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1、高通量药物筛选技术高通量药物筛选技术运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上方可以称为高通量筛选。分子生物学分子生物学细胞生物学细胞生物学基因组学基因组学蛋白组学蛋白组学生物信息学生物信息学结构生物学结构生物学计算机辅助药物设计计算机辅助药物设计药物化学药物化学高通量筛选高通量筛选技术技术天然产物天然产物化学合成化学合成组合化学组合化学化合物库化合物库筛选模型筛选模型结构优化结构优化先导化合物先导化合物筛选筛选药物发现的关键环节药物发现的关键环节高新技术集中的焦点高新技术集中的焦点The Evolut
2、ion of HTS高通量筛选的特点高通量筛选的特点快速快速-每天筛选上万药次每天筛选上万药次微量微量-筛选样品需要量为微克级筛选样品需要量为微克级灵敏灵敏-准确判断筛选样品的活性和选择性准确判断筛选样品的活性和选择性经济经济-筛选费用低筛选费用低高通量筛选的四个要素高通量筛选的四个要素样品制备样品制备自动化自动化HTS模型建立模型建立数据处理数据处理要素一：高通量筛选模型建立要素一：高通量筛选模型建立针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并使之适用于高通量筛选。选择高通量筛选的靶点选择高通量筛选的靶点来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键
3、的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。Current Drug TargetsMembrane Receptors45%Enzymes28%Hormones and Factors11%Ion Channels5%DNA2%Nuclear Receptors2%Unknown7%N = 483 J. Drews, Science (2000) 287:1962克隆克隆PCR、RT-PCR方方法从法从cDNA文库、文库、EST克隆、组织和克隆、组织和细胞的总细胞的总RNA中中得到关键靶基因得到关键靶基因亚克隆亚克隆大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫
4、表达系统大规模表达、大规模表达、纯化、复性，纯化、复性，得到纯净重组得到纯净重组蛋白蛋白时间光吸收E412nm =13,600 M-1cm-1检测方法的确检测方法的确定、优化及高定、优化及高通量筛选模型通量筛选模型的建立的建立分子水平筛选模型建立流程模型设计模型设计体外生化检测通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、受体、蛋白与蛋白的相互作用等细胞水平的检测主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测技术测量生物反应的终点。体外生化检测体外生化检测显色反应显色反应(Photometry)显色反应方法检测显色反
5、应方法检测MetAPMetAP活性活性显色反应方法检测显色反应方法检测MetAPMetAP活性活性以酶为靶点以酶为靶点以以酶酶为为靶靶点点进进行行的的高高通通量量筛筛选选的的优优化化及及标标准准化化涉涉及及以以下下几几个个步骤：步骤：确定反应条件（如缓冲液、确定反应条件（如缓冲液、pH、温度）、温度）天然或合成的底物的确定天然或合成的底物的确定酶动力学酶动力学信号窗口的评价信号窗口的评价对已知抑制剂的反应情况对已知抑制剂的反应情况底底物物转转变变为为产产物物后后，分分别别使使用用显显色色反反应应、荧荧光光或或放放射射性性化化学学的的方方法法等等。适适用用的的靶靶点点不不仅仅包包括括蛋蛋白白酶酶
6、、激激酶酶和和磷磷酸酸酯酯酶酶，也包括其它酶类，如也包括其它酶类，如DNA连接酶和解旋酶。连接酶和解旋酶。细胞水平检测细胞水平检测荧光成像检测荧光成像检测(FLIPR)贴贴壁壁细细胞胞或或悬悬浮浮细细胞胞中中Fluo-3的的荧荧光光强强度度，间间接接反反映映钙钙离离子子的的浓浓度度。在在FLIPR实实验验中中，可可以以用用96孔孔或或384孔孔板板对对多多个个样样品品同同时时检检测测，测测定定荧荧光光强强度度的的过过程程仅需仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。秒。可进行钙离子内流的动力学检测。FLIPR functional screening assayLGTPGDP PLCinosit
7、ol phosphatesCa2+Fluorescentdye+fluorescent signal要素二：化合物样品库制备要素二：化合物样品库制备结构多样性（结构多样性（Chemical diversity） 类药性（类药性（Drug-like)Lipinski规则规则MW 500 分子量ClogP 5 计算疏水常数H bond donors 5 H键供体H bond acceptors 10 H键受体Properties of an “Average” DrugUndesirable CompoundsUnstableReactiveMichael acceptorToxicLiquidG
