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1、治疗性血管新生实验研治疗性血管新生实验研究的假设干进展究的假设干进展金金惠惠铭铭复旦大学上海医学院生理与病理生理学系复旦大学上海医学院生理与病理生理学系 上海上海 200032 200032，中国，中国治疗性血管新生实验研究治疗性血管新生实验研究的假设干进展的假设干进展治疗性血管新生的概念及现况治疗性血管新生的概念及现况一一.血管新生旁观分子对内皮细胞增殖的影响血管新生旁观分子对内皮细胞增殖的影响二二.生长因子对内皮细胞迁移的双相调节生长因子对内皮细胞迁移的双相调节三三.内皮细胞生长因子受体活性的动态变化内皮细胞生长因子受体活性的动态变化四四.血管内皮祖细胞血管内皮祖细胞治疗性血管新生的治疗性
2、血管新生的概念及现况概念及现况TherapeuticAngiogenesis治疗性血管新生治疗性血管新生 将外源性血管新生诱导因子导入缺血将外源性血管新生诱导因子导入缺血组织，增强缺血区毛细血管新生，从而组织，增强缺血区毛细血管新生，从而加速侧枝循环的形成。加速侧枝循环的形成。 主要用于治疗缺血性主要用于治疗缺血性( (心血管心血管) )疾病。疾病。Folkman,J肌肉注射肌肉注射局部灌注局部灌注A.V.滴注滴注渗透泵心腔外注入渗透泵心腔外注入病毒载体介导病毒载体介导局部注射局部注射基因埋线基因埋线基因治疗基因治疗脂质介导脂质介导球囊导管导入球囊导管导入转化细胞包被应用转化细胞包被应用质粒质
3、粒DNA介导介导冠脉内支架冠脉内支架蛋白治疗蛋白治疗VEGF治疗治疗细胞治疗细胞治疗治疗性血管新生常用的方法治疗性血管新生常用的方法细胞铺路细胞铺路CellularSpreading分子搭桥分子搭桥MolecularBridgingFolkmanJFromthelabtotheclinic:oneinvestigatorsjourneyJLaw,Medicine&Ethics2002,30(3):361366从实验室到临床从实验室到临床:一位科学家的旅行一位科学家的旅行一一. .血管新生旁观分子对血管新生旁观分子对内皮细胞增殖的影响内皮细胞增殖的影响Bystandermolecules(血管新
4、生血管新生)旁观分子旁观分子COX-2，PGE2，Integrins，etc.bEnd.3(200)经典途径经典途径bFGF-inducedproliferationofbEnd.3(MTT) -actinEffectofbFGFonCOX-2proteinexpressioninbEnd.3(WesternBlot)COX-2 0 4 8 16 32Time(h) 0 0.5 2.5 5 10 15 bFGF(ng/ml)ControlbFGFEffectofbFGF(10ng/ml)onCOX2proteinexpressioninbEnd.3(8h,ABCmethod,400X)GAPD
5、HCOX-1COX-20 1 2 3 6 12Time(h) 0 0.5 2.5 5 10 15 bFGF(ng/ml)EffectofbFGFonCOXmRNAexpressioninbEnd.3(RT-PCR)bFGF-inducedPGE2secretionofbEnd.3&effectofCOX-2inhibitoronit(ELISA)EffectsofCOX-2inhibitorandPGE2RantagonistonbFGF-inducedVEGFsecretioninbEnd.3bFGFEC增殖增殖VEGFCOX-2PGE2bFGFbFGF引起引起ECEC多途径增殖多途径增殖经
6、经典典途途径径旁路旁路途途径径 信号转换信号转换bFGF非特异性非特异性EC特异性特异性VEGF二二.生长因子对内皮细胞迁生长因子对内皮细胞迁移的双相调节移的双相调节EC划痕损伤模型划痕损伤模型ECscratchwoundmodel研究: 细胞迁移 ( cell migration)DynamicchangesofcellmigrationinducedbybFGFinculturedbEnd.3Left:bFGF(5g/L)Center:controlRight:bFGF(15g/L)0h24h48h内皮细胞体外划痕损伤模型中内皮细胞体外划痕损伤模型中bFGF对对细胞迁移的影响细胞迁移的影响
7、FocalAdhesionKinase粘着斑激酶粘着斑激酶FAKNBand4.1KinaseDomainFGFCPhosphorylationFAKTyr-397F.A.TY397ActivitiedFAKPGrowth Factor Receptor PTKsPro-1Pro-2FAKRasRafMEKERKCrkSOSSrcPaxillinCASGrb2PWAVE/ScarDOCK180RacPakASAGRAFMigrationGTPaseFAK含量含量051015( g/L)bFGF对血管内皮细胞中对血管内皮细胞中FAK含量的影响含量的影响(WesternBlot,12h)bFGF*P
