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1、第十二章第十二章 液相色谱用填充材料液相色谱用填充材料- -羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石( (hydroxyapatite, HAPhydroxyapatite, HAP) )-一种一种胶体磷酸钙胶体磷酸钙，广泛存在于人体，广泛存在于人体和牛乳中，人体内主要分布于骨骼和牙齿中，和牛乳中，人体内主要分布于骨骼和牙齿中，牛乳内主要分布于酪蛋白胶粒和乳清中。牛乳内主要分布于酪蛋白胶粒和乳清中。实质上是一种高度交错聚合的高分子实质上是一种高度交错聚合的高分子磷酸磷酸钙聚合物钙聚合物，其，其分子式为分子式为 CaCa1010(PO(PO4 4) )6 6(OH)(OH)2 2，其中，其中钙磷
2、元素摩尔比值为钙磷元素摩尔比值为1.671.67。在骨骼和牙齿中，。在骨骼和牙齿中，钙和磷又主要以胶体磷酸钙结晶形态存在，并钙和磷又主要以胶体磷酸钙结晶形态存在，并和胶原蛋白质共同构成复杂的网络结构。和胶原蛋白质共同构成复杂的网络结构。其材料本是其材料本是骨骼和牙齿等生物硬组织骨骼和牙齿等生物硬组织的的主要主要无机成分无机成分, ,与生物组织与生物组织有特异性的有特异性的亲和力和相容性亲和力和相容性。实验研究表明，实验研究表明，HAPHAP纳米粒子对肝癌、胃癌、骨肉纳米粒子对肝癌、胃癌、骨肉瘤等多种癌细胞的生长具有不同程度的抑制作用。瘤等多种癌细胞的生长具有不同程度的抑制作用。10001000
3、元元/ /公斤公斤胶体磷酸钙应用范围较广胶体磷酸钙应用范围较广，涵盖乳品、，涵盖乳品、饮料、糖果、烘焙食品及钙片等各种需要进行饮料、糖果、烘焙食品及钙片等各种需要进行钙强化的食品。钙强化的食品。在天然食品中，以鲜奶等乳制品的含钙量最高，如果在天然食品中，以鲜奶等乳制品的含钙量最高，如果完全从这些食品中获取钙质，最大的问题就是必须摄入大完全从这些食品中获取钙质，最大的问题就是必须摄入大量食物才能得到所需的钙质，同时会摄入大量的热量和脂量食物才能得到所需的钙质，同时会摄入大量的热量和脂肪，因此，摄取高钙食品是补充钙质的最好方式。肪，因此，摄取高钙食品是补充钙质的最好方式。胶体磷酸钙的钙含量为胶体磷
4、酸钙的钙含量为24% 24% ，鲜奶一般的钙，鲜奶一般的钙含量为含量为 100mg/100ml 100mg/100ml ，再额外添加，再额外添加 0.1g 0.1g /100ml /100ml 的胶体磷酸钙，奶制品的成品钙含量即的胶体磷酸钙，奶制品的成品钙含量即可达到可达到 120mg/100ml 120mg/100ml ，达到高钙牛奶的要求。，达到高钙牛奶的要求。一、基本概念一、基本概念羟基磷灰石羟基磷灰石是一种是一种弱阳离子或弱弱阳离子或弱阴离子交换层析材料阴离子交换层析材料。优点优点: :能精确地分离、纯化结构能精确地分离、纯化结构上只有微小差别的生物大分子上只有微小差别的生物大分子。二
5、、二、HAPHAP的性能的性能1.1.高机械强度高机械强度: :可以耐受可以耐受15MPa15MPa以上压力以上压力, ,陶瓷陶瓷HAPHAP可可以耐受几十以耐受几十MPaMPa的压力。的压力。2.2.高柱效高柱效: :球形球形HAPHAP颗粒大小、形状及孔隙大小均适合颗粒大小、形状及孔隙大小均适合HPLCHPLC的要求，其颗粒及孔径小，有比较高的柱效。的要求，其颗粒及孔径小，有比较高的柱效。3.3.化学和热稳定性化学和热稳定性: :是磷酸钙盐中最稳定的是磷酸钙盐中最稳定的, ,在中在中性和碱性水相中非常稳定性和碱性水相中非常稳定, ,溶解度很低溶解度很低, ,热稳定性很高热稳定性很高, ,可