8、eneral metal chelatorPolyaromaticmetallocompound筛选样品来源筛选样品来源传统化学合成、分离传统化学合成、分离合成化合物合成化合物分离的天然产物纯化合物和粗提物、有效部位分离的天然产物纯化合物和粗提物、有效部位组合化学合成组合化学合成从化合物数量和结构多样性上，充实供筛选的化合物从化合物数量和结构多样性上，充实供筛选的化合物库库与其他机构的合作、交换或购买与其他机构的合作、交换或购买传统化学合成和分离传统化学合成和分离单个合成、分步纯化 一个化学工作者一年合成化合物的数量从不足一百个特点：数量相对较少，但各化合物相关数据全，质量较高对特定的靶点SA
9、R明确，对一个全新靶点，这些知识有助于产生新的先导化合物发掘天然产物资源发掘天然产物资源大大自自然然是是另另外外一一个个能能提提供供具具有有结结构构多多样样性性小小分分子子有有机机化化合合物物的主要来源。的主要来源。经经典典方方法法-分分离离纯纯化化、结结构构鉴鉴定定、活活性性测测试试-费费时时、效效率率低低，远远远远不不能能满满足足现现代代高高通通量量筛筛选选的的需需要要。这这在在一一定定程程度度上上影影响响了了天天然然产产物物来来源源的的样样品品在在近近年年来来的的药药物物研研究究中受重视程度。中受重视程度。从从结结构构多多样样性性的的角角度度考考虑虑，大大自自然然可可能能给给予予我我们们
10、的的结结构构多多样样性性大大大大高高于于组组合合化化学学，因因而而天天然然产产物物或或天天然然来来源源的的样样品品的的重重要要性性不不容容忽忽视视。这这也也是是现现代代天天然然产产物物化化学学研研究究的新的切入点。的新的切入点。天然化合物库（天然化合物库（Nature Product Pool）尽尽管管许许多多天天然然产产物物在在一一些些特特定定生生物物模模型型上上被被筛筛选选过过，但但至至今今没没有有多多少少化化合合物物在在所所有有现现存存的的模模型型上上被被广广谱谱筛筛选选过过的的事事实实似似乎乎给给我我们们这这样样一一种种信信息息：随随着着新新的的药药物物筛筛选选模模型型的的不不断断涌涌
11、现现，一些已知的天然化合物可能会被发现具有全新的生物活性。一些已知的天然化合物可能会被发现具有全新的生物活性。天然产物对新药发现和开发的重要性天然产物对新药发现和开发的重要性天然产物，特别是植物中的天然产物作为药物用途的历史非常古老，为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？为什么最近制药企业又对来源于天然物的先导化合物产生了兴趣？为什么自然界能产生对人体疾病有效的为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？物质？化学家和生物化学家对次级代谢产物（所有非蛋白天然产物）的产生提出了六种主要的假设，Haslam归纳如下：1）次级代谢产物是无特定生理功能
12、的单纯排泄物；2）次级代谢产物曾经起过功能代谢作用，但目前其作用已失去；3）次级代谢产物是所有体内变化的产物，在生物体内没有任何真正的作用；4）次级代谢产物是进化过程中的一例，在新化合物产生之前，次级代谢物是为了保存进化所必需的物质而存在；5）次级代谢产物为初级代谢所不需要的酶提供发挥作用的场所，重要的是次级代谢过程，而不是次级代谢产物；6）次级代谢能产生防御物质和其他重要的生理活性物质，对生物体的生存具有重要作用。为什么为什么2020世纪后半叶对从天然产物寻找世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？新药失去了兴趣？20世纪70年代末兴起的组合化学的发展使得短期有效合成上万个化合物成为可能
13、；随着具有自动化系统的高通量筛选技术的发展，每天可以筛选50000个以上的样品，为组合化学合成的样品提供一种快速筛选方法；天然生理活性物质分离的复杂化和大量生物材料获得不易。天然产物研究的复活天然产物研究的复活天然产物研究的成功天然产物研究的独特性新筛选方法的影响根据新药的研发过程设计有效的天然产物研根据新药的研发过程设计有效的天然产物研究方法究方法天然材料的获得和提取有效的筛选方法天然生理活性物质的分离快速有效的结构解析方法生物学的评价天然生理活性物质的大量获得构效关系研究天然产物或其类似物作为药品实例天然产物或其类似物作为药品实例61% of 877 small molecule drug
