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1、实验三实验三 提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定SDS-PAGESDS-PAGE一、实验目的一、实验目的1、学习和掌握电泳（PAGE和SDS-PAGE）的基本原理及电泳技术。2、熟练掌握SDS-PAGE有关试剂配制的技术。3、了解SDS-PAGE垂直板电泳法的基本原理及操作技术。二、实验原理二、实验原理电泳的概念：电泳的概念：带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳(electrophoresis，简称EP)。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。影响电泳的主要因素影响电泳的主
2、要因素 影响泳动速度的因素：（1）颗粒性质颗粒性质：一般说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就快。反之，则越慢。（2）电场强度电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。（3）pHpH值值：对蛋白质而言，溶液的pH值离其等电点愈远，其带净电荷量就愈大，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。（4）离子强度离子强度：溶液的离子强度一般在 0.020.2mol/kg之间电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动度。其原因：带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。这种静电作用的结果，导致颗粒泳动速度降低，则缓冲能力差
3、，往往会因溶液pH值变化而影响泳动的速率。（5）溶液粘度溶液粘度：泳动度与溶液粘度是成反比例关系。因此，粘度过大或过小，必然影响泳动速度。（6）电渗电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。溶液的泳动现象称为电渗。当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时则降低颗粒的泳动速度。（7）焦耳热焦耳热：电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当电流强度或电极缓冲液中离子强度
4、增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶支持物。（8）筛孔筛孔：支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳动速度慢。 除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体(acrylamide，简称 Acr)和交联剂 N， N-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylena bisacrylamide，简称Bis)，在催化剂的作用下聚合而成的。 Acr和 Bis在它们单独存在或混合在一起时
5、是稳定的，但在具有自由基团体系时，它们就聚合。聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种，化学聚合和光聚合。化学聚合：化学聚合：引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3(简称Ap)，催化剂是N，N，N，N-四甲基乙二胺(tetramethyl ethylenediamine，简称TEMED)。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵(Ap)形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低 pH时失效，会使聚合作用延迟。冷却（低温）也可使聚合速度变慢。一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。光聚合：光聚合：以光敏感
6、物核黄素(即VB2)作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。聚丙烯酰胺的基本结构聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单位构成的长链， 链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链间纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性能。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。
7、该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。凝胶浓度：凝胶浓度：用用T T表示表示每100mL凝胶溶液中含有的单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数。交联度：交联度：用用C C表示表示凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-51
8、04-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6改变凝胶浓度(T)和交联度(C)，可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。一般常用7.5浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，用2.4的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamidepolyacryamide gel gel electrophoresiselectrophoresis，简称，简称PAGEPAGE）根据其有无根据其有无浓缩
9、效应浓缩效应分为分为连续的、不连续的聚丙连续的、不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中，连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中，缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要有电荷及分子筛效应。不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中，不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中，由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中的泳动不仅有电荷效应、分子筛效应还具有浓缩效应。下面就这三种物理效应分别加以说明。(l)(l)电荷效应：电荷效应：各种样品分子按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。 (2)(2)分子筛效应：分子筛效应：分子量
10、或分子大小和形状不同的样品分子，通过一定孔径分离胶时，受阻碍程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快。分子量大，形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 (3)(3)浓缩效应：浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：由于两层凝胶孔径不同，样品向下移动到两层凝胶接口时，阻力突然加大，速度变慢，这样就在两层凝胶交界处使待分离的样品区带变窄，浓度升高。 在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液。上层
11、浓缩胶的pH为6.7下层分离胶的pH为8.9HC1是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都发生电离，C1-布满整个胶体。待分离的样品加在顶部，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子(前导离子)。在pH6.7条件下解离度仅有0.11的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后面，成为慢离子(尾随离子)。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的接口。在 pH6.7条件下带有负电荷的样品，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于接口附近，逐渐形成一个区带。 图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳
12、开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。图5 不连续系统浓缩效应示意图 在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGGCl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，及低电导区。电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系： V=I/S在电流恒定条件下，低电导区两侧就产生了较高的电位梯度，使样品和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。在这个追赶中被逐
13、渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是浓缩效应。当样品分子和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大到超过所有样品分子，从而赶上并超过所有样品分子。此时，不连续的高电位梯度不再存在。在分离胶的电泳过程中，样品在一个均一的电位梯度和 pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分离条带清晰度及分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠
14、(sodium (sodium dodecyldodecyl sulfate sulfate，简称，简称SDSSDS) )，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量Mr，而与所带电荷和形状无关。SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量M Mr r的原理的原理SDS是一种阴离子表面激活剂，在蛋白质溶液里加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比例为1.4g SDS/1g蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS
15、-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的Mr成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质Mr的函数。当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg
16、 MW =b m R + K MW ：蛋白质的分子量， m R ：相对迁移率，b：斜率，K：截距。当条件一定时，b与K均为常数 已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量Lg MW =b m R + K用用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质测定蛋白质M Mr r应注意问题：应注意问题：1如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4 SDSlg蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：(1)二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具
17、有相同的构象。般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体(2)溶液中溶液中SDSSDS的浓度的浓度：溶液中SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。(3)溶液的离子强度溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26， 因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在.SDS结合到蛋内质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度.在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。2不同凝胶浓度适用于不同的Mr范围.Weber的实验指出，在5%的凝胶中，Mr为25 000200 000
18、的蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系；在10的凝胶中，Mr为10 00070 000蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系；在15的凝胶中，Mr为10 00050 000蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系；3.33(以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%)的凝胶可用于Mr更高的蛋白质。Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200 可根据所测Mr范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择Mr范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白。标准蛋白质的相对迁移率(蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率)最好在0.20.8之间均匀分布。在凝胶电泳中
19、，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此用SDS凝胶电泳法测定Mr，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。 3有许多蛋白质，是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在SDS和疏基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的Mr，而不是完整分子的Mr。 为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其Mr及分子中肽链的数目等，与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果相互参照。 4不是所有的蛋白质都能用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其Mr.已发现电荷异
20、常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白（如胶原蛋白等）用这种方法测定出的Mr是不可靠的。如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，尽管结合了正常量的SDS，仍不能完全掩盖其原有电荷的影响。它的Mr是21 000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35 000。因此，要确定某种蛋白质的分子量时，最好用两种方法互相验证，则更为可靠。三实验材料三实验材料实验二所得的纯化的菠萝蛋白酶样品，低分子量标准蛋白样品四仪器设备四仪器设备夹心式垂直板电泳槽、直流稳压电电泳仪、恒温水浴锅、微量加样器、移样器、电炉等。五玻璃器皿五玻璃器皿100 mL烧杯，吸管、玻棒，移液管或移液器 5m
21、L、 1mL 、0.5mL，漏斗，滤纸，试剂瓶（1000 mL、500 mL、250 mL等）。六实验试剂六实验试剂要求：（1） SDSPAGE的几种试剂配制，严格按照各试剂特点和要求配制。（2） 低分子量标准蛋白样品的配制。（3） 待测的纯化蛋白质样品处理。实验试剂配制实验试剂配制 (1) 30%(1) 30%凝胶贮液：凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（Acr）、0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis), （先用约50mL蒸馏水溶解，如溶解不了,可加热3050溶解,再用量筒定容至100mL，然后过滤，后置于棕色瓶。4下保存备用）。(2) 10%(2) 10%过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)溶液：溶液：取2
