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1、常见分子生物学实验方法常见分子生物学实验方法11 1，分子生物学技术在目前医学科学研究中占主导地位，几乎，分子生物学技术在目前医学科学研究中占主导地位，几乎所有基础类所有基础类SCISCI文章都涉及分子生物学实验，掌握分子生物学文章都涉及分子生物学实验，掌握分子生物学实验技术的理论和方法有助于读懂基础类实验技术的理论和方法有助于读懂基础类SCISCI文章；文章；2 2，对许多医学研究生来说，分子生物学实验技术是他们完成，对许多医学研究生来说，分子生物学实验技术是他们完成实验研究最为常用的一种工具和达到目的的一种手段。实验研究最为常用的一种工具和达到目的的一种手段。分子生物学实验的重要性分子生物
2、学实验的重要性2核酸实验：核酸实验：重组质粒的构建与表达重组质粒的构建与表达蛋白质实验：蛋白质实验：蛋白质相互作用研究的常用方法蛋白质相互作用研究的常用方法原核质粒原核质粒真核质粒真核质粒GST pull-down免疫共沉淀免疫共沉淀 本课程主要内容本课程主要内容3实验一实验一 重组质粒的构建重组质粒的构建1 1，分子生物学最基本、最重要的实验技术，分子生物学最基本、最重要的实验技术2 2，目前重组质粒的获取方法，目前重组质粒的获取方法公司合成服务公司合成服务同行馈赠同行馈赠自己构建（低成自己构建（低成本，可靠）本，可靠）4v 选择载体选择载体v 获得目的基因获得目的基因v 目的基因与载体的重
3、组目的基因与载体的重组v 重组载体的转化重组载体的转化v 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定重组质粒构建的基本过程重组质粒构建的基本过程5重组质粒构建重组质粒构建的简单流程的简单流程 基因组基因组DNA,PCRDNA,PCR产物产物, cDNA , cDNA ( (插入子插入子) )质粒质粒DNADNA ( (载体载体) )限制性酶切限制性酶切 ( (修饰修饰 DNA DNA 末端末端) ) 连接载体与插入片段连接载体与插入片段转化转化( (将重组质粒导入宿主细胞将重组质粒导入宿主细胞) )鉴定重组子鉴定重组子 6质粒载体的选择质粒载体的选择 载体：载体：用于携带重组用于携带重组DNADNA
4、，并且能够使外源，并且能够使外源DNADNA一起复制与表一起复制与表达的运载工具。达的运载工具。基因工程中用得最多的是基因工程中用得最多的是plasmidplasmid载体。载体。 质粒：独立于宿主细胞（如细菌）染色体之外的可进行复制质粒：独立于宿主细胞（如细菌）染色体之外的可进行复制和遗传的遗传单位和遗传的遗传单位- -双链闭合环状超螺旋双链闭合环状超螺旋DNADNA分子分子。是一种环。是一种环状的双链状的双链DNADNA分子，大小从分子，大小从1K-200Kb1K-200Kb。分子生物学实验中所用。分子生物学实验中所用载体为人工合成的。载体为人工合成的。7人工构建质粒的基本元件人工构建质粒
5、的基本元件v启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制v抗性基因：用于筛选阳性克隆。抗性基因：用于筛选阳性克隆。v多克隆位点：插入外源基因。多克隆位点：插入外源基因。对于表达载体还需要启动子、多聚对于表达载体还需要启动子、多聚A A尾等。尾等。易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。重组等等。8pBR322 plasmid 是一个克隆是一个克隆载体，作为一个克隆载体最载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备：基本的要求都具备：复制起点复制起点:Origin克隆位点克隆位点:EcoR I; Hind
6、III; BamH I; Sal I筛选标记筛选标记:Ampr。9克隆载体克隆载体原核生物表达载体原核生物表达载体真核生物表达载体真核生物表达载体质粒载体根据用途分类质粒载体根据用途分类质粒载体分类质粒载体分类10 T-Vector是一种高效克隆是一种高效克隆PCR产物产物 (TA Cloning) 的专用载体，的专用载体，由由pUC18载体改建而成的。在载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的载体的多克隆位点处的Xba I 和和Sal I 识别位点之间插入了识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用识别位点，用EcoR V 进行酶进行酶切反应后，再在两侧的切反应后，再在两侧的3 端
7、添加端添加“T”而成。因大部分耐热性而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在聚合酶反应时都有在PCR产物的产物的3末端添加一个末端添加一个“A”的特性的特性,所以用本制品可大大提高所以用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。产物的连接、克隆效率。克隆载体（克隆载体（T-载体）载体）11T-vector T-vector 克隆克隆PCRPCR产物时用高效连接液产物时用高效连接液Ligation Solution I Ligation Solution I 可以在极短的时间内可以在极短的时间内 (30(30分钟分钟1 1小时小时) ) 完成连接反应，大大地完成连接反应，大大地方便了实验操
8、作。方便了实验操作。用途：用途：克隆克隆PCRPCR产物产物。 对克隆后的对克隆后的PCRPCR产物使用产物使用M13 primersM13 primers进行进行DNADNA测序。测序。12T-vector PCR产物亚克隆载体产物亚克隆载体1314原核生物表达载体原核生物表达载体原核生物表达载体的基本结构单元包括：原核生物表达载体的基本结构单元包括：复制起点复制起点克隆位点克隆位点筛选标记筛选标记启动子启动子转录终止序列转录终止序列核糖体结和位点：起始密码子核糖体结和位点：起始密码子ATGATG和和SDSD序列（翻译识别）序列（翻译识别）15PET-28a1617 真核生物表达载体真核生物
