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1、目目 录录第二十二章第二十二章常用分子生物学技术常用分子生物学技术的原理及应用的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application目目 录录第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology目目 录录核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与
2、RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目目 录录复性复性RNADNA目目 录录（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术 探针探针 (probe) 一一小小段段用用同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料标标标标记记其其末末端端或或全全链链的的已已知知序序列列的的多多聚聚核核苷苷酸酸，与与固固定定在在NC膜膜上上的的核核苷苷酸酸结结合合，
3、判判断断是是否否有同源的核酸分子存在。有同源的核酸分子存在。 目目 录录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的重组质粒和噬菌体的分析。分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 目目 录录 其他其他斑点印斑点印迹迹 (dot bl
4、otting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)目目 录录v一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将定的切割点上将DNA DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有分子切断。目前已发现的限制酶有400400500500多种。多种。目目 录录三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较分子杂交实验分子杂交实验目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录放放射射自自显显影影照照片片目目 录录目目 录录DNA点阵点阵目目 录录目目 录录
5、第第 二二 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain Reaction5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录目目 录录n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ 二、二、PCRP
6、CR体系基本组成成分体系基本组成成分目目 录录三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目目 录录（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途目目 录录三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录目目 录录第
7、第 三三 节节 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence Analysis目目 录录核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (sanger法法)目目 录录一、化学裂解法一、化学裂解法( (Maxam-Gillbert法法) )基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个碱个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同
8、分度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5末端，经放射末端，经放射自显影即可在自显影即可在X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列。目目 录录二、二、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法目目 录录目目 录录目目 录录三、三、DNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同
9、荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧光信号，并依此确定荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 目目 录录DNA自动测序结果举例目目 录录目目 录录基基 因因 文文 库库Gene Library第第 四四 节节目目 录录基因组基因组DNA文库文库 (genomic
10、DNA library)cDNA文库文库 (cDNA library) 基因文库基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列的序列的克隆群体。克隆群体。目目 录录l DNADNA重组与克隆重组与克隆从细胞中分从细胞中分从细胞中分从细胞中分离出离出离出离出DNADNADNADNA限制酶截取限制酶截取限制酶截取限制酶截取DNADNADNADNA片断片断片断片断分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒 DNADNADNADNA重组重组重组重组用重组质粒用重组质粒用重组质粒用重组质粒转化大肠杆菌转
11、化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因重组体的筛选重组体的筛选重组体的筛选重组体的筛选目目 录录基因组基因组DNA文库文库目目 录录目目 录录第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例目目 录录转基因技术转基因技术采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入入动动物物子子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物( (
12、transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、一、转基因技术转基因技术目目 录录目目 录录核转移技术核转移技术 即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体的的去去胞胞核核的的受受精精卵卵内内，使之发育成个体，即克隆使之发育成个体，即克隆( (clone)。二、核转移技术二、核转移技术目目 录录基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向( (gene targeting) )灭活灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术目目 录录第第 七七
13、节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biological Chip Technology目目 录录DNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)目目 录录目目 录录目目 录录是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)