6、采用高温制备方法生产。可采用高温制备方法生产。4.4.低的非可逆性吸附低的非可逆性吸附: :HAPHAP有非常低的非可逆性吸附。有非常低的非可逆性吸附。5.5.表面修饰性表面修饰性: :HAPHAP表面比较容易进行各种化学修饰。表面比较容易进行各种化学修饰。三、三、HAPHAP制备方法制备方法 （一）（一）通常有通常有干法、水热法和湿法。干法、水热法和湿法。 在正常条件下，填料粒度在正常条件下，填料粒度2020m m时，干法时，干法填充制备柱较为合适；颗粒填充制备柱较为合适；颗粒2020m m时，湿时，湿法填充较为理想。法填充较为理想。 用于色谱的用于色谱的HAPHAP制备以制备以湿法湿法为主
7、。为主。1.1.片状片状TiseliusTiselius型型HAPHAP的制备的制备: : 因人而得名，因人而得名，即以即以钙盐或氢氧化钙与碱金钙盐或氢氧化钙与碱金属磷酸盐属磷酸盐, ,磷酸铵或磷酸磷酸铵或磷酸在水溶液中控制在水溶液中控制反应条件结晶而成反应条件结晶而成不规则的片状晶体不规则的片状晶体。CaCa化合物化合物P P化合物化合物转型转型反应反应羟基磷灰石羟基磷灰石问题问题：晶体不规则：晶体不规则易碎易碎颗粒颗粒大小波动大小波动色谱柱的填充状态改变色谱柱的填充状态改变柱效降低柱效降低重复性变差。重复性变差。如何解决？如何解决？日本人的专利日本人的专利-制造均匀制造均匀HAPHAP颗粒
8、颗粒以以CaHPOCaHPO4 4.2H.2H2 2O O晶体颗粒为先导物质，晶体颗粒为先导物质，在高于其脱水温度和相变温度，而不致于在高于其脱水温度和相变温度，而不致于发生分解的条件下加热，发生分解的条件下加热，首先脱水相变为首先脱水相变为CaHPOCaHPO4 4，然后用，然后用碱处理再转变成晶体碱处理再转变成晶体H HAPAP，它大小较均匀，约它大小较均匀，约1-3um1-3um厚，数微米大小。厚，数微米大小。2.2.粒状粒状HAPHAP的制备的制备: :二次造粒二次造粒: :首先制备首先制备HAPHAP微晶（微小针棒状）微晶（微小针棒状）, ,然后采用然后采用喷雾法进行造粒喷雾法进行造
9、粒( (在适当黏结剂存在下在适当黏结剂存在下, ,喷雾干燥喷雾干燥HAPHAP微粒悬浮物成为球粒微粒悬浮物成为球粒) )。克服易碎克服易碎-微晶聚集成球形颗粒微晶聚集成球形颗粒CaCa化合物化合物P P化合物化合物造 粒造 粒二 次 粒 子 ：二 次 粒 子 ： 1 1 1 0 0 u m1 0 0 u m ； 孔 径 ：； 孔 径 ： 8 08 0 9 0 n m9 0 n m反 应反 应一 次 粒 子一 次 粒 子 0 0 1 u m1 u m羟基磷灰石羟基磷灰石喷雾热解技术喷雾热解技术: :硝酸钙和磷酸的甲醇硝酸钙和磷酸的甲醇溶液在溶液在80080014001400o oC C之内高温喷
10、雾热解之内高温喷雾热解制备球形颗粒。制备球形颗粒。图图4 4 不同温度煅烧不同温度煅烧HAHA粉末的粉末的TEMTEM照片照片, , (a) 750, (b) 900(a) 750, (b) 900 (a)(b)（二）制备球形羟基磷灰石的新方法（二）制备球形羟基磷灰石的新方法1.1.复合球形羟基磷灰石复合球形羟基磷灰石2.2.直接合成球形羟基磷灰石直接合成球形羟基磷灰石CaCa化合化合物物P P化合化合物物微晶微晶生成生成复合成复合成球球CaCa化合化合物物P P化合化合物物微球微球生成生成HAPHAP的色谱机理的色谱机理是一种弱离子交换色谱是一种弱离子交换色谱, ,实验结果表明其实验结果表明