9、表达载体真核生物表达载体的结构单元：真核生物表达载体的结构单元：复制起点（真核和原核）复制起点（真核和原核）克隆位点克隆位点筛选标记筛选标记( (原核和真核标记）原核和真核标记）增强子增强子/ /启动子启动子PolyA PolyA 终止信号终止信号1819目的基因的获得目的基因的获得目的基因的获取方法目的基因的获取方法公司合成公司合成同行馈赠同行馈赠RT-PCR20RT-PCR 实验原理实验原理vRT-PCR是将是将RNA的反转录（的反转录（RT）和）和cDNA的聚的聚合酶链式扩增（合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从转录酶的作用从RNA合成合成
10、cDNA，再以，再以cDNA为模为模板，扩增合成目的片段。板，扩增合成目的片段。vRT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步可以一步法或两步法的形式进行。在两步法法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。中，每一步都在最佳条件下进行。2122操作步骤操作步骤v1、RNA的提取；的提取；v2、反转录合成、反转录合成cDNA；v3、PCR扩增；扩增；v4、产物的电泳和结果的测定。、产物的电泳和结果的测定。 23RNA的提取的提取vRT-PCR中从细胞分离的中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少分离的
11、最关键因素是尽量减少RNA酶的污染酶的污染。但。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此酶。因此在提取在提取RNA时，应尽量创造一个无时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括酶的环境，包括去除外源性去除外源性RNA酶污染和抑制内源性酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性）去除外源性RNA酶，通过酶，通过RNA酶的阻抑蛋白酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性酸胍抑
12、制内源性RNA酶。酶。24反转录合成反转录合成cDNA组成组成体积体积溶液溶液A（随机引物（随机引物RP）1ul溶液溶液B（dNTPs)1ul溶液溶液D(5*RT buffer)4ul溶液溶液E（含逆转录酶、（含逆转录酶、RNA酶抑制剂）酶抑制剂）1ul1-5ug Total RNA6ul溶液溶液G7ul在在冰上冰上加入：加入：1、混匀，、混匀，42，60min;2、95 ，5min，终止反应。，终止反应。25PCR扩增扩增组成组成体积体积RT反应产物反应产物8ul溶液溶液F（10*PCR buffer)5ul溶液溶液B(dNTPS)1ul溶液溶液H(-actin 引物）引物）1ul溶液溶液C
13、（Taq 酶）酶）1ul溶液溶液G34ul取取1支支0.2ml的的PCR管，在管，在冰上冰上加入：加入：26PCR反应参数的设置反应参数的设置9494预变性预变性5 5分钟分钟9494变性变性3030秒秒5757退火退火3030秒，共秒，共3030个循环个循环7272延伸延伸3030秒秒7272延伸延伸5 5分钟分钟27PCR条件的优化条件的优化v引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下温度的上下2 变化寻找最佳退火温度。变化寻找最佳退火温度。 vMg2浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mM左右。左右
14、。v引物和模板的量等。引物和模板的量等。 28产物的电泳和结果的测定产物的电泳和结果的测定v根据产物长度制作适宜根据产物长度制作适宜 浓度的琼脂糖凝胶浓度的琼脂糖凝胶:v取适量取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳电泳4560min。成像。成像系统成像分析。系统成像分析。琼脂糖浓度（）琼脂糖浓度（）线性线性DNA片段的有片段的有效分离范围效分离范围（kb）0.51 300.70.81210.5101.20.471.50.2329注意事项注意事项v所提取的所提取的RNA不能有降解
15、，要达到最佳扩增，所不能有降解，要达到最佳扩增，所需的总需的总RNA的量是必需的。的量是必需的。vTaq酶、酶、Rnasin等等-20保存，操作时置于冰上；保存，操作时置于冰上；dNTP保存在保存在 4度即可，勿反复冻融。度即可，勿反复冻融。v在操作过程中实验者必须戴消毒手套，并经常更在操作过程中实验者必须戴消毒手套，并经常更换，确保无换，确保无RNase的污染。的污染。30 在在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染：使用过程中使用良好的实验步骤减少残余污染：使用抗气雾剂移液管阻止气雾剂进入抗气雾剂移液管阻止气雾剂进入 eppendorf 管内；为管内；为PCR样样品配制和扩增后分析设计
16、隔离的区域，在准备新反应前更换品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套；总是使用不含有模板的阴性对照检测污染；使用预先手套；总是使用不含有模板的阴性对照检测污染；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。31目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组( (酶切与连接酶切与连接) )核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。核酸酶可分为两类：核酸外切酶（核酸酶可
