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1、 第第 10 章章 基因诊断基因诊断 Gene diagnosisGene diagnosis China Medical University China Medical University Department of Medical Department of Medical GeneticsGenetics p4801 1 本章内容提示 基因诊断概念基因诊断概念 基因诊断方法基因诊断方法 直接诊断（直接诊断（Southern）间接诊断（间接诊断（PCR-RFLP）DNA多态多态 基因诊断基因诊断 实例：实例：2 2第一节 基因诊断技术 第二节 基因诊断方法及实例3 3 基因诊断：基因诊
2、断： 利用分子生物学技术从利用分子生物学技术从利用分子生物学技术从利用分子生物学技术从DNA DNA 水平检测人类遗水平检测人类遗水平检测人类遗水平检测人类遗 传性疾病的基因缺陷，又称传性疾病的基因缺陷，又称传性疾病的基因缺陷，又称传性疾病的基因缺陷，又称DNADNA分析法。分析法。分析法。分析法。 传统的诊断：表现型传统的诊断：表现型基因型基因型 基基 因因 诊诊 断：基因型断：基因型表现型表现型 （ 逆向诊断）逆向诊断）4 4基因诊断的特征：基因诊断的特征：1不受材料来源影响不受材料来源影响外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2症状前诊断症状前诊
3、断尤其对于一些延迟显性疾病如尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病舞蹈病3产前诊断产前诊断避免患儿出生，提高人口质量避免患儿出生，提高人口质量5 5第一节第一节 基基 因因 诊诊 断断 技技 术术Southern印印迹迹杂杂交交6 6基基 因因 诊诊 断断 技技 术术Northern印印迹迹杂杂交交7 7基基 因因 诊诊 断断 技技 术术斑斑点点杂杂交交点样点样Probe-32P检测检测AB1 2 3 48 8基基 因因 诊诊 断断 技技 术术荧荧光光原原位位杂杂交交9 9基基 因因 诊诊 断断 技技 术术荧荧光光原原位位杂杂交交1010基基 因因 诊诊 断断 技技 术术聚聚合
4、合酶酶链链反反应应1111基基 因因 诊诊 断断 技技 术术聚聚合合酶酶链链反反应应1212基基 因因 诊诊 断断 技技 术术多重多重PCR在一个在一个PCR体系中加入数对体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失用于检测同一基因多个外显子的缺失E1E2E31313基基 因因 诊诊 断断 技技 术术RT-PCR以以mRNA为模板，经逆转录酶合成为模板，经逆转录酶合成cDNA用于研究基因表达用于研究基因表达使微量使微量mRNA迅速扩增，提高迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度检出的灵敏度1414基基 因因 诊诊 断断 技技 术术PCR-SSCP（S
5、ingleStrandConformationPolymorphism）单链单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率电泳迁移率的不同。据此，可用于的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。小的缺失或插入的检测。1515基基 因因 诊诊 断断 技技 术术-primer-32P-dNTP掺入掺入PCR扩增扩增产物产物变性变性单链单链DNA中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳12345自显影自显影1为正常为正常结果分析结果分析2、
6、4、5为纯合患者为纯合患者3为杂合子为杂合子.1616基基 因因 诊诊 断断 技技 术术生生 物物 芯芯 片片1717第二节第二节 基基 因因 诊诊 断断 方方 法及实例法及实例直接诊断直接诊断直接直接检测致病基因的突变检测致病基因的突变基因突变类型基因突变类型缺失、点突变、重复、插入等缺失、点突变、重复、插入等间间接接诊诊断断应应用用DNA多多态态为为遗遗传传标标记记进进行行连连锁锁分分析析，确确定定待待测测者者是是否否得得到到带带有有致致病病的的染染色色体体，从从而而间接间接地作出诊断地作出诊断DNA多态多态RFLP、VNTR、SNP1818一一 DNA多态多态DNA多态（多态（DNA P
