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1、实验5 5 限制性限制性酶切分析切分析 一一. 实验目的目的 经过本本实验了了解解限限制制性性内内切切酶的的作作用用原原理理，限限制制性性酶切切技技术及及限制性限制性酶切切图谱的分析方法。的分析方法。 二二. 实验原理原理限限制制性性内内切切酶是是一一类能能识别并并切切割割双双链DNA分分子子中中特特定定核核苷苷酸酸序序列的核酸内切列的核酸内切酶。 限制性限制性酶切反响体系的切反响体系的组成成1，DNA2，缓冲液冲液提供限制性提供限制性酶作用所需的离子作用所需的离子浓度及种度及种类；提供限制性；提供限制性酶作用所需的作用所需的 pH值3，限制性内切，限制性内切酶限制性限制性酶切切图谱的分析的分
2、析DNA在限制性在限制性酶切后往往会构成多条片段，切后往往会构成多条片段，从片段的数量和大小大致可以推断从片段的数量和大小大致可以推断DNA限限制性制性酶切位点的多少及相切位点的多少及相对位置。位置。我我们往往利用往往利用DNA分子量分子量Marker读出出酶切切片段的大小。片段的大小。DNA分子量分子量Marker100 bp Marker 100 bp Marker 三三. 实验方法方法1在在0.5 ml 离离心心管管中中混混和和如如下下试剂()：DNA： 2 l10酶切切缓冲液：冲液： 2 l无菌水：无菌水： 14 lHindIII： 1 lEcoRI 1 l237水浴水浴 45 min
3、 2 2 2 2在在在在0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 离心管中混和如下离心管中混和如下离心管中混和如下离心管中混和如下试剂试剂(20l)(20l)(20l)(20l)：PUC19 2lPUC19 2lPUC19 2lPUC19 2l10101010酶酶切切切切缓缓冲液：冲液：冲液：冲液： 2 l 2 l 2 l 2 l无菌水：无菌水：无菌水：无菌水： 14 l 14 l 14 l 14 lHindIIIHindIIIHindIIIHindIII： 1 l 1 l 1 l 1 lEcoRI 1 lEcoRI 1 lEcoRI 1 lEcoRI 1 l2 2 2 2373
4、73737水浴水浴水浴水浴 45 min 45 min 45 min 45 min 3 3 3 3取取取取10l10l10l10l反响液，反响液，反响液，反响液，1 1 1 1琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳泳泳检测检测，同同同同时时以以以以 DNA DNA DNA DNAEcoRI/HindIIIEcoRI/HindIIIEcoRI/HindIIIEcoRI/HindIII作作作作为为分子量分子量分子量分子量MarkerMarkerMarkerMarker4.4.4.4.记录实验结记录实验结果：果：果：果：对对照分子量照分子量照分子量照分子量MarkerMarkerMarkerMarker，记录记录所所所所得片段的数量和大小，并分析得片段的数量和大小，并分析得片段的数量和大小，并分析得片段的数量和大小，并分析 DNA DNA DNA DNA有几个有几个有几个有几个HindIIIHindIIIHindIIIHindIII酶酶切位点切位点切位点切位点
