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1、碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AKP)的分离纯化的分离纯化生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 袁野袁野实验目的实验目的: 从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。的技能。实验原理：实验原理： 采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱性磷酸酶。性磷酸酶。 AKPAKP溶于溶于30%30%乙醇或乙醇或33%33%丙酮丙酮。但在。但在60%60%的乙醇的乙醇或或50%50%丙酮
2、丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使中则形成沉淀。通过离心可以使AKPAKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。和其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的的AKPAKP。有机溶剂沉淀n概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。n原理原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作
3、用，降低了自由水的由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚了亲水性，导致脱水凝聚。常用的有机溶剂沉析剂n乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；n丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；范围不广；n特点：特点：q介电常数小介电常数小: 60%: 60%乙醇的介电常数是乙醇的介电常数是4848 丙酮的介电常数是丙酮的介电常数是
4、2222q容易获取容易获取有机溶剂沉析的特点n分辨率高；分辨率高；n溶剂容易分离溶剂容易分离，并可回收使用；并可回收使用；n产品洁净；产品洁净；n容易使蛋白质等生物大分子失活；容易使蛋白质等生物大分子失活；n应注意在低温下操作；应注意在低温下操作；影响有机溶剂沉析的主要因素n温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；（溶解度下降）；n搅拌速度：散热搅拌速度：散热n溶液溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（电荷，防止共沉现象。（pI）n离子强度离子强度:离子强度低有利
5、于沉析，离子强度低有利于沉析，0.010.05mol/Ln样品浓度样品浓度: 0.52%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低n金属离子的助沉析作用：金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+1.1.称取兔肝称取兔肝2g2g, ,剪碎后剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入置于玻璃匀浆器中，加入0.01 M0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml4ml, , 进行进行匀浆。匀浆。转入离心管，并加转入离心管，并加2ml 2ml 0.01 M0.01 M的醋酸的醋酸镁及醋
6、酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。入离心管，与原来的匀浆液混合。记录记录体积体积a a，取，取0.1ml0.1ml作为作为A A液液于于EPEP管，待测比活性用。管，待测比活性用。2.2.在离心管中剩余的液体加入在离心管中剩余的液体加入2ml2ml正丁醇，正丁醇，玻璃棒搅拌玻璃棒搅拌 2min2min，室温放置，室温放置30min30min，纱布，纱布过滤，置于离心管。过滤，置于离心管。3.3.滤液加入滤液加入等体积的冷丙酮等体积的冷丙酮，边倒边摇，混，边倒边摇，混匀后匀后3000r/min 5min3000r/min 5min
7、。弃上清弃上清，沉淀用，沉淀用4ml 0.5M Mg(AC)4ml 0.5M Mg(AC)2 2溶解。记录溶解。记录体积体积b b。取。取0.1ml0.1ml作为作为B B液液于于EPEP管，待测比活性用。管，待测比活性用。4.(1)于悬液中于悬液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为30%（0.46体积体积），混匀后），混匀后2000r/min 5min，转，转移移上清上清于另一离心管。于另一离心管。(2)上清液中上清液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为60%（0.85体积体积），混匀后），混匀后3000r/min 5min，弃上弃上清清，沉淀