7、olymorphism）：）： 群体中每个个体群体中每个个体DNA区域中等位基因区域中等位基因（或片段）存在（或片段）存在两种两种或或两种以上两种以上的形式的形式，对，对基因功能没有影响基因功能没有影响，称，称DNA多态多态。 它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。析中的标记。1919DNA分析中常用的遗传性多态性标记有分析中常用的遗传性多态性标记有3类：类：1 1）RFLPRFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多称限制性片段长度多态性，为第一代多称限制性片段长度多态性，为第一代多称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；态性标记；态性标记；态性
8、标记；2 2）重复序列多态性（重复序列多态性（重复序列多态性（重复序列多态性（VNTRVNTR）：如短串联重复序列如短串联重复序列如短串联重复序列如短串联重复序列（STRSTR），），），），为第二代多态性标记；为第二代多态性标记；为第二代多态性标记；为第二代多态性标记；3 3）单碱基多态性（单碱基多态性（单碱基多态性（单碱基多态性（SNPSNP）：DNADNA序列的序列的序列的序列的单个单个单个单个核苷核苷核苷核苷酸的差别，为第三代多态性标记。酸的差别，为第三代多态性标记。酸的差别，为第三代多态性标记。酸的差别，为第三代多态性标记。2020一一) 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 R
9、estriction Fragment Length Polymorphism Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLPRFLPl l由于碱基变异可能导致限制酶切点由于碱基变异可能导致限制酶切点由于碱基变异可能导致限制酶切点由于碱基变异可能导致限制酶切点消失消失消失消失或新的酶切或新的酶切或新的酶切或新的酶切点点点点出现出现出现出现，引起不同个体，引起不同个体，引起不同个体，引起不同个体DNADNA在用同一限制酶切割时，在用同一限制酶切割时，在用同一限制酶切割时，在用同一限制酶切割时，产生不同长度的产生不同长度的产生不同长度的产生不同长度的D
10、NADNA片段，称片段，称片段，称片段，称 RFLPRFLPl l RFLP RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。用的遗传标记。用的遗传标记。用的遗传标记。2121Allele II 产生了新的酶切点产生了新的酶切点 Allele IAllele I Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb RFLPSouthernblot检测结果检测结果 2222AlleleII酶切位点消失酶切位点消失 2323二二)数目变异串联重复，数目变异串联重复，va
11、riable number tandem repeats, VNTR）l l重复序列以各自的重复序列以各自的重复序列以各自的重复序列以各自的核心序列核心序列核心序列核心序列（重复单元），首尾相（重复单元），首尾相（重复单元），首尾相（重复单元），首尾相连连连连多次重复多次重复多次重复多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人，称为串联重复序列，其重复次数在人，称为串联重复序列，其重复次数在人，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即群中存在变异，形成多态即群中存在变异，形成多态即群中存在变异，形成多态即 VNTRVNTR。l l散在分布于染色体上。散在分布于染色体上。散在分布于
12、染色体上。散在分布于染色体上。l l重复单位重复单位重复单位重复单位625bp625bp长，长，长，长，称为小卫星称为小卫星称为小卫星称为小卫星DNADNA。重复单位重复单位重复单位重复单位26bp26bp长，如（长，如（长，如（长，如（TATA）n, (CGG)nn, (CGG)n等，等，等，等，称为称为称为称为微卫星微卫星微卫星微卫星DNADNA。2424l lVNTRVNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的
13、串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。片段。片段。片段。l lDNADNA多态可以通过多态可以通过多态可以通过多态可以通过PCRPCR扩增后电泳来检出，称扩增后电泳来检出，称扩增后电泳来检出，称扩增后电泳来检出，称扩增扩增扩增扩增片段长度多态片段长度多态片段长度多态片段长度多态（amplified fragment amplified fragment length polymorphism, length polymorphism, Amp-FLPAmp-FLP）2525VNTR 酶切，电泳后的检测结果大小2626PCR-VNTR检测2727P
