生化实验技术专题

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1、生化实验技术专题生化实验技术专题 主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一般主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离心步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离心技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋白技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。目录第一节第一节 生物大分子物质的制备生物大分子物质的制备第二节第二节 几类主要的生化实验技术几类主要的生化实验技术第三节第三节 蛋白质、核酸的检测蛋白质、核酸的检测第一节第一节 生物大分子物质的制备生物大分子物质的制备一一一般过程和原则一般过程和原则二二注意

2、事项注意事项三纯化方案的设计和评价三纯化方案的设计和评价例：例：宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化酸性蛋白酶的纯化确立有效成分的测定方法确立有效成分的测定方法材料的选择和预处理材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的抽提有效成分的抽提有效成分的纯化和浓缩有效成分的纯化和浓缩生物大分子生物大分子分离纯化分离纯化的一般步骤和原则的一般步骤和原则层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 透析和透析和超滤超滤盐析（盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料选择与处理材料选

3、择与处理细胞破碎（机械破细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）酶解、化学处理）生物组织生物组织 提取液提取液 粗产品粗产品结晶结晶分子大小分子大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力依据原理依据原理调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表注意事项注意事项基本原则：防止生物分子变性、降解基本原则：防止生物分子变性、降解 1控制适当的控制适当的pH 2控制低温控制低温 3注意提取过程中的溶液环境注意提取过程中的溶液环境 4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基宇佐美宇佐美曲霉曲霉537酸性蛋白酶的纯

4、化酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤纯化步骤 总蛋白总蛋白 总活力总活力 比活力比活力 纯化倍数纯化倍数 回收率回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白）蛋白） （%）1、粗酶液、粗酶液 80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 694、盐析、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶、结晶 0.12 130 1072 19.70 3第二节第二节 几类重要的生化实验技术几类重要的生化实验技术一、一、层析技术层析技术二二

5、 、电泳技术电泳技术三三 、离心技术离心技术四四 、透析透析和和超过滤超过滤一层析技术（一层析技术（chromatographychromatography）1层析技术一般原理层析技术一般原理2层析技术分类层析技术分类3常用层析技术及应用常用层析技术及应用层析技术原理层析技术原理 层层析析技技术术是是一一种种物物理理的的分分离离方方法法。无无论论何何种种层层析析, ,都都是是由由互互不不相相溶溶的的两两个个相相组组成成: :一一是是固固定定相相( (固固体体或或吸吸附附在在固固体体上上的的液液体体），一一是是流流动动相相（液液体体或或气气体体）。层层析析时时，利利用用混混合合物物中中各各组组分

6、分理理化化性性质质（如如吸吸附附力力、分分子子形形状状和和大大小小、分分子子极极性性、分分子子亲亲和和力力、溶溶解解度度等等）的的差差异异，使使各各组组分分不不同同程程度度地地分分布布在在两两相相中中，随随着着流流动动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。 混混合合物物在在层层析析系系统统中中的的分分离离决决定定于于该该混混合合物物的的组组分分在在两两相相中中的的分分配配情情况况，一一般般用用分分配配系系数数( (distribution distribution coefficient,coefficient,K Kd d

7、）来来描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。 物物质质在在层层析析系系统统中中的的行行为为并并不不直直接接决决定定于于其其K Kd d，而而取取决决于于它它的的有效分配系数有效分配系数K Keffeff : :K Keff eff = =某一物质在某一物质在A A相中的总量相中的总量某一物质在某一物质在B B相中的总量相中的总量层析法分类（按装置分类层析法分类（按装置分类 ） 纸层析纸层析 薄膜层析薄膜层析 柱层析柱层析洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱氨氨基基酸酸分分析析仪仪图图解解AspThrThr

8、LysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光光吸吸收收流出液流出液(mL)150cm柱柱，pH3.25，0.067mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠150cm柱柱，pH4.25，0.067mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠15cm柱柱，pH5.25，0.12mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠缓冲液泵缓冲液泵显色反显色反应管应管茚三酮泵茚三酮泵已已分开的分开的氨基酸氨基酸离子交换柱离子交换柱样品注入口样品注入口记录仪记录仪光电倍光电倍增管增管光源光源气液色谱图解气液色谱图解（gas-liquid gas-liquid gas-liqui