22、g过硫酸铵溶解后，定容至20mL，现配现用。(3) 1 mol/L (3) 1 mol/L HClHCl 500mL：取浓HCl 42 mL，加蒸馏水至500 mL(在通风橱中操作)。(4) (4) 分离胶缓冲溶液（分离胶缓冲溶液（1.5mol/L1.5mol/LTris-HClTris-HCl缓冲液，缓冲液，pH8.8pH8.8）: :取18.15g Tris溶解后，加1mol/L HCl溶液约48mL，调pH至8.8, 定容至100mL( Tris为三羟甲基氨基甲烷或缓血酸铵)。(5) 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液,pH6.8): 取6g Tri
23、s溶解后，加1mol/L HCl溶液40mL，调pH至6.8，定容至100mL( Tris为三羟甲基氨基甲烷或缓血酸铵)。(6) 10%SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)溶液溶液: 取5g SDS加水定容至50mL。（加热溶解）(7) 电极缓冲液电极缓冲液(0.1%SDS0.05mol/L Tris0.384mol/L甘氨酸缓冲液，甘氨酸缓冲液，pH8.3):取6gTris，28.8g甘氨酸(氨基乙酸)和1g SDS加水溶解后，调p值至8.3，定容至000m（配好的试剂其p为8.3）(12个组可配浓缩2倍的母液5升,使用时再稀释.)。 (8) (8) 样品溶解液：样品溶解液：取SDS g，
24、-巯基乙醇 mL，甘油10mL，溴酚蓝0.1g，0.5mol/L，TrisHCl缓冲液,p6.8(即上述的浓缩胶缓冲液)10mL，加蒸馏水25mL，(最后的总体积为50 mL),装于棕色瓶。(9)染色液（染色液（0.1%0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝-45%-45%甲醇甲醇-10%-10%冰乙酸溶液）：冰乙酸溶液）：1g考马斯亮蓝R250，加入450 mL 甲醇、100mL冰乙酸，用水定容至1000 mL。(12个组可配2000 mL)(10)脱色液（脱色液（0.25mol/L 0.25mol/L NaClNaCl）：）：取14.6 g的NaCl，加水定容至1000mL(12个组可配3000 m
25、L)。七实验步骤七实验步骤1、清洗并吹干玻璃板。2、在塑料胶条的两面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄脏玻璃板）。3、安装好电泳槽（玻璃板）。4、封胶：用小烧杯加6mL蒸馏水，2mL30%凝胶储液，200 uL 10TEMED（原液），200uL 10过硫酸铵（AP），混匀，用滴管滴加于封口槽处，静置约10min直到凝固。5、加dH2O于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重装。图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 返回12%分离胶5%浓缩胶 30
26、%凝胶贮液4000l810 l上层胶缓冲液pH6.82500 l下层胶缓冲液pH8.85000lTEMED（四甲基乙二胺)10 l7 l10%SDS100l50ldH2O0.65l1500lAP（过硫酸氨）0.15l70 l6、用小烧杯按下表1配下层胶（分离胶），胶浓度为12%，混匀，灌胶，高度离梳子约11.5cm，然后覆盖一层水，凝胶时间为1530min，胶与水分层，倾倒去水。 * 水封胶的作用：保持分离胶上沿平直，排气泡 * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面7、用小烧杯按上表1配上层胶（浓缩胶），胶浓度为，混匀，灌胶，插入梳子。 * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平
27、8、在凝胶过程中，液面下降，要补充胶液，凝胶时间约1020min，凝好胶，拔掉梳子。9、加入稀释的电极缓冲液，浸泡至上槽（低玻璃面），但不能超过下槽（高玻璃面），注意不能漏水。 *用吸管将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出10、加热样品（沸水浴数处理3min）。11、微量注射器按下表2点样，隔孔点样，注意不要交叉污染（每点一个样都要清洗微量注射器）。表2 点样方式孔1234567891011加样粗酶标准蛋白过柱1过柱2过柱3体积L304030353535 *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔12、上槽接负极（），下槽接正极（）。13、恒
28、电压电泳：浓缩胶，80V，约1h；分离胶，160V，约3h。14、取胶，做好记号（左右）。15、染色（新配染色液只需染50 2030min），回收染色液。16、脱色：加脱色液50 23h处理，或常温脱色数天,即可看到条带。剥胶时要小心剥胶时要小心, ,保持胶完好无损保持胶完好无损, ,染色要充分染色要充分17、拍照并画电泳图谱，计算标准蛋白、待测样品的相对迁移率蛋白相对迁移率蛋白迁移距离/指示剂迁移距离18、用低分子量标准蛋白质所作的标准曲线，求待测样品亚基的相对分子量。以标准蛋白质电泳的相对迁移率为横坐标(X)，标准蛋白质分子量的对数为纵坐标(Y)，绘标准蛋白质的标准曲线，再根据样品相对迁移
29、率在曲线上求出其蛋白质的分子量。蛋白名称 迁移距离 相对迁移率（Y） 蛋白分子量(D) 蛋白分子量对数(X) 兔磷酸化酶B 97400牛血清白蛋白 66200牛碳酸酐酶 43000牛蛋白酶抑制剂 31000鸡蛋清溶菌酶 20100过柱的菠萝蛋白酶 14400指示剂 -低分子量标准蛋白质的组分：低分子量标准蛋白质的组分：1) 兔磷酸化酶B 分子量 97,400 (道尔顿)2) 牛血清白蛋白 分子量66,200 (道尔顿)3) 兔肌动蛋白 分子量43,000 (道尔顿)4) 牛碳酸酐酶 分子量31,000 (道尔顿)5) 牛蛋白酶抑制剂 分子量20,100 (道尔顿)6) 鸡蛋清溶菌酶 分子量14
30、,400 (道尔顿)八实验注意事项八实验注意事项1、缓冲液的pH值，浓度要准确配置，所用的水最好为双蒸水。2、有些试剂要避光保存，有的要新鲜配置。3、SDS，Acr，Bis的试剂要求纯度较高，要求分析纯或进口分装的，如果纯度不够，需要重结晶一次或二次，方可使用。4、待测样品要用低离子强度的样品，如果离子强度过高，需要通过透析或离子交换除盐。5、SDS在低温下析出，使用前水浴加热使之溶解。常见问题及解决办法常见问题及解决办法1 1.纹理和拖尾现象纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素 2 2.蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连蛋白带过宽，与
31、邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量 3 3.电泳时间比正常要长电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地pH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高 4 4.指示剂成微笑符号指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致 5 5.指示剂成微笑符号指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全 6 6.凝胶时间不对凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果凝
32、的太慢，可能是TEMED，AP剂量不够或者失效。AP应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是AP和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂 九实验结果分析九实验结果分析 1. 各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。2. 做好电泳图谱的绘制及数据记录。3. 学生对该实验有哪些体会。4. 思考题：（1）电泳时，上下电泳槽产生的气体是什么？用过一次的电极缓冲液是否可以混合后再用？为什么？（2）样品上样前为什么要沸水浴加热35分钟？（3）SDS-PAGE是否需在低温下进行？为什么？（4）做好本实验关键是什么？（5）如果电泳图谱模糊，有些电泳带不出现或拖尾，试分析原因。5.递交实验报告。思考题思考题 1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳原理上有何不同？ 2. 用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇？3用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量，为什么有时和凝胶层析法所得结果有所不同？是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量？为什么？