14、CR-VNTR28282929三三)单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNP）（SingleNucleiotidePolymorphism）SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据根据SNP在基因中的位置，分为：在基因中的位置，分为：基因编码区基因编码区SNP基因周边基因周边SNP基因间基因间SNP在人类基因组中每在人类基因组中每100300个核苷酸就有一个个核苷酸就有一个SNP3030二、基诊断方法及实例二、基诊断方法及实例 直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或本身或邻近邻近DNA序列序列作为探针，进行作为探
15、针，进行Southern 杂交杂交，或通过，或通过PCR 扩增产物扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。直接直接基因诊断及实例基因诊断及实例3131直接基因诊断直接基因诊断 突变型突变型遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断e.g. 镰形细胞贫血的镰形细胞贫血的Gene诊断诊断 32321）Southern blot 珠蛋白链基因第珠蛋白链基因第6位密码子发生突变位密码子发生突变 GAGGTG 谷谷Aa缬缬Aae.g. e.g. 镰形细胞贫血的镰形细胞贫血的GeneG
16、ene诊断诊断3333l l已知限制酶已知限制酶Mst 1识别序列识别序列 （CCTNAGG）l l l l l l CCTGAGGl l l l CCTGTGGl l突变后不能识别，突变后不能识别，l l酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。34342) ASO探针诊断探针诊断 已知突变已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸部位和性质，合成寡核苷酸探针，探针，32P标记，进行斑点杂交。标记，进行斑点杂交。 Normal Gene Probe与正常与正常 Probe 杂交稳定杂交稳定 Mutation S S Gene Probe与异常与异常 S杂交
17、杂交 稳定稳定 3535等位基因特异性寡核苷酸探针（等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）（Allele-specific-oligonucleotide）3636斑点杂交结果：斑点杂交结果： / /S S/S 正常探针 突变探针突变突变型型型型遗传病的遗传病的遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断3737突变突变型型型型遗传病的遗传病的遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断3838BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe1） 地中海贫血的基因诊断地中海贫血的基因诊断 基因不同程度的缺失可引基因不同程度的缺失可引起不同类型的起不同类型的 地中
18、海贫血。地中海贫血。直接基因诊断直接基因诊断 缺失缺失型型遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断3939Southernblot检测结果：检测结果：/-/-/-/- 正常正常缺缺1缺缺2缺缺3缺缺414kb10kb缺失缺失型型型型遗传病的遗传病的遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断4040l l2） 地贫的地贫的Gene诊断诊断l l 珠蛋白基因两侧珠蛋白基因两侧珠蛋白基因两侧珠蛋白基因两侧有有有有pst1酶切位点，酶切位点，酶切位点，酶切位点， pst1酶切正常可得酶切正常可得酶切正常可得酶切正常可得到到到到4.4kb4.4kb片段片段片段片段l l 珠蛋白基因缺失珠蛋
19、白基因缺失珠蛋白基因缺失珠蛋白基因缺失0.7kb0.7kb片段，片段，片段，片段， pst1酶切则得到酶切则得到酶切则得到酶切则得到3.7 kb3.7 kb片段为片段为片段为片段为 0 0 缺失缺失型型型型遗传病的遗传病的遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断4141以以Gene为探针，为探针，Southern blot 方方法检测法检测l l /A A /0 0 0 0 0 0 0 0/0 0 0 0l l 4.4kb3.7kb缺失缺失型型型型遗传病的遗传病的遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断42423）DMD的基因诊断的基因诊断DMD属属XRDMD基