11、其对对DNADNA、多肽、蛋白质的分离机理合乎离、多肽、蛋白质的分离机理合乎离子交换色谱的机理。子交换色谱的机理。HAPHAP的色谱机理可能包括以下几个方面的色谱机理可能包括以下几个方面: :1.1.存在两种不同的吸附晶面存在两种不同的吸附晶面; ;2.2.两种不同晶面吸附方式不同两种不同晶面吸附方式不同; ;3.3.两种不同吸附点的起因两种不同吸附点的起因:Ca:Ca2+2+离子和离子和POPO4 43-3-; ;4.4.色谱历程为离子间的竞争过程。色谱历程为离子间的竞争过程。HAPHAP在生化产物分离中的应用在生化产物分离中的应用一般应用领域一般应用领域: :糖类糖类, ,多肽多肽, ,蛋
12、白质蛋白质, ,酶酶, ,核糖核酸。核糖核酸。单克隆抗体的分离纯化。单克隆抗体的分离纯化。结构差异很小的蛋白质分离。结构差异很小的蛋白质分离。问题问题HAPHAP是什么原理的色谱是什么原理的色谱? ?为什么为什么HAPHAP具具有比较高的分辩力有比较高的分辩力? ?HAPHAP色谱填料的主要特点色谱填料的主要特点? ?第十三章第十三章 径向色谱柱的发展与应用径向色谱柱的发展与应用传统色谱存在的问题传统色谱存在的问题放大过程放大过程的困难；的困难；保证保证生物物质活性生物物质活性的困难：生物样品的困难：生物样品的分离纯化过程的分离纯化过程对环境的要求较严对环境的要求较严，生物组成成分复杂生物组成
13、成分复杂，分子量较大分子量较大，比比较敏感较敏感，增加其使用的难度；，增加其使用的难度；生产效率生产效率的问题。的问题。什么是径向色谱什么是径向色谱采用径向流技术的色谱采用径向流技术的色谱, ,即样品和流动即样品和流动相沿相沿径向流动径向流动, ,可以从色谱柱的周围流可以从色谱柱的周围流向圆心向圆心, ,也可以从圆心流向柱的周围也可以从圆心流向柱的周围, ,通通常采用从柱的周围流向圆心的方式。常采用从柱的周围流向圆心的方式。 径向色谱技术的发展可以追溯到径向色谱技术的发展可以追溯到五五十年以前十年以前, 1947, 1947年发明的借助离心年发明的借助离心力分离溶液的装置力分离溶液的装置, ,
14、 已经采用了径已经采用了径向色谱的原理和方法。向色谱的原理和方法。径向色谱的优点径向色谱的优点1.1.采用径向流技术采用径向流技术, ,可以在可以在较小的柱床层较小的柱床层高度时使用较大的流动相速度高度时使用较大的流动相速度。2.2.在在较高流动相速度时较高流动相速度时, ,反压降低反压降低。3.3.可以可以线性地增加样品处理量线性地增加样品处理量, ,样品可以样品可以在完全相同的色谱条件下直接放大。在完全相同的色谱条件下直接放大。径向色谱柱分离介质径向色谱柱分离介质目前径向色谱柱使用的填料主要有目前径向色谱柱使用的填料主要有离子交离子交换树脂和亲和色谱换树脂和亲和色谱两种两种。离子交换色谱使
15、用率最高离子交换色谱使用率最高, ,其中以其中以二乙基氨二乙基氨基已基基已基(DEAE)(DEAE)为官能团的使用最多为官能团的使用最多, ,其其次为羟甲基次为羟甲基(CM)(CM)和磷酸和磷酸(P)(P)。选择具高选择的填料可以克服径向色谱直径选择具高选择的填料可以克服径向色谱直径短的缺点短的缺点, ,发挥径向色谱柱发挥径向色谱柱速度快速度快, ,处理量处理量大大的优点。的优点。几种径向色谱填料形态几种径向色谱填料形态( (颗粒颗粒, ,膜膜, ,连续床层连续床层) )1、膜填料膜填料: :通过接枝聚合反应获得的填通过接枝聚合反应获得的填料再制成膜状料再制成膜状, ,卷入事先设计好的色谱卷入