17、分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解则从核酸链中间水解3，5磷酸二磷酸二酯键，将核酸链切断。酯键，将核酸链切断。 32 限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链链DNA。限制性酶切的原理限制性酶切的原理33 I
18、型型 II 型型 III 型型功能功能内切酶内切酶 & 甲基化酶甲基化酶内切酶内切酶内切酶内切酶条件条件ATP, Mg2+Mg2+ATP, Mg2+识别序列识别序列EcoK: AACN6GTGCEcoB: TGAN8TGCT回文结构回文结构EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG切割位点切割位点离识别位点至少离识别位点至少 1000bp靠近或与识别位点靠近或与识别位点一致一致离识别位点离识别位点24-26 bp限制性核酸内切酶的类型和主要特征限制性核酸内切酶的类型和主要特征34识别序列识别序列限制性内切酶的特点限制性内切酶的特点 识别识别 4-8 bp 的回文序列的回文序列. 常用
19、的酶识别常用的酶识别 6 bp 发生的概率为发生的概率为 46=4096 bp/每次每次. (44=256 bp; 48=65536 bp)1.高度特异性高度特异性2.商业化生产商业化生产3.反应需要反应需要Mg2+4.不同的内切酶可能产生相同的末端不同的内切酶可能产生相同的末端5 GAATTC 33 CTTAAG 5如如 EcoRI 识别序列识别序列:35影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素v（1）DNA 纯度纯度v（2）DNA甲基化的程度甲基化的程度v（3）酶切消化反应温度）酶切消化反应温度v（4）DNA的分子结构的分子结构v（5）限制性内切酶的缓冲液）限制性内切酶
20、的缓冲液36DNA连接酶与连接酶与DNA分子的体外连接分子的体外连接 DNA连接酶是连接酶是1967年在三个实验室同时发现年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助链上缺口酶，借助ATP或或NAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNA链的链的5-PO4与与另一另一DNA链的链的3-OH生成磷酸二酯键。生成磷酸二酯键。 常用的常用的DNA连接酶有两种：连接酶有两种： 来自大肠杆菌的来自大肠杆菌的DNA连接酶连接酶 来自噬菌体的来自噬菌体的T4DNA连接酶连接酶。 二者的作用机理类似二者的作用机理类似37T4连接酶作用分三步：连接酶作用分三步：（1）T4DNA
21、连接酶与辅助因子连接酶与辅助因子ATP形成酶形成酶AMP复合物。复合物。（2） 酶酶AMP复合物结合到具有复合物结合到具有5磷酸基和磷酸基和3羟基切口羟基切口的的DNA上，使上，使DNA腺苷化。腺苷化。（3） 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 T4DNA连接酶可连接连接酶可连接DNA- DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和和双链双链DNA粘性末端或平头末端。粘性末端或平头末端。38 A ATP 浓度浓度 B 连接酶浓度连接酶浓度 C 反应时间反应时间 D insert和和vector的比值（载体的比值（载体DNA和外源和外源DNA的分子数的分子数
22、比（浓度比）为比（浓度比）为1：31：10） E 连接温度连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。 影响连接效率的因素影响连接效率的因素39 感受态细胞感受态细胞 (Competent cells): 经过 CaCl溶液处理的E. coli 细胞对外源DNA的吸收变得非常敏感，其细胞内的酶限制-修饰系统被抑制，有利于外源基因的转化、表达和繁殖，这种细胞被称作感受态细胞. 转化转化 (Transformation): 感受态细胞吸收外源DNA的过程. 热激热激 (Heat-shock): 将 DNA 与宿主细胞混合后，将宿主细胞放入42C 的
23、温水中保温 1.5 分钟以增加转化效率的过程.重组载体的转化重组载体的转化40重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定外源外源DNA载体载体DNA重组分子重组分子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞扩增或表达扩增或表达表达表达连接连接转化转化转染转染受体细胞受体细胞41 在在DNA体外重组实验中，外源体外重组实验中，外源DNA片段与载体片段与载体DNA的的连接反应物一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和连接反应物一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此必须通过筛选和鉴定来区分转化子转化率的不理想，因此必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。与非转化子、重组子与
24、非重组子。v转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。v非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。v重组子：含有重组重组子：含有重组DNA分子的转化子。分子的转化子。v非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。42转化子的筛选与重组子的鉴定方法转化子的筛选与重组子的鉴定方法v基于载体遗传标记的筛选与鉴定基于载体遗传标记的筛选与鉴定 利用载体利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子子v基于克隆片段序列的筛选与鉴定