9、d gas-liquid chromatigraphychromatigraphychromatigraphychromatigraphy）层析柱层析柱恒温装置恒温装置载气（流动相）载气（流动相）样品）样品）进样室进样室检测器检测器记录仪记录仪出口出口高效液相层析（高效液相层析（HPLCHPLC）图解图解 （high performance liquid high performance liquid high performance liquid high performance liquid chromatigraphychromatigraphychromatigraphychromat

10、igraphy）层层析析柱柱恒恒温温装装置置溶剂储瓶溶剂储瓶溶剂过滤器溶剂过滤器进样室进样室检测器检测器记录仪记录仪各类层析的原理和载体各类层析的原理和载体类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝 、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土 、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、纤

11、维素、 葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex聚焦层析聚焦层析 等电点和离子交换作用等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）几种主要沉淀方法比较几种主要沉淀方法比较几种主要沉淀方法比较几种主要沉淀方法比较常用层析技术常用层析技术及应用及应用吸附层析吸附层析分配层析分配层析凝胶过滤凝胶过滤（分子筛层析（分子筛层析）离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析 聚焦层析聚焦层析 吸附层析吸附层

12、析（absorption chromatographyabsorption chromatography）原理：原理：载体载体 ： 硅胶硅胶 氧化铝氧化铝 羟基磷石灰羟基磷石灰应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质等生化物质以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解定相上流过时，

13、各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。同速度随流动相向前移动。分分 配配 层层 析析 （distribuptiondistribuption chromatography chromatography） 原理：原理：载体载体 ：纤维素纤维素 硅藻土硅藻土 硅胶硅胶应用：应用：各种生化物质的分离鉴定各种生化物质的分离鉴定 分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为

14、流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。逆逆流流分分溶溶原原理理示示意意图图物质物质Y(Kd=1)的分配情况的分配情况溶剂溶剂 A物质物质Z(Kd=3)的的分配情况分配情况溶剂溶剂 B总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量平衡后平衡后转移转移 1转移转移 2转移转移 3分溶管号分溶管

15、号转移转移 4上相转移上相转移下相转移下相转移上相转移上相转移管管中中蛋蛋白白质质总总量量物质物质Y物质物质Z分溶曲线分溶曲线管号管号有效分配系数（有效分配系数（Keff） 某一物质在某一物质在A相中的总量相中的总量某一物质在某一物质在B相中的总量相中的总量分子筛层析分子筛层析（gel-filtration gel-filtration chromatographychromatography）基质基质 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（sepharose）应用应用 测定分子量测定分子量 脱盐和浓缩脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子分离提纯生物大分子 除去热原物质

16、除去热原物质 原原理理：凝凝胶胶层层析析也也称称为为排排阻阻凝凝胶胶层层析析、凝凝胶胶过过滤滤和和分分子子筛筛层层析析。它它是是60 年年代代发发展展起起来来的的，利利用用凝凝胶胶把把物物质质按按分分子子大大小小不不同同进进行行分分离离的的一一种种方方法法。由由于于被被分分离离物物质质的的分分子子大大小小（直直径径）和和形形状状不不同同，洗洗脱脱时时，大大分分子子物物质质由由于于直直径径大大于于凝凝胶胶网网孔孔不不能能进进入入凝凝胶胶内内部部，只只能能沿沿着着凝凝胶胶颗颗粒粒间间的的孔孔隙隙，随随溶溶剂剂向向下下移移动动，因因此此流流程程短短，首首先先流流出出层层析析柱柱，而而小小分分子子物物

