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1、实验七实验七人体性染色质小体的人体性染色质小体的观察观察20092009年年年年1111月月月月一、实验目的u掌握人体性染色质的检测方法； u观察人体性染色质的形态特征及存在部位；为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件；u了解雌性哺乳动物X染色体失活假说和剂量补偿效应的机制。 1949年年M.L.Barr等等研究发现雌猫神经细胞研究发现雌猫神经细胞核膜核膜内凝缩的深染小体内凝缩的深染小体性染色质体性染色质体(sex-(sex-chromatin body)chromatin body)或或巴氏巴氏小体小体(Barr body)(Barr body)，而，而雄性个体细胞中则没有。雄性个体
2、细胞中则没有。 进一步研究发现：所有进一步研究发现：所有哺乳类雌体细胞中都哺乳类雌体细胞中都可可以见到这一结构以见到这一结构。二、实验原理 巴氏小体巴氏小体是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态（染色质高度螺旋化），形成直径约1m，贴近于核膜边缘的染色小体。 细胞分裂间期 细胞核中出现异固缩现象：浓缩、染色深、无活性； 细胞分裂期 可形成正常的染色体形态；复制时间比有活性的X染色体稍迟一些。Barr小体的数目=n-1（n为X染色体数目）正常女人的体细胞间期核中Barr小体为1；正常男人的体细胞间期核中Barr小体为0；XXX女人的体细胞间期核中Barr小体为2；XXX
3、X女人的体细胞间期核中Barr小体为3。v为什么正常男女之间的为什么正常男女之间的X染色质存在差异？染色质存在差异？v为什么女性两个为什么女性两个X染色体上的每个基因座的两染色体上的每个基因座的两个等位基因所形成的产物，不比只有一个个等位基因所形成的产物，不比只有一个X染染色体半合子男性的相应基因产物多？色体半合子男性的相应基因产物多？v为什么某一为什么某一X连锁的突变基因在纯合子女性的连锁的突变基因在纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？病情并不比半合子的男性严重？ 定义定义：具有两份或两份以上的基因量的个体与只有一份基因量的个体的基因表达趋于一致的遗传效应。 举例举例：雌性哺乳动物一条X
4、染色体异染色质化（失活），只有一条X染色体具有活性，使雌雄动物虽然X染色体数目不同但基因产物的剂量是平衡的。 补偿方式补偿方式 剂量补偿效应（dosage compensation effect）哺乳动物哺乳动物 X染色体随机失活或父源染色体随机失活或父源X染色体失活染色体失活有袋动物有袋动物 父源父源X染色体失活染色体失活黑腹果蝇黑腹果蝇 雄性个体雄性个体X染色体基因表达水平加倍染色体基因表达水平加倍秀丽线虫秀丽线虫 雌性个体两条雌性个体两条X染色体基因表达水平减半染色体基因表达水平减半染色质染色质常染色质常染色质：折叠程度低，处于伸展状态，染色时着色浅。DNA主要是单 一序列和中度重复序列
5、。处于常染色质状态是基因转录的必要条件。异染色质异染色质折叠程度高，处于凝缩状态，染色时着深。 组成型异染色质：组成型异染色质：除复制期外，均处于凝缩状态，处于中期染色体的着丝粒区、端粒、次缢痕等节段。具有明显的遗传惰性，不转录也不编码蛋白。兼性异染色质：兼性异染色质：指某些细胞或某一发育阶段，原来的常染色质凝缩失去基因转录活性而成。雌性哺乳动物一条X染色体异染色质化，在上皮细胞中形成巴氏小体、在多核白细胞中形成“鼓槌”。莱昂假说(Lyon hypothesis)(Lyon hypothesis)v1961年，Mary Lyon 提出了X染色体失活的假说。其实验依据是对小鼠X连锁的毛色基因的遗