16、事先设计好的色谱柱中柱中, ,使成为径向色谱柱。使成为径向色谱柱。 常用：常用：多糖类基质上通过接枝聚合反应，以化学多糖类基质上通过接枝聚合反应，以化学多糖类基质上通过接枝聚合反应，以化学多糖类基质上通过接枝聚合反应，以化学共价键结合上有机聚合物，形成一部分具有稳定的共价键结合上有机聚合物，形成一部分具有稳定的共价键结合上有机聚合物，形成一部分具有稳定的共价键结合上有机聚合物，形成一部分具有稳定的共价性结构，另一部分则是较软的聚合物的产物。共价性结构，另一部分则是较软的聚合物的产物。共价性结构，另一部分则是较软的聚合物的产物。共价性结构，另一部分则是较软的聚合物的产物。2 2、连续床层填料连续
17、床层填料: :连续床层填料为一整连续床层填料为一整体体, ,其其横截面有足够的通道容许流动相横截面有足够的通道容许流动相和样品通过色谱柱床层和样品通过色谱柱床层。连续床孔隙度。连续床孔隙度高高, ,渗透性好渗透性好, ,因此适合在因此适合在高流速下高流速下进进行分析分离而不会导致过高的反压。行分析分离而不会导致过高的反压。径向色谱的传质过程径向色谱的传质过程轴心向柱外围轴心向柱外围及及柱外围向轴心柱外围向轴心的传质过程有差别。的传质过程有差别。径向色谱与轴向色谱在传质机制上的不同其中径向色谱与轴向色谱在传质机制上的不同其中主主要原因之一是分子扩散的问题要原因之一是分子扩散的问题, ,分子扩散可
18、以分子扩散可以忽略的情况下二者传质存在对称性忽略的情况下二者传质存在对称性, ,以体积坐标表以体积坐标表达的方程式完全相同达的方程式完全相同, ,分子扩散不可忽略时二者不分子扩散不可忽略时二者不存在这种对应关系。存在这种对应关系。径向色谱的应用径向色谱的应用优势：处理量、线性放大。优势：处理量、线性放大。 中试规模中试规模径向柱与轴向柱经济性比较径向柱与轴向柱经济性比较 相同生产规模相同生产规模的径向柱与轴向柱的比较的径向柱与轴向柱的比较 轴向柱与径向柱分离凝血剂的轴向柱与径向柱分离凝血剂的回收率回收率比较比较项目项目轴向柱轴向柱径向柱径向柱流速流速25L/h25L/h75-95L/h75-9
19、5L/h产率产率350L/3350L/3班班350L/350L/班班柱尺寸柱尺寸16L16L20L20L项目项目轴向柱轴向柱径向柱径向柱流速流速200L/h200L/h200L/h200L/h产率产率1000L/31000L/3班班1000L/1000L/班班柱尺寸柱尺寸160L160L60L60L色谱模色谱模式式柱体积柱体积上样流上样流速速柱流速柱流速抽提蛋白抽提蛋白量量抽提活抽提活性性回收活回收活性性产率产率轴向柱轴向柱757560601 17607605.15.12.52.549.049.0径向柱径向柱4004001201203 33832383225.825.815.815.861.0
20、61.0径向色谱的应用径向色谱的应用进行进行人血浆的大规模分离制备人血浆的大规模分离制备（免疫球蛋免疫球蛋白白、转铁蛋白、白蛋白）、转铁蛋白、白蛋白）。分离小牛血清分离小牛血清（牛血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白、血红蛋白）血红蛋白）。纯化鼠抗人尿激酶单克隆抗体纯化鼠抗人尿激酶单克隆抗体。纯化登革病毒单克隆抗体和乙肝核心抗原纯化登革病毒单克隆抗体和乙肝核心抗原单克隆抗体。单克隆抗体。纯化重组人白细胞介素纯化重组人白细胞介素2 2和干扰素和干扰素。问题问题什么叫径向色谱什么叫径向色谱? ?为什么需要径为什么需要径向色谱向色谱? ?它有什么优点它有什么优点? ?目前一般采用什么原理的色谱作目前一般采用什么原理的色谱作为径向色谱为径向色谱? ?为什么为什么? ?一粒沙一粒沙中收录的沙粒显微照片中收录的沙粒显微照片马萨诸塞州普拉姆岛马萨诸塞州普拉姆岛摩洛哥北撒哈拉摩洛哥北撒哈拉夏威夷考艾岛路玛哈伊海滩夏威夷考艾岛路玛哈伊海滩