20、因是最大的基因，有基因是最大的基因，有79个外显子个外显子DMD基因突变主要以基因突变主要以缺失缺失为主，可涉及基因的不同部位为主，可涉及基因的不同部位E1E2E3缺失缺失型型型型遗传病的遗传病的遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断4343病例外显子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp535113缺失缺失型型型型遗传病的遗传病的遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断4444二）间接基因诊断方法及实例二）间接基因诊断方法及实例 当当致病基因致病基因虽然已知，但其虽然已知，但其异常性质未知异常性质未知时，时，或疾病或疾病Gene
21、Gene本身尚未知本身尚未知时，主要通过时，主要通过GeneGene和和DNADNA多多态的连锁分析态的连锁分析间接地间接地作出诊断。作出诊断。4545 连锁分析基于连锁分析基于遗传标记遗传标记与与Gene在染色体上连在染色体上连锁，锁， 通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种子代获得某种遗传标记遗传标记与与疾病疾病的关系，间接推断受的关系，间接推断受检检子代是否获得带有致病基因的染色体子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判，间接地判断并做出诊断。断并做出诊断。 遗传标记是基因组中的遗传标记是基因组中的DNA 多态多态 如：如：RFLP，V
22、NTR 等。等。间接基因诊断间接基因诊断4646遗传标记相关基因表型分析间接基因诊断间接基因诊断47471 1 Southern blotSouthern blot-RFLP-RFLP诊断诊断(PKU)(PKU) PAH基因两侧基因两侧有有Msp1酶切酶切位点位点,用该酶用该酶消化可产生消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，两种等位片段，以以PAHcDNA为探针与为探针与PKU家系成员外周家系成员外周血血DNA杂交。杂交。间接基因诊断间接基因诊断4848l l患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁l l其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23k
23、b片段与正常PAH基因连锁。lII2为为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。间接基因诊断间接基因诊断49492 成年型多囊肾病的诊断成年型多囊肾病的诊断l l例：成年型多囊肾病例：成年型多囊肾病例：成年型多囊肾病例：成年型多囊肾病APKDAPKD，ADAD ，临床表现为临床表现为临床表现为临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。石
24、。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。l lAPKDAPKDGeneGene定位定位定位定位16p1316p13，但但但但致病基因致病基因致病基因致病基因尚未克隆尚未克隆尚未克隆尚未克隆，基因产物基因产物基因产物基因产物的生化性质和疾病发病机理也的生化性质和疾病发病机理也的生化性质和疾病发病机理也的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明尚未阐明尚未阐明尚未阐明，但已证实但已证实但已证实但已证实APKD GeneAPKD Gene与与与与 珠蛋白基因珠蛋白基因珠蛋白基因珠蛋白基因33端附近的一端附近的一端附近的一端附近的一段段段段小卫星小卫星小卫星小卫星DNADNA序列序列序列序列（3HVR3HVR）紧密连锁
25、紧密连锁紧密连锁紧密连锁，因此，可，因此，可，因此，可，因此，可以通过连锁分析进行诊断。以通过连锁分析进行诊断。以通过连锁分析进行诊断。以通过连锁分析进行诊断。间接基因诊断间接基因诊断5050以以3HVR为为探探针针，与与PvuII酶酶切切后后的的家家系系有有关关成成员的基因组员的基因组DNA进行进行SouthernBlot基因组基因组DNAPvuII酶切酶切DNA片段片段变性变性转膜转膜探针探针变性变性杂交杂交结果分析结果分析间接基因诊断间接基因诊断5151 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 间接基因诊断间接基因诊断5252结果分析结果分析患患者者（I1、II1
26、和和II2）有有3.4kb片片段段，说说明明致致病病基基因因与与3.4kb片片段段连连锁锁，并并按按孟孟德德尔尔方方式式遗遗传传。II5不不含含3.4kb片片段段，产产前前诊断正常。诊断正常。间接基因诊断间接基因诊断53533 甲型血友病甲型血友病诊断（诊断（PCRRFLP） 甲型血友病的基因诊断：已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA 。 PCR 142 PCR 142 bpbp BcLIBcLI 142bp 99 142bp 99 bpbp 43bp 43bp 电泳电泳电泳电泳 结果分析结果分析结果分析结果分析p1p2142bp99bp43bpBcl IBcl I -Bcl I +间