8、用，沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅混合液搅拌混悬。拌混悬。5.(1)于悬液中于悬液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为30%（0.46体积体积），混匀后），混匀后2000r/min 5min，转，转移移上清上清于离心管，弃沉淀。于离心管，弃沉淀。(2)上清液中上清液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为60%（0.85体积体积），混匀后），混匀后3000r/min 5min，弃上弃上清清，沉淀用，沉淀用3ml 0.5M Mg(AC)2溶解溶解,记录记录体积体积c。取取0.1ml作为作为C液液于于EP管管,待测比活性用。待
9、测比活性用。6.（1）其余悬液中其余悬液中缓慢缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到数达到33%（0.5体积），混匀后体积），混匀后2000r/min 离心离心5min， 取上清取上清（弃沉淀）（弃沉淀）（2）上清中上清中缓慢缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后体积），混匀后3000r/min离心离心15min，弃上弃上清清（3）沉淀中加入沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。，即为纯化酶液。作为作为D液液用于比活性测定。用于比活性测定。n用于活性测定：用于活性测定：用用Tri
10、s-Mg(AC)2缓冲液将缓冲液将 A液稀释液稀释25倍、倍、B液稀释液稀释10倍、倍、 C液稀释液稀释5倍，倍，D液不稀释。液不稀释。n用于含量测定用于含量测定：用：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将缓冲液将 A液稀释液稀释50倍、倍、B液稀释液稀释20倍、倍、 C液稀释液稀释5倍，倍，D液不稀释。液不稀释。(二二)碱性磷酸酶的活性测定碱性磷酸酶的活性测定实验原理：实验原理： AKP是一种底物特异性较低，在碱性环是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适境中能水解磷酸基团。最适pH范围为范围为8.810, 需要镁离子作为激活剂。需要镁离子作为激活剂。 血清血清AKP主要来自肝，小
11、部分来自骨骼。主要来自肝，小部分来自骨骼。 酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、最适的最适的pH、必要的激动剂等），一定的时间、必要的激动剂等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物的生成量来确定。量或产物的生成量来确定。磷酸苯二钠磷酸苯二钠磷酸盐磷酸盐 + 酚酚AKP酚酚 + 4-氨基安替比林氨基安替比林红色醌类衍生物红色醌类衍生物铁氰化钾铁氰化钾管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复
12、合底物复合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.01. 取试管取试管6支编号（体积单位为支编号（体积单位为ml）2. 加入底物后加入底物后, 立即混匀立即混匀, 37 准确准确15 min后加后加入入0.5%铁氰化钾铁氰化钾2.0 ml终止反应终止反应, 混匀混匀, 静置静置15 min , 510 nm比色比色（大比色杯）（大比色杯）AKP纯化程度鉴定nAKP纯化程度用酶的比活性反映。纯化程度用酶的比活性反映。n酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。活性。BCA法测定法测定AKP蛋白浓度蛋白浓度BCA (bicinchoninic
13、acid, 二喹啉甲酸二喹啉甲酸)Protein + Cu2+OH-Cu+BCA 试剂试剂 紫色复合物紫色复合物(三三)碱性磷酸酶的蛋白含量测定碱性磷酸酶的蛋白含量测定管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1蛋白标准液蛋白标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1BCA试剂试剂 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.51. 取试管取试管6支编号支编号（体积单位为（体积单位为ml）2. 混匀后混匀后37水浴水浴30min, 562nm30min, 562nm比色（比色（小比色杯）小比色杯）管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体
14、酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复合底物复合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1蛋白标准液蛋白标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1BCA试剂试剂 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.51. 取试管取试管6支编号支编号（体积单位为（体积单位为ml）酶活性测定）酶活性测定2. 取试管取试管6支编号支编号（体积单位为（体积单位为ml）酶蛋白含量测定）酶蛋白含量测定管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体