25、基于克隆片段序列的筛选与鉴定 由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期望重由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至少部片段的序列至少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有广泛分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有广泛的实用性的实用性v基于外源基因表达产物的筛选与鉴定基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测这种蛋白
26、质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子43基于载体遗传标记的筛选与鉴定基于载体遗传标记的筛选与鉴定抗药性筛选法抗药性筛选法营养缺陷性筛选法营养缺陷性筛选法显色模板筛选法显色模板筛选法噬菌斑筛选法噬菌斑筛选法44ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。非重组子：非重组子：Apr、Tcr 重组子：重组子：Aps、Tcs 抗药性筛选法抗药性
27、筛选法将外源将外源DNA片段插入片段插入BamH I、Sal I位点位点45将转化液涂布含将转化液涂布含Ap的平板的平板Ap再将再将再将再将ApAp平板上的转化子影印平板上的转化子影印平板上的转化子影印平板上的转化子影印至含有至含有至含有至含有ApAp和和和和TcTc的平板上的平板上的平板上的平板上 Ap+Tc影影影影印印印印挑挑选选在在 Ap平平 板板 上上 生生 长长 、 但但 在在Ap+Tc平平板板上上不不长长的的转转化化子子为重组子为重组子基本操作基本操作4647营养缺陷性筛选法营养缺陷性筛选法基本原理基本原理 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，营养缺陷型筛选法可以区分转化子与
28、非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子 。48LysLys+ +LysLys+ +基本原理图示基本原理图示49v用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因合成基因trptrp+ +v用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸用于高等哺
29、乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因腺嘧啶核苷激酶基因tktk，相应的受体细胞则选择，相应的受体细胞则选择tktk- -缺陷型缺陷型50基于克隆片段序列的筛选与鉴定基于克隆片段序列的筛选与鉴定PCRPCR鉴定法鉴定法菌落原位杂交法菌落原位杂交法限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法亚克隆法亚克隆法DNADNA序列测定法序列测定法51PCR鉴定法鉴定法 PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA特特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR技术即可技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定期望重组子与非期用
30、于区分重组子与非重组子，也能鉴定期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的基因或望重组子，甚至还能探测目的基因或DNA片段是否整合在片段是否整合在受体细胞的基因组上。上述受体细胞的基因组上。上述PCR鉴定程序一般需要将筛选鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落分别挑出进一步培养，因此不太适用于成平板上的单菌落分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万个转化子的鉴定。千上万个转化子的鉴定。52原理原理: PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。PCR鉴定法鉴定法过程过程:（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。 （2）用外源）用外源DN
31、A插入片断作插入片断作PCR引物。引物。 （3）电泳）电泳PCR产物。产物。 （4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。5354DNA序列测定法序列测定法 DNA序序列列测测定定是是精精确确鉴鉴定定目目的的基基因因的的重重要要手手段段，目目前前国国际际上上流流行行采采用用Sanger发发明明的的双双脱脱氧氧末末端端终终止止法法测测定定DNA序序列列，其其工工作作原原理理是是在在DNA聚聚合合反反应的进程中，通过位点特异性终止测定。应的进程中，通过位点特异性终止测定。55实验二实验二 蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作
32、用研究方法Protein-Protein Interactions- A Common Theme in Cell Biology 蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用 细胞生物学领域的普遍主题细胞生物学领域的普遍主题 两个或两个以上的蛋白质结合在一起执两个或两个以上的蛋白质结合在一起执行生物学功能时，发生相互作用。行生物学功能时，发生相互作用。56Interaction Domain - Structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础 蛋白质蛋白质相互作用和识别在诸如生物蛋白