14、s introduced worldwide during the period 1981-2002 can be traced to, or were inspired by, natural products. 洛伐他汀洛伐他汀 (Lovastatin)(HMG-CoA抑制剂）抑制剂）Compactin:R1=R2=HMevinolin: R1=CH3,R2=HSimvastin: R1=CH3,R2=CH3PravastatinFluvastatinCerivastinAtorvastin环孢菌素环孢菌素A（Cyclosporine A）真菌Trichoderma polysporum分
15、离抑制器官移植排异反应的免疫抑制剂紫杉醇紫杉醇(1 1, Paclitaxel, Taxol)是从太平洋红豆杉Taxus brevifolia树皮中提取分离得到的天然二萜化合物。多 西 紫 杉 醇 (2 2, Docetaxel, Taxotere)是在紫杉醇的结构修饰和改造过程中通过半合成方法得到的。2001年全世界紫杉醇年销售额在20亿美元以上，多西紫杉醇年销售额达到10亿美元以上。这两种药物已经成为当前，也是历史上最为畅销的抗癌药物。 喜树碱及其衍生物喜树碱及其衍生物Camptothecin R1=R2=R3=HTopotecan R1=H,R2=CH2N(CH3)2,R3=OHIrin
16、otecan R1=CH2CH3,R2=H,R3=(A)9-Aminocamptothecin R1=R3=H,R2=NH29-Nitrocamptothecin R1=R3=H,R2=NO2(A)喜树碱及其衍生物是DNA局所异构酶 (DNA toposomerase 抑制剂。吗啡生物碱吗啡生物碱Morphine,R=HCodeine,R=CH3Buprenorphone,活性为Morphine2550倍，成瘾性低于吗啡。Pentazocine,活性仅为吗啡的30，但成瘾性极低天然产物研究的未来利用组合化学合成“非天然的天然物”或“类天然产物库”多样性导向合成多样性导向合成 (diversit
17、y-oriented synthesis)Galanthamine 四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑制剂四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑制剂及高尔基及高尔基-质膜运输抑制剂质膜运输抑制剂Secramine A 的发现的发现Shair M D and Kirchhausen T. Nature chemical biology, 2006, 2: 39-462527 compounds were synthesizedCompound StorageSolidLong-term storageDMSO solutionLong-term storage (10 year?)Working s
18、olutionsCompound platesMother PlatesDMSO solutions from vendorsDaughter PlatesDMSO solutions1 mg/mlAssay PlatesAqueous solutions25 g/mL compound2.5% DMSO20 L80 Compounds352 Compounds88 CompoundsSample management technology化合物库是医药公司和研究机构最宝贵的资产。其数量和质量的重要性需要高可靠性的自动化储存和检索系统。专业的样品管理公司可提供整套的样品管理产品，包括：自动化的
19、储存系统大型系统可储存60,000,000样品。储存环境温度可达到-80 。自动化样品处理设备样品称量、溶解，微孔板间复制，封膜，Cherry picking。软件储存系统控制软件，样品管理系统软件。耗材微孔板，微试管，封膜，Barcode.Sample management technology瑞士Tecan公司的样品自动化储存系统产品Click to view the videoREMP Large-size storeTM (LSS)要素三：自动化要素三：自动化自动化技术的应用，提高筛选效率，摆脱人为误差因素微孔板（微孔板（Microplate） 微孔板（Microplate）是许多方法
20、和解决方案的最终决定因素。尽管近年来的芯片技术发展很快，但微孔板在生物医药研究中仍扮演着不可替代的角色。正是微孔板的应用使人们提出了将多个反应管以平行方式同时处理的概念，这些概念一定程度上大大促进了自动化筛选系统和工作站的快速发展。对于所有开发的仪器而言，微孔板是一个共同的标准，同时标准化的要求也增加了现代自动化系统的可靠性。其中，96孔板和384孔板都已经制定了相应的标准(Society of Biomolecular Screening task force Standards in Automation and instrumentation)。但是其他的高密度板，如864、1536、3