17、质质，由由于于直直径径小小于于凝凝胶胶网网孔孔，能能自自由由进进出出胶胶粒粒网网孔孔，使使之之洗洗脱脱时时流流程程增增长长，移动速度慢而后流出层析柱。移动速度慢而后流出层析柱。分子筛层析分子筛层析原理示意图原理示意图分分子子筛筛层层析析与与洗洗脱脱曲曲线线凝胶颗粒凝胶颗粒收收集集蛋蛋白白质质管管蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子从柱上面加缓冲溶液从柱上面加缓冲溶液小分子小分子洗脱体积（洗脱体积（Ve）凝胶柱凝胶柱大分子大分子小分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质蛋白质Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mL）未知未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系

18、洗脱体积与相对分子质量的关系洗脱体积与相对分子质量的关系洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白MrMrMrMr“ “ “ “ 选择性曲线选择性曲线选择性曲线选择性曲线” ” ” ” G-200G-100logMrKav 离子交换层析离子交换层析（ion-change chromatographyion-change chromatography）原理原理基质基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用应用 制备纯化生物物质制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分定量、

19、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂离子交换剂与反离子结合与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离吸附阶段：样品与反离子进行交换子进行交换3、4. 解吸附阶段：用解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质下强吸附物质5.再生阶段：用原始平再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既衡液进行充分洗涤，既可重复使用可重复使用12345原始缓冲溶原始缓冲溶液的反离子液的反离子样品溶液样品溶液梯度浓度梯度浓度离离子子交交换换层层析析原原理理示示意意图图蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷的蛋

20、白质带负电荷的蛋白质收集样品的管收集样品的管收集样品的管收集样品的管带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质蛋白质混合物蛋白质混合物玻璃柱玻璃柱带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质收集样品的管收集样品的管NaClNaCl梯度梯度梯梯度度混混合合器器凝胶颗粒凝胶颗粒蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子小分子小分子储液瓶储液瓶混合瓶混合瓶层层析析柱柱磁力搅拌器磁力搅拌器洗脱剂体积（洗脱剂体积（mL）洗洗脱脱剂剂浓浓度度简单型梯度混合器简单型梯度混合器梯度洗脱曲线梯度洗脱曲线洗脱剂体积（洗脱剂体积（mL）洗洗脱脱剂剂浓浓度度储液瓶储液瓶混混合合瓶瓶

21、复合型梯度混合器复合型梯度混合器梯度洗脱曲线梯度洗脱曲线凸形凸形线形线形凹形凹形常用的阳离子交换剂常用的阳离子交换剂离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）纤维素（弱酸型） 羧甲基羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）纤维素（中强弱酸型） 磷酸基磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型） 磺乙基磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型） 磺丙基磺丙基常用的阴离子交换剂常用的阴离子交换剂AE-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型） 氨基乙基氨基乙基离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构PAB-纤维素（弱减型）纤

22、维素（弱减型） 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸DEAE-纤维素纤维素 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE -纤维素（强减型）纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）纤维素（强减型）二乙基（二乙基（2-羟丙羟丙基）基） -氨基乙基氨基乙基（中弱减型）中弱减型）（中弱减型）中弱减型）亲和层析亲和层析（affiuityaffiuity chromatography chromatography）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、 抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待

23、待纯化分子纯化分子配体配体a. 理论依据理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex亲亲和和层层析析原原理理示示意意图图蛋白质混合物蛋白质混合物配体配体与配体结合的与配体结合的蛋白质蛋白质加入的可溶性加入的可溶性配

24、基配基专一性结专一性结合蛋白质合蛋白质没有结合的没有结合的蛋白质蛋白质非专一性结非专一性结合蛋白质合蛋白质蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积与配体专一性与配体专一性结合蛋白质结合蛋白质加入配基加入配基基质基质聚焦层析（聚焦层析（ChromatofocusingChromatofocusing） 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。过程叫做聚焦效应。

25、pH梯度的形成梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时梯度的层析柱上时,由于洗脱由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。时被洗出。在聚焦层析过程中在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出一种样品分次加入时，只要先