33、质蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。多种生命过程起着重要的作用。57Western BlotvWestern免疫印迹（免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。然后利用抗体进行检测。vWestern Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二抗。经过用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤分
34、离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜或维素薄膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。基因表达的蛋白成分。58Western b
35、lot 特点特点v蛋白质的蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至检测到低至15ng（最低可到（最低可到10100pg）中等大）中等大小的靶蛋白。小的靶蛋白。59Western blot 应用应用v目的蛋白的表达特性分析目的蛋白的表达特性分析v目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白与其它蛋白的互作v目的蛋白的组织定位目的蛋白的组织定位v目的蛋白的表达量分析目的蛋白的表达量分析60Western blot 流程流程61电泳电泳v常用常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白
36、质：单一亚基组成的蛋白质v非变性非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质：多个不同亚基组成的蛋白质vTris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于胶中电泳：用于分子量小于10kDa的的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果v聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套62Staking gelSeparating gel63转膜转膜v戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致v以适量
37、的转移以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜室温平衡滤纸、凝胶和膜1530min，如果是，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。膜，必须先用甲醇激活后浸泡。v方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极v排去滤纸、胶和膜间的气泡。排去滤纸、胶和膜间的气泡。v电转时间：电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活可根据蛋白分子量的大小灵活 选择选择v转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率v膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置64湿转系统湿转系统65半干转移系统半干
38、转移系统66封闭封闭v用用5脱脂奶粉或脱脂奶粉或3BSA（含（含0.1Tween20 TBS或或PBS配制）配制）v时间：室温时间：室温2h或或4C过夜过夜67一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育v把把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育育1-2小时或小时或4过夜。过夜。v回收一抗溶液，用回收一抗溶液，用TBST漂洗膜漂洗膜3次，每次次，每次10min。v加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室
39、温孵育1-2小时或小时或4过夜。过夜。 v回收一抗溶液，用回收一抗溶液，用TBST漂洗膜漂洗膜3次，每次次，每次10min。v最后用最后用TBS漂洗膜漂洗膜2次，每次次，每次10min。68v显色显色v辣根过氧化物酶：底物为辣根过氧化物酶：底物为DABv碱性磷酸酶：底物为碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBTv化学发光显影化学发光显影v最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）发光底物（商品化产品）v注意：化学发光前将膜用不含注意：化学发光前将膜用不含Tween20的的TBS或或PBS洗涤一次洗涤一次v曝光的时间和显影的时间根据实际情
40、况而定曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色69流程图流程图70Western Blot常见问题分析常见问题分析71SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳电泳电泳u u胶不平？胶不平？胶不平？胶不平？u u凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净加入加入加入加入APAP和和和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀止部分胶
41、块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀均匀均匀均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐72u u条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？u u“ “微笑微笑微笑微笑” ”或或或或“ “倒微笑倒微笑倒微笑倒微笑” ”条带？条带？条带？条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻
42、缓均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注
43、意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适合适合适合适SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳电泳电泳73转膜及抗体检测转膜及抗体检测转膜及抗体检测转膜及抗体检测u u凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？u u条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？u u单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？u u转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转
44、膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡中浸泡中浸泡中浸泡5-10min5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“ “三三三三明治明治明治明治” ”结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压
45、缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温74转移到膜上的蛋白很少转移到膜上的蛋白很少1.蛋白分子量蛋白分子量 10KD2.蛋白的等电点蛋白的等电点 93.SDS浓度不合适浓度不合适4.凝胶太厚凝胶太厚 原原因因对对策策1.蛋白分子量蛋白分子量10KD时，减时，减少转膜时间；使用小孔径少转膜时间；使用小孔径的膜的膜2.更换高更换高pH值值Buffer3.在阴极在阴极buffer中加入中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜可提高转膜效率效率4.延长转膜时间延长转膜时间751
46、.膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染3.封闭不充分封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应5.抗体浓度过高抗体浓度过高 原因原因对对策策1.转膜前用转膜前用100%甲醇将膜甲醇将膜完全浸湿完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度背景太高背景太高76杂交信号很弱杂交信号很弱1.抗体保存不当抗体保存不当2.抗原不充足抗原不充足3.膜的漂洗过度膜的漂洗
47、过度 原原因因对对策策1.抗体长期保存应在抗体长期保存应在70，使用前做效价检测，使用前做效价检测2.增加蛋白上样量，做已知增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照标准量蛋白的对照3.减少漂洗的时间和次数减少漂洗的时间和次数771.一抗不是唯一特一抗不是唯一特异的异的2.二抗出现非特异二抗出现非特异结合结合 原因原因对对策策1.制备单克隆抗体或者重新选制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点取合成抗原多肽的位点2.设立不加一抗，只加二抗的设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有平行对照来检测二抗是否有非特异结合非特异结合出现非特异带出现非特异带78GST融合蛋白进行融合蛋白进行pul
48、l-down实验实验 原理原理 细菌表达的谷胱甘肽细菌表达的谷胱甘肽s转移酶（转移酶（GST）融合蛋白主要用于）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用作用时，可以启用GST沉降技术。
49、该方法只是用于确定沉降技术。该方法只是用于确定体外体外的的相互作用。相互作用。79方法：方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的单一明确的重组蛋白；重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译体外翻译cDNA表表达得到的未知蛋白）达得到的未知蛋白）2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4C 2h3）离心弃上清）离心弃上清4）沉淀加入）沉淀加入2 蛋白蛋白Loading Buffer煮沸，离心煮沸，离心5）取上清进行）取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳，6）考马氏亮兰染色观察
50、特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：该实验设立注意：该实验设立GST对照，反应均在对照，反应均在4C进行进行80GST-Pulldown Assay8182原理：原理： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质白质X的抗体免疫沉
51、淀的抗体免疫沉淀X，那么与，那么与X在体内结合的蛋白质在体内结合的蛋白质Y也也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。优点：生理条件下的结合优点：生理条件下的结合缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用作用免疫共沉淀免疫共沉淀831）细胞裂解）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子
