获观察与收获动物选择动物选择动物选择动物选择配苗配苗配苗配苗种毒与接种种毒与接种种毒与接种种毒与接种1 1组织灭活疫苗组织灭活疫苗 采取收获的组织经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液
52、和灭活剂（甲醛、酚、结晶紫等）制成匀浆，然后按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活。如狂犬病疫苗配制按脑组织1:4加入含有甘油及1%酚蒸馏水，于360.5C灭活7天制成；猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份，结晶紫甘油溶液1份混合，于37C38C灭活68天。（四）制四）制 苗苗观察与收获观察与收获观察与收获观察与收获动物选择动物选择动物选择动物选择配苗配苗配苗配苗种毒与接种种毒与接种种毒与接种种毒与接种2. 弱毒组织疫苗弱毒组织疫苗 在无菌操作下剔除脏器上的脂肪与结缔组织等，称重后剪碎，加入适最保护剂制成匀浆，然后滤过扣除残渣量，再按滤液中的实际组织量计算稀释倍数，加入余量保护剂和青链霉素5001000
53、U(g/ml)，充分摇匀后置04C冷暗处处理一定时间后作无菌检验与毒价测定。合格者进行分装，冷冻真空干燥制成冻干疫苗。流流程程图图2病病毒毒性性组组织织疫疫苗苗制制造造工工艺艺流流程程动动 物物感染动物感染动物毒毒 株株种种 毒毒灭活病毒液灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原原 料料佐佐 剂剂配苗、乳化配苗、乳化灭活疫苗灭活疫苗含病毒组织含病毒组织含病毒悬液含病毒悬液配配 苗苗活疫苗活疫苗保护剂保护剂分装、冻干分装、冻干分分 装装灭活原原 料料种种 子子扩增收获配制纯化病毒悬液纯化病毒悬液接种乙肝疫苗是乙肝病毒的特异性抗体，最初乙肝疫苗是乙肝病毒的特异性抗体，最初由含有高滴度的由含有高滴度的乙肝表
54、面抗原乙肝表面抗原抗体的供者抗体的供者血清或血浆纯化而来。血清或血浆纯化而来。结构：完整的结构：完整的HBV颗粒（颗粒（ Dane颗粒），颗粒），呈球形，呈球形，42nm，具有双层衣壳，具有双层衣壳1.外衣壳（相当于包膜）：由脂质双层与外衣壳（相当于包膜）：由脂质双层与蛋白质组成蛋白质组成含有含有乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原（HBsAg） 多聚人血清白蛋白受体多聚人血清白蛋白受体（PHSAr）即吸附位点）即吸附位点 前前S抗原（抗原（Pre-S1.2）2.内衣壳内衣壳 20面体，含有面体，含有乙型肝炎核心抗原乙型肝炎核心抗原（HBcAg）乙型肝炎乙型肝炎e抗原抗原（HBeAg）3.核心：核心：DNA及及DNA聚聚合酶合酶
