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1、 Gen-Probe分枝杆菌快速检测仪分枝杆菌快速检测仪样本样本显微镜显微镜 (Ziehl.)敏感性低敏感性低培养培养培养培养敏感性高敏感性高2 到到8 周周改良罗氏培养基改良罗氏培养基 Coletsos液态培养基液态培养基(MGIT, Bactec, BacT Alert.)鉴定鉴定鉴定鉴定生化检测生化检测实验条件苛刻实验条件苛刻, 需数天需数天(Reference center)目视检测目视检测准确低准确低MTD2.5小时小时敏感性高敏感性高 特异性强特异性强Accuprobe 1 小时小时简单简单- 准确准确 分枝杆菌分枝杆菌 :用用Gen-Probe 产品检测程序和时间产品检测程序和时
2、间Gen-Probe检测分枝杆菌试剂类型检测分枝杆菌试剂类型l扩增扩增+杂交检测结核分枝杆菌复合菌杂交检测结核分枝杆菌复合菌: AMPLIFIED MTD ( Gen-Probe) 临床痰标本临床痰标本(涂阳或涂阴涂阳或涂阴)l杂交检测分枝杆菌杂交检测分枝杆菌: ACCUPROBE Gen-Probe 培养阳性标本培养阳性标本 (菌落或肉汤菌落或肉汤)MTD (AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct) 检测检测结核分枝杆菌复合菌结核分枝杆菌复合菌结核分枝杆菌复合菌结核分枝杆菌复合菌: : : : M.tuberculosisM.tuberculo
3、sis 结核分枝杆菌结核分枝杆菌M.bovisM.bovis 牛分枝杆菌牛分枝杆菌 M.bovisM.bovis BCG BCG 牛分枝杆菌牛分枝杆菌BCGBCGM.africanumM.africanum 非洲分枝杆菌非洲分枝杆菌 M.microtiM.microti 田鼠分枝杆菌田鼠分枝杆菌 M.canettiM.canetti 卡氏分枝杆菌卡氏分枝杆菌Gen-Probe MTD检测检测4以以16S rRNA 为靶为靶核酸核酸4TMA ：转录介导扩增转录介导扩增4 HPA：杂交保护分析杂交保护分析RNA与与 DNAl DNA非常稳定，在死亡生物内也可存在非常稳定，在死亡生物内也可存在双链结
4、构双链结构l RNA只存在于活细胞只存在于活细胞非常脆弱非常脆弱 (RNA容易受破坏容易受破坏)单链结构单链结构结核菌核酸结核菌核酸lRNARNA是是DNADNA的的4-54-5倍倍lrRNArRNA占占80%80%Gen-Probe 扩增扩增l3 个主要步骤个主要步骤 标本处理标本处理标本处理标本处理 释放释放 rRNA TMA TMA rRNA 扩增物扩增物 HPAHPA 检测扩增物检测扩增物检测扩增物检测扩增物超声波裂解超声波裂解样品样品细胞溶解细胞溶解目标目标 rRNA 释放释放TMA转录介导扩增转录介导扩增l2条引物：条引物： l2种酶：种酶： *逆转录酶逆转录酶(双功能双功能:逆转
5、录和逆转录和RNAse H酶酶) (RNAse H：一种核糖核酸内切酶，特异性水解一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNADNA：RNARNA杂交链上杂交链上RNARNA链的磷酸二酯链的磷酸二酯键，产生键，产生55核苷酸，该酶对单链核酸、双链核苷酸，该酶对单链核酸、双链DNADNA或双链或双链RNARNA没有作用没有作用) ) *RNA聚合酶聚合酶l等温扩增：等温扩增：42引物引物引物引物1 1靶靶靶靶rRNArRNARTRTDNADNARNARNARNAseRNAse H H 作用作用作用作用DNADNART引物引物引物引物2 2DNA DNA 模板模板模板模板RNA 合成酶RNA RNA 扩增