52、变性剂（质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。经验确定。 不能用高浓度的变性剂（不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。3) 对照实验的设计。对照实验的设计。注意事项注意事项84实验基本流程实验基本流程v1.提取蛋白提取蛋白v2.在细胞裂解液中加入抗在细胞裂解液中加入抗X
53、的抗体的抗体v3.孵育后再加入孵育后再加入Protein A或或G(于于Agarose bead上上)若若细胞中有与兴趣蛋白结合细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成的目的蛋白，就可以形成复合物：复合物：“YX抗抗X抗抗体体Protein A或或Gv4.经变性、聚丙烯酰胺凝经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、抗原、x抗体）抗体）85CO-IP特征特征v优点优点v相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态然状态v蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人
54、为的影响免人为的影响v可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物86CO-IP特征特征v局限性局限性v可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用相互作用v两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；在中间起桥梁作用；v必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。87实验结果分析实验结果分析vSDS-PAGEvWestern bl
55、otting分析分析v质谱分析检测目的蛋白质谱分析检测目的蛋白88实验的关键实验的关键v实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。的特异性是问题。v为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加须加蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。，低温下进行实验。89考虑抗体考虑抗体/ /缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在过多则就不能沉降在beadsbeads上，残存在上清。缓冲剂上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。太
56、少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。定。90注意的问题之一：裂解液注意的问题之一：裂解液细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。经验确定。不能用
57、高浓度的变性剂（不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。91注意的问题之一：抗体注意的问题之一：抗体92未检测到目得蛋白或蛋白很少未检测到目得蛋白或蛋白很少 可能原因及处理方法可能原因及处理方法v样品被蛋白酶降解：样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持作保持4以下冰上操作并防止冻融以下冰上操作并防止冻融v抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度梯度，摸索最佳浓度v抗体亲合力太低：抗体亲合力太低：
58、选用适合于选用适合于IP和和/或或IB的相应抗的相应抗体体93IP抗体未与抗体未与agarose珠子结合：珠子结合： 选用适合于选用适合于IP的相应珠的相应珠子，正确保存防止变质或干燥子，正确保存防止变质或干燥Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达融合表达部位部位裂解液严谨度太高：裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液改用低严谨度裂解液94目得蛋白高背景目得蛋白高背景可能原因及处理方法可能原因及处理方法v非特异蛋白结合：在无血清培养液中裂解细胞；非特异蛋白结合：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前用在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗
59、，免疫沉珠子预洗，免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）v裂解液严谨度太低：改用高严谨度裂解液裂解液严谨度太低：改用高严谨度裂解液v实验仪器或液体被污染：使用洁净的仪器或液体实验仪器或液体被污染：使用洁净的仪器或液体v转移膜上的非特异吸附：戴手套，转移膜上的非特异吸附：戴手套， 用镊子夹取，用镊子夹取， 不要接触膜转移面不要接触膜转移面95试剂试剂vRIPA Bufferv蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂（aprotinin、leupeptin、pepstatin）、）、PMSF。v洗涤缓冲液洗涤缓冲液PBSvProtein A agarose琼脂糖琼脂糖v抗体抗体96仪器、耗材仪器、耗材 摇床、摇床、EPEP管、低温离心机、管、低温离心机、1.5mlEP1.5mlEP管、制冰管、制冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子（乙醇洗机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子（乙醇洗干净风干）干净风干）99