6、传学观察，发现雌性小鼠毛色杂合体不表现显性性状，也不是中间类型，而是显性隐性两种颜色嵌合组成斑点状（不是共显性）。而雄性小鼠却从不表现斑点状毛色，而是显性或隐性单一颜色的毛色。 内容：内容： 巴氏小体是一条失活的X染色体；哺乳动物雌性个体两条X染色体的其中一条在受精后失活； 两条X染色体中哪一条失活是随机的；在同一哺乳动物的体细胞中，有些父源X染色体失活，有些为母源失活。 失活在胚胎早期发生(人类在胚胎发育16天时)，失活的X染色体在以后分裂中不会复活；当生殖细胞形成时，失活的染色体可恢复。 杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体。 证据：证据：1 1）玳瑁猫毛皮上的黑色和黄色班块）玳瑁猫毛皮上
7、的黑色和黄色班块X XO OX Xo o 2 2）人类葡萄糖）人类葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶活性测定磷酸脱氢酶活性测定GdA/GdBX染色体失活的机制染色体失活的机制 X染色体上都存在与失活有关的染色体上都存在与失活有关的Xic（X染色体失活中心）位点，染色体失活中心）位点，Xic位位点的丢失会影响萊昂化，胚胎不能存活。点的丢失会影响萊昂化，胚胎不能存活。X染色体失活分起始、维持、扩散染色体失活分起始、维持、扩散3个阶段。个阶段。X染色体失活只是部分失活，在失活染色体的染色体失活只是部分失活，在失活染色体的Xic位点上发现有活位点上发现有活性的基因（性的基因（XIST）。）。Xic的失活作用的
8、失活作用XIST基因的表达基因的表达X-染色质的形态特征及所在部位：染色质的形态特征及所在部位： X-染色质的形态表现为一结构染色质的形态表现为一结构致密的浓染小体；轮廓清楚；大小致密的浓染小体；轮廓清楚；大小11.5m；常附着于核膜边缘或常附着于核膜边缘或靠近内侧；形状为凸形、三角形、靠近内侧；形状为凸形、三角形、卵形、短棒及双球形等。卵形、短棒及双球形等。 正常女性口腔黏膜细胞中出现正常女性口腔黏膜细胞中出现率：率：30 50%。巴氏小体巴氏小体v1、器材： 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、牙签、解剖针等。v2、试剂： 改良苯酚品红、60%醋酸、45%冰醋酸、95%乙醇v3、实验材料： 女生
9、口腔黏膜细胞（男生为对照）；女生毛囊细胞（男生为对照）三、实验用品1、口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察、口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察（1）取干净载玻片，用记号笔在将涂细胞的一面右上）取干净载玻片，用记号笔在将涂细胞的一面右上角做好标记；角做好标记；（2）嗽口（三次），尽可能除去口中杂物；）嗽口（三次），尽可能除去口中杂物；（3）用牙签刮取颊部粘膜上皮细胞，弃第一次刮取物，用牙签刮取颊部粘膜上皮细胞，弃第一次刮取物，在同一部位继续刮取；在同一部位继续刮取；（4）将刮得的细胞涂在干净载玻片上，反复几次，使）将刮得的细胞涂在干净载玻片上，反复几次，使玻片上的材料尽可能多些（每人做玻片上的材料尽可能多些（