6、物扩增物扩增物扩增物 100-1000 100-1000 拷贝拷贝拷贝拷贝 RT引物引物引物引物2 2RNAseRNAse H H 作用作用作用作用RT引物引物引物引物1 1逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶TMA原理原理敏敏 感感 10 000 拷贝拷贝rRNACA TATA TG CG CA TT AA TCGT AG CG CG CA TATG CT AC GT ADNARNA RNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶( (egeg : : E.coliE.coli) )扩增产物检测：扩增产物检测：HPA技术技术lHPA：杂交保护分析技术杂交保护分析技术 标记标记丫啶酯（丫啶酯（Acridiniu
7、m ester）的）的DNA 探针与探针与 RNA 扩增产物杂交，形成扩增产物杂交，形成DNA：RNA双螺旋结构双螺旋结构保护荧光物保护荧光物丫啶酯丫啶酯不被选择试剂淬灭（水解）。不被选择试剂淬灭（水解）。AEHPA 步骤步骤l丫啶丫啶酯标记的特异酯标记的特异 DNA探针与探针与RNA扩增物杂交扩增物杂交l使用生化水解方法，分离杂交及未杂交探针使用生化水解方法，分离杂交及未杂交探针l检测：化学发光检测检测：化学发光检测 试剂试剂1：0.001N硝酸中含硝酸中含0.1%过氧化氢；过氧化氢； 试剂试剂2：1N NaOH杂杂 交交AE6060杂交杂交rRNA探针探针AEAEAEAEAEAEAE杂交温
8、度的影响杂交温度的影响606061615959AEAEAE非特异结合非特异结合非特异结合非特异结合无杂交无杂交无杂交无杂交假阴性高假阴性高假阴性高假阴性高假阳性高假阳性高假阳性高假阳性高选选 择择6060选择试剂选择试剂选择试剂选择试剂AEAEAEAEAEAEAEAECH3N+OORH2O2 / OH-light检检 测测敏敏 感感 度度 比比 较较化学发光化学发光10-19 mole辐射同位素辐射同位素 10-18 mole荧光荧光 10-12 mole比色比色 10-9 mole总总 结结l靶核酸靶核酸: rRNAl等温扩增，等温扩增，2种酶是关键（逆转录酶种酶是关键（逆转录酶(RNAse
9、 H)、RNA 聚聚合酶）合酶）l扩增原理：扩增原理：TMA（转录介导扩增）（转录介导扩增）l液相杂交：液相杂交：HPA（杂交保护分析）（杂交保护分析）l化学发光法：检测杂交信号化学发光法：检测杂交信号MTD 方法方法STEP1：标本预处理：标本预处理 超声波降解标本超声波降解标本STEP2：扩增：扩增 (TMA) 扩增试剂扩增试剂, 石腊油，经过预处理的标本石腊油，经过预处理的标本-消化消化 95 , 15 分钟，水浴分钟，水浴 42 , 5 分钟分钟-加入酶试剂，扩增加入酶试剂，扩增 42 , 30 分钟分钟STEP3：探测：探测 ( HPA) 加入探针试剂加入探针试剂-杂交杂交 60,
10、15 分钟分钟-选择选择 60 , 15 分钟分钟-在发光仪读数在发光仪读数扩增扩增扩增扩增 : TMA: TMA加入试管加入试管加入试管加入试管 : :扩增试剂扩增试剂, 石腊油石腊油 经过预处理的标本经过预处理的标本 消化消化消化消化 95 , 15 分钟分钟 水浴水浴水浴水浴 42 , 5 分钟分钟加入加入加入加入 酶试剂酶试剂酶试剂酶试剂扩增扩增扩增扩增 42 , 30 分钟分钟 标本预处理标本预处理标本预处理标本预处理 : :准备并（超）声波降解标本准备并（超）声波降解标本探测探测探测探测 : HPA: HPA加入探针试剂加入探针试剂杂交杂交杂交杂交 60, 15 分钟分钟选择选择 60 , 15 分钟分钟在发光仪读数在发光仪读数