27、接基因诊断间接基因诊断5454间接基因诊断间接基因诊断5555 142bp99bp1 2123III 1间接基因诊断间接基因诊断5656结果分析结果分析1 1）先症者）先症者）先症者）先症者II 1II 1具有具有具有具有99bp99bp片段而发病，该片段来自母片段而发病，该片段来自母片段而发病，该片段来自母片段而发病，该片段来自母亲。亲。亲。亲。2 2）II2II2有有有有142bp/99bp142bp/99bp，为杂合子。为杂合子。为杂合子。为杂合子。142bp142bp来自父亲，来自父亲，来自父亲，来自父亲，为正常片段，为正常片段，为正常片段，为正常片段，99bp99bp片段是来自母亲而
28、成为携带者。片段是来自母亲而成为携带者。片段是来自母亲而成为携带者。片段是来自母亲而成为携带者。3 3）1 1为为为为99bp99bp片段片段片段片段 如果是如果是如果是如果是 男性男性男性男性 为患者（为患者（为患者（为患者（99bp99bp片段来自母亲）；女片段来自母亲）；女片段来自母亲）；女片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）性为携带者（来自父母双方）性为携带者（来自父母双方）性为携带者（来自父母双方）间接基因诊断间接基因诊断5757单体型分析单体型分析l有时用一种酶和一个探针不能提供可供分有时用一种酶和一个探针不能提供可供分析的信息，需采用一种以上的酶结合几个析的信息，需采用一
29、种以上的酶结合几个基因探针杂交分析基因探针杂交分析。l根据同一条染色体上限制性位点的丢失或根据同一条染色体上限制性位点的丢失或获得而出现的获得而出现的一组一组多态位点所构成的多态位点所构成的不同不同片段长度的组合类型片段长度的组合类型进行分析，该分析方进行分析，该分析方法称法称单体型分析单体型分析（Haplotyping)间接基因诊断间接基因诊断5858 举例：举例：PKU家系家系Hind 酶切：酶切： 患儿患儿4.2/4.0kb杂合体杂合体 父母父母4.2/4.0kb杂合体杂合体 均为杂合体，无法分析。均为杂合体，无法分析。l再用再用sph酶切：酶切：患儿患儿 纯合纯合7.0kb 父亲父亲
30、纯合纯合7.0kb 母亲母亲 9.7kb和和7.0kb杂合体杂合体间接基因诊断间接基因诊断5959结结 果果 1 21 2 1 2 3 1 2 3 4.2kb 4.2kb 4.0kb 4.0kb 11kb11kb 9.7kb 9.7kb 7.0kb 7.0kb IIIHind Sph 间接基因诊断间接基因诊断6060分析分析： 患儿患儿1从母亲和父亲各获得一个从母亲和父亲各获得一个7.0kb突变型突变型从从Hind 酶切结果看出：酶切结果看出： 正常同胞正常同胞3为纯合为纯合4.0kb ，也是也是sph 7.0kb纯合体，故母亲纯合体，故母亲H 4.0kb S 7.0kb 构成构成单体型，母亲
31、单体型，母亲7.0kb为为突变型，因此，突变型，因此，母亲母亲H 4.0kb S 7.0kb为为突变单体型。突变单体型。间接基因诊断间接基因诊断6161l l患儿患儿患儿患儿1 1为为为为Hind Hind 4.2/4.0kb 4.2/4.0kb杂合体，杂合体，杂合体，杂合体，l l 故故故故父亲父亲父亲父亲H 4.2kb S 7.0kbH 4.2kb S 7.0kb 为为为为突变单体型突变单体型突变单体型突变单体型l l母亲母亲母亲母亲H 4.2kb S 9.7kbH 4.2kb S 9.7kb 和和和和父亲父亲父亲父亲H 4.0kb S 7.0kb H 4.0kb S 7.0kb 为为为为
32、正常正常正常正常单体型。单体型。单体型。单体型。l l2 2 两个单体型分别为两个单体型分别为两个单体型分别为两个单体型分别为H 4.2kb S 9.7kbH 4.2kb S 9.7kb（母）和（母）和（母）和（母）和H 4.0kb S 7.0kbH 4.0kb S 7.0kb（父）（父）（父）（父） 正常个体正常个体正常个体正常个体l l3 3两个单体型分别为两个单体型分别为两个单体型分别为两个单体型分别为H H 4.0kb S 7.0kb4.0kb S 7.0kb（母）和母）和母）和母）和H H 4.0kb S 7.0kb4.0kb S 7.0kb（父）（父）（父）（父） 携带者携带者携带者携带者间接基因诊断间接基因诊断6262基因诊断意义基因诊断意义l l现症病人的诊断：争取有效、针对性现症病人的诊断：争取有效、针对性治疗。治疗。l l产前诊断：意义更为重要，预防遗传产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生病患儿的出生 6363