10、每人做2 2张，张，1 1张女生的，张女生的，1 1张男生的）；张男生的）；（5）空气中干燥；）空气中干燥；（6）涂片区滴上）涂片区滴上100100l的的60%60%冰醋酸固定冰醋酸固定5 5分钟；分钟；（7）吸去冰醋酸，滴）吸去冰醋酸，滴2020l改良苯酚品红染色改良苯酚品红染色2 2分钟；分钟；（8）压片；）压片；（9）镜检。）镜检。 四、实验操作 拔取带毛囊头发拔取带毛囊头发一段一段, ,置于载玻片上置于载玻片上滴滴100100l 45%45%乙乙酸解离酸解离5 5分钟后，吸分钟后，吸掉乙酸掉乙酸解剖针剥解剖针剥取外层毛囊细胞，取外层毛囊细胞，在载玻片上将组织在载玻片上将组织细胞均匀摊平
11、细胞均匀摊平晾晾干干滴上滴上100100l 改改良苯酚品红良苯酚品红染色染色1010分钟分钟吸去染液，吸去染液，滴滴100100l 95% 乙醇乙醇分色，分色，1分钟后吸掉分钟后吸掉压片压片镜检镜检 2、发根细胞巴氏小体观察、发根细胞巴氏小体观察vX-染色质的辨认：染色质的辨认： 低倍镜下检出典型的可数细胞的标准：低倍镜下检出典型的可数细胞的标准： 核质是网状或细颗粒状分布；核质是网状或细颗粒状分布； 核膜清晰、核无缺损；核膜清晰、核无缺损； 染色适度；染色适度； 周围无杂菌。周围无杂菌。 在高倍镜或油镜下进一步观察。在高倍镜或油镜下进一步观察。 注意：在女性间期细胞核内侧靠近核膜处有约1微米
12、大小的反光极强的颗粒状亮点，即为巴氏小体。材料不同，观察结果可能有不同，且必须和核仁区别开来（核仁往往离核膜较远或接近核中央部位）。v刮口腔上皮细胞前要漱口；v涂片略干再加改良苯酚口红；v染色时间不要太长，否则核质着色深，X染色质体不易区分；v毛囊细胞要充分解离，压片前可先用解剖针敲片，使细胞解离。五、注意事项l分别观察男女各50个可数细胞，计算显示X染色质所占百分比。（正常女性口腔粘膜细胞中约3050%有一个巴氏小体，男性则低于12%。）l观察中选绘45个典型细胞，示明X染色质体的形成和部位。l正常男人的染色体组成是44+XY，而正 常女人的染色体组成是44+XX，请按要求填写下列表格：六、
13、作业 （实验结果）Barr小体小体 性别表现性别表现 性染色体的性染色体的 体细胞中体细胞中 数目数目 组成情况组成情况 染色体总数染色体总数 0 正常男人正常男人 0 有缺陷的女人有缺陷的女人 1 有缺陷的男人有缺陷的男人 1 正常女人正常女人 2 有缺陷的男人有缺陷的男人 2 有缺陷的女人有缺陷的女人 3 有缺陷的男人有缺陷的男人 3 有缺陷的女人有缺陷的女人v1、什么是剂量补偿效应？v2、为什么巴氏小体一般出现在核膜边缘？v3、巴氏小体在人类遗传学工作中有什么用途？七、思考题固体废弃物丢到水槽旁的废物桶中！固体废弃物丢到水槽旁的废物桶中！每组同学：每组同学：请在实验后用请在实验后用擦镜纸
14、擦镜纸把镜头擦净；如使用把镜头擦净；如使用高高倍镜倍镜，则立即用擦镜纸蘸，则立即用擦镜纸蘸二甲苯二甲苯将镜头和载玻片擦将镜头和载玻片擦净，以免污染镜头。登记净，以免污染镜头。登记显微镜使用记录本，显微镜使用记录本，到助教到助教处登记实验记录。把桌面整理好，处登记实验记录。把桌面整理好，最后最后经助教检查桌经助教检查桌面后方可离开面后方可离开! 通常将香柏油和二甲苯装在双层瓶中，香柏油装在通常将香柏油和二甲苯装在双层瓶中，香柏油装在上层狭长小瓶中，其中有一小玻璃棒，用于蘸取香柏上层狭长小瓶中，其中有一小玻璃棒，用于蘸取香柏油；二甲苯装于下层瓶中，用装香柏油的小瓶底部蘸油；二甲苯装于下层瓶中，用装香柏油的小瓶底部蘸取。使用时不要把两者搞混，取。使用时不要把两者搞混，注意不要打翻瓶子！注意不要打翻瓶子！ 值日的同学：值日的同学：把废物桶中垃圾集中倒入门口的大垃圾框把废物桶中垃圾集中倒入门口的大垃圾框中，并清扫实验室。中，并清扫实验室。