8、0.05*FAK活性活性051015( g/ml)bFGF对血管内皮细胞中对血管内皮细胞中FAK活性的影响活性的影响(12h)*P0.050h6h12h510bp(FAK)510bp(FAK)510bp(FAK)450bp(GAPDH)450bp(GAPDH)450bp(GAPDH)1.o g./LbFGF2.5 g/L3.10 g/L4.15 g/L2.bFGF对对FAKmRNA表达的影响表达的影响(RT-PCR)内皮细胞生长因子受内皮细胞生长因子受体活性的动态变化体活性的动态变化三三.VEGF受体受体(Flk-1)在在心肌梗死大鼠心肌微血管内皮细心肌梗死大鼠心肌微血管内皮细胞上的表达胞上的
9、表达(免疫组化，免疫组化，ABC法法400 )A.梗死区梗死区B.梗死边缘梗死边缘C.非梗死区非梗死区D.对照心肌对照心肌ABCDExpressionchangesofbFGFR1afterratacutemyocardialinfarction(Real-timeRT-PCR,n=5)*#*#*#*#*#*#*/GEArrayTMQseriesMouseAngiogenesisGeneArray小鼠血管新生基因芯片小鼠血管新生基因芯片(SuperArray,U.S.A.)非梗死区非梗死区边缘区边缘区心肌梗死大鼠心肌细胞内血管新生心肌梗死大鼠心肌细胞内血管新生基因表达的变化基因表达的变化(Mi
10、cro-array)心肌梗死大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生诱心肌梗死大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生诱导因子受体基因表达的变化导因子受体基因表达的变化(1W)PositionGenebankGenenameControlExperiment14NM_010109EphrinAreceptor1.474E-12.170E-217NM_007912EGFR-0.000E-1-0.000E-129M33760FGFR10.004E-12.773E-430M81342FGFR38.731E-39.014E-431NM_008011FGFR42.816E+03.077E+033X59397Flk-1/KD
11、R1.199E+01.049E+034L07297Flt-1-0.000E-12.773E-359NM_011058pDGFR -0.000E-12.982E-360NM_008809pDGFR -0.000E-15.055E-276D13738Tie-2-0.000E-19.014E-481D28526TGF R1-0.000E-10.000E+082NM_009371TGF R22.834E-11.907E-2四四.血管内皮祖细胞血管内皮祖细胞(EndothelialProgenitorCell)磁性活化细胞分选系统磁性活化细胞分选系统MagneticactivatedCell-sorti
12、ngsystem(MACS)MicroBeads:50nm 用用MACS别离脐血中别离脐血中CD133+细胞模式图细胞模式图经磁珠别离的经磁珠别离的CD133+CD133+细胞培养细胞培养14d14d后细胞外表分子标后细胞外表分子标志志CD133CD133流式细胞仪鉴定结果流式细胞仪鉴定结果 (A:0d B:14d) (A:0d B:14d)ABDecreaseofcellmarkersCD133,CD34onadherentcellsandincreaseofFlk-1inthepresenceofVEGF,bFGFandSCFafter14daysofculture(P0.05).干细胞干
13、细胞血管内皮祖细胞血管内皮祖细胞造血干细胞造血干细胞内皮祖细胞，内皮细胞，造血干细胞内皮祖细胞，内皮细胞，造血干细胞循环循环CD34+内皮祖细胞，内皮细胞内皮祖细胞，内皮细胞CD34+,Flk-1+内皮祖细胞内皮祖细胞CD34+,Flk-1+,AC133+培养培养内皮细胞内皮细胞CD34+,Flk-1+,AC133 本课题受本课题受国家国家“十五十五“211“211工程工程重点学科建设基金重点学科建设基金资资 助助参加本课题的研究人员参加本课题的研究人员乐乐 飞飞 张国平张国平 王新红王新红 梁光波梁光波 张张 威威 史连国史连国 曲晓义曲晓义 钱睿哲钱睿哲Angiogenesisinduciblefactors:VEGFetc.TostimulateproliferationofEC Angiogenesis inhibited factors: Angiostatin etc. To inhibit proliferation of ECAsianMicrocirculationaward血管新生诱导因子血管新生诱导因子血血管管内内皮皮细细胞胞增增殖殖、迁迁移移、管腔形成管腔形成新生血管形成新生血管形成血管基底膜降血管基底膜降解、血管外基解、血管外基质重塑质重塑血管新生的过程血管新生的过程