15、 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复合底物复合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.01. 取试管取试管6支编号（体积单位为支编号（体积单位为ml）2. 加入底物后加入底物后, 立即混匀立即混匀, 37 准确准确15 min后加后加入入0.5%铁氰化钾铁氰化钾2.0 ml终止反应终止反应, 混匀混匀, 静置静置15 min , 510 nm比色比色（大比色杯）（大比色杯）722S型分光光度计使用方法型分光光度计使用方法1.1.开机预热开机预热15min15min以上（打开盖预热）。以上（打开盖预热）。 2.2.转动波长选择钮，选
16、用所需的波长。转动波长选择钮，选用所需的波长。3.3.将装有空白、标准、样品的比色杯放入比色杯架，使将装有空白、标准、样品的比色杯放入比色杯架，使空白管空白管对对准光路。准光路。4.4.按按MODEMODE 键选择键选择transtrans模式。模式。5.5.打开样品室暗箱盖（光门自动关闭），按打开样品室暗箱盖（光门自动关闭），按0%ADJ0%ADJ 键，即能自动键，即能自动进行机械零点的调整，数码显示为进行机械零点的调整，数码显示为0.0000.000。6.6.盖好比色杯暗箱盖（光门自动开启），按盖好比色杯暗箱盖（光门自动开启），按100%ADJ100%ADJ 键，即能自键，即能自动进行空白
17、零点的调整，数码显示为动进行空白零点的调整，数码显示为100.0100.0。（一次如有误差可。（一次如有误差可再按一次）再按一次）7.7.按按MODEMODE 键选择吸光度测定模式（键选择吸光度测定模式（ABSABS灯亮），数码显示自动转灯亮），数码显示自动转换为吸光度值换为吸光度值0.0000.000。8.8.拉动比色杯架的拉杆，使测定杯进入光路，从数码显示上即可拉动比色杯架的拉杆，使测定杯进入光路，从数码显示上即可读出样品的吸光度读出样品的吸光度 9.9.比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，清洗比色杯并晾干。清洗比
18、色杯并晾干。1.1.分分光光光光度度计计必必须须放放置置在在固固定定而而且且不不受受振振动动的的仪仪器器台台上上，不不能能随随意意搬搬动动，严严防防振振动动，潮潮湿湿和和强强光光直直射射。分分光光光光度度计计内内放放有有硅硅胶胶干燥袋，需定期更换。干燥袋，需定期更换。2.2.开开机机预预热热1515分分钟钟，待待仪仪器器稳稳定定以以后后再再开开始始进进行行测测定定。每每年年需需定定期进行波长校准。期进行波长校准。3.3.必必须须保保证证测测试试样样品品为为澄澄清清的的溶溶液液，肉肉眼眼看看不不出出来来的的轻轻微微浊浊度度也也能能引引起起读读数数的的严严重重误误差差，必必要要时时可可通通过过离离
19、心心来来去去除除微微粒粒。检检测测细菌培养液的光吸收时例外。细菌培养液的光吸收时例外。4.4.从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行检测，否则低从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行检测，否则低温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。 使用分光光度计的注意事项使用分光光度计的注意事项5.5.比比色色杯杯盛盛液液量量以以达达到到杯杯容容积积2/32/3左左右右为为宜宜。比比色色杯杯的的外外表表面面，则则必必须须先先用用滤滤纸纸吸吸干干，再再用用擦擦镜镜纸纸或或绸绸布布擦擦净净，然然后后才才能能把把比比色色杯杯放入比色杯槽内。
20、移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。6.6.不不可可用用手手拿拿比比色色杯杯的的光光学学面面，禁禁止止用用毛毛刷刷等等物物摩摩擦擦比比色色杯杯的的光光学学面面。用用完完比比色色杯杯后后应应立立即即用用自自来来水水冲冲洗洗，再再用用蒸蒸馏馏水水洗洗净净，也也可可用用甲甲醇醇冲冲洗洗。洗洗涤涤后后应应把把比比色色杯杯倒倒置置晾晾干干或或用用滤滤纸纸条条将将水水吸吸去去，再用擦镜纸轻轻揩干。再用擦镜纸轻轻揩干。7.7.一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。 8.8.一一般般应应把把溶溶液液浓
21、浓度度尽尽量量控控制制在在吸吸光光度度值值0.20.20.70.7的的范范围围内内进进行行测测定定。这这样样所所测测得得的的读读数数误误差差较较小小。如如吸吸光光度度不不在在此此范范围围内内，可可调调节节样样品品溶溶液液浓浓度度，适适当当稀稀释释或或加加浓浓，使使其其在在仪仪器器准准确确度度较较高高的的范范围内进行测定。围内进行测定。 A样样A标标 标准管中酚含量标准管中酚含量0.1mg/ml 稀释倍数稀释倍数A样样A标标 标准管中蛋白含量标准管中蛋白含量0.2mg/ml 稀释倍数稀释倍数酶活性单位计算：酶活性单位计算：蛋白质含量计算蛋白质含量计算:比活性计算比活性计算AKP比活性比活性=每毫升样品的酶活性单位每毫升样品的酶活性单位每毫升样品的蛋白毫克数每毫升样品的蛋白毫克数纯化倍数纯化倍数=每步比活性每步比活性初提液比活性（初提液比活性（A液体）液体）总活力总活力=酶活性单位酶活性单位体积体积得率得率=每步总活力每步总活力初提液总活力（初提液总活力（A液体）液体）分离分离阶段阶段蛋白质蛋白质mg/ml酶活性酶活性U/ml比活性比活性U/mg纯化纯化倍数倍数得率得率ABCD