21、456，甚至9600孔板目前还没有统一的标准。这些标准或准标准板的使用已经大大地降低了筛选成本，同时增加了通量。 Microplates 微孔板是筛选的载体，其制造技术也随着筛选技术的发展而发展，包括：微孔板的颜色和材料微孔板微孔的设计和密度微孔板材料的表面处理Microplates from CorningMatrix of Wells864963841536 WellRowColumnVolume9681230038416241001536324810Microplates微孔板的颜色和材料颜色类型应用透明 光吸收检测不透明黑色：荧光检测白色：化学发光检测底部透明细胞实验，底部检测材料类型
22、应用聚苯乙烯（PS）疏水性，透明度高，多用于筛选板聚丙烯 （PP）化学稳定性高，适合化合物储存UV透射材料光吸收率低，适合UV检测Microplates微孔板微孔的设计和密度微孔板微孔密度的增加可以显著提高单位时间内筛选的通量。节约成本。提高筛选质量。微孔密度96孔384孔1536孔3456孔微孔容积75-250 mL20-100 mL2-10 mL1mLMicroplates微孔板材料的表面处理类型应用与生物分子无亲和力Corning公司NBSTM微孔板：均相生化测试与生物分子高亲和力非均相测试，例如：ELISA, DELFIA为细胞组织培养特别处理Corning公司的CelllBind微孔
23、板：提高细胞贴壁性多聚赖氨酸表面：超低细胞亲和力表面：降低细胞贴壁能力共价处理表面与DNA，碳链，巯基有特异的亲和力微孔板设备微孔板设备一般而言，一个自动化筛选系统的大多数组件总是围绕微孔板而工作的，它们均可称为微孔板设备。独立单元（Stand-alone）：指象洗板器、液体分配器（Liquid Dispenser）和酶标仪等工作站（Workstation）：能执行多重功能（通常指围绕微孔板）的部分， 如液体转移装置（Liquid Handling）可围绕微孔板执行多重功能History 1980s, Zymark世 界 上 第 一 台 工 作 站 是 由 Zymark公 司 开 发 的Ben
24、chmateTM系统，它集成了精密天平、单通道加液头、移液装置、振荡器和HPLC进样器等。通过一个机械臂可以将不同的容器从一个工作台移至另一个工作台，但这一系统主要是针对管形反应器设计而设计的，并不适用于今天的微孔板。第一台基于于微孔板设计的工作站是由Beckman Coulter开发的Biomek1000，它整合了单通道和多通道的吸液、加液、洗涤和单通道检测（密度测定）等组件部分。Biomek2000： 使用可变换工具后变得更加灵活，如不同的吸收器、分配器等。其特点是可以针对不同的需要设计不同的操作程序。BiomekFX：集成了更强大的功能，如多通道可同时、亦可执行不同的任务，双手臂操作则更
25、是增加了有效性和操作速度。Biomek 2000 Automation Workstation 自动化液体分配装置自动化液体分配装置检测系统检测系统UV-visible Light AbsorbanceFluorescenceFluorescence IntensityTime-resolved Fluorescence (TRF)Fluorescence Polarization (FP)LuminescenceRadioactivityMicroplate ReadersSpectraMax Plus 384 UV absorbanceContinuous 190 - 1000 nm, R
26、eads 96 wells, 5 sec; 384 wells,16 secSpectraMax Gemini XS Luminescence, fluorescence and time-resolved fluorescenceContinuous 250-850 nmRead 96 wells, 27 sec; 384 wells, 2 min 30 secVICTOR2 V Multi-label ReaderFilter-based instrumentFive technologies: Absorbance LuminescenceFluorescenceTime-resolve
27、d fluorescenceFluorescence polarizationMicroplate reader最新的微孔板检测器具备高速，高灵敏度，通用的特点。PerkinElmer公司的EnVision 检测器可以在36s内完成对一块1536孔板的荧光强度检测。整合了光吸收，荧光强度，荧光偏振，时间分辨荧光，化学发光，激光等多种检测手段。EnVision (PERKINELMER)Safire (TECAN)SpectraMax M5 (Molecular Devices)自动化系统自动化系统(Automated Robotic System)自动化系统是指集独立单元、工作站于一个特定的功能环境，由一种总系统软件控制，由一至二个机械臂完成微孔板在独立单元和工作站之间的转移工作。可重复编程的机械装置系统，能自动重复完成包括自动称量、液体转移、分离、仪器硬件的转移等。自动化系统的组成自动化系统的组成机器人控制器机械手伺服轨道外围设备微孔板设备：液体转移装置，培养箱，洗板器、液体分配器和酶标仪等高通量药物筛选技术高通量药物筛选技术