26、加入者尚未洗出,并且有一定并且有一定的时间进行聚焦的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。其聚焦过程都能顺利完成。pH梯度溶液的形成示意图梯度溶液的形成示意图蛋白质蛋白质1（pI=7）蛋白质蛋白质2（pI=8）流速流速移动速率移动速率层析时的聚焦效应示意图层析时的聚焦效应示意图几种主要层析方法比较几种主要层析方法比较几种主要层析方法比较几种主要层析方法比较二二 、 电泳技术电泳技术 1电泳的一般原理电泳的一般原理 2. 电泳技术的类别电泳技术的类别 3、常用电泳技术常用电泳技术4、电泳技术的拓展电泳技术的拓展电泳的一般原理电泳的一般原理 电电泳泳是

27、是带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下向向着着与与其其电电荷荷相相反反的的电电极极移移动动的的现现象象 。许许多多生生物物分分子子都都带带有有电电荷荷，其其电电荷荷的的多多少少取取决决于于分分子子组组成成、性性质质及及其其所所在在介介质质的的pHpH。如如果果混混合合物物中中各各组组分分的的结结构构组组成成不不同同，在在某某一一pHpH溶溶液液中中，各各组组分分所所带带电电荷荷性性质质、电电荷荷数数量量不不同同，加加之之其其分分子子量量不不同同，在在同同一一电电场场的的作作用用下下，各各组组分分泳泳动动的的方方向向和和速速度度也也各各异异，而而达达到到分分离离鉴鉴定定各各组组分分的的目的。

28、目的。电电泳泳技技术术分分类类垂直板电泳垂直板电泳毛细管电泳毛细管电泳水平板电泳水平板电泳电电泳泳支支持持物物滤纸滤纸凝胶凝胶薄膜薄膜圆盘电泳圆盘电泳常用电泳技术常用电泳技术1、醋酸纤维薄膜电泳、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳3、琼脂糖电泳琼脂糖电泳 4、毛细管电泳毛细管电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）1、一般、一般PAGE2、SDS-PAGE3、PAGE等电点聚焦等电点聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelpolyacrylamideg

29、el electrophoresis electrophoresis，PAGEPAGEPAGEPAGE） PAGEPAGE是是在在区区带带电电泳泳原原理理的的基基础础上上，以以孔孔径径大大小小不不同同的的聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶( (PAG)PAG)作作为为支支持持物物，采采用用电电泳泳基基质质的的不不连连续续体体系系( (即即凝凝胶胶层层的的不不连连续续性性、缓缓冲冲液液离离子子成成分分的的不不连连续续性性、pHpH的的不不连连续续性性及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性) ) 或或 连连续续体体系系（一一层层凝凝胶胶、一一种种pHpH和和一一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。种缓

30、冲溶液），进行电泳分离一种方法。 PAGPAG是是用用丙丙烯烯酰酰胺胺( (acrylamideacrylamide，AcrAcr) )和和交交联联剂剂亚亚甲甲基基双双丙丙烯烯酰酰胺胺( (N N，N N - -methylenmethylen。bisacrylamidebisacrylamide，BisBis) )在在催催化化剂剂的的作作用用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。 化学聚合化学聚合: :催化剂过硫酸铵催化剂过硫酸铵( (AP)AP)，加速剂加速剂TEMEDTEMED 光聚合光聚合: :催化剂核黄素，加速剂催化剂核黄素，加速剂TEMEDTE

31、MED 不连续不连续PAGEPAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应浓缩效应不连续不连续PAGEPAGE的浓缩效应的浓缩效应样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶快离子快离子慢离子慢离子蛋白质蛋白质A AB BC C+-样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶电极缓电极缓冲液冲液低电位低电位梯度梯度E E1 11高电位高电位梯度梯度E E2 21+-SDS-PAGESDS-PAGE原理：原理： 当当SDSSDS（Sodium Sodium DodecylDodecyl Sulfate Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，

32、并远远超过了其原来的电荷，从而使分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在质在SDSSDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS -SDS -蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：线关系。可用下式表示： L

33、og Mr=a bmr应用应用: 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数测定蛋白质亚基数Mr（相对迁移率）相对迁移率）mr（相对迁移率）相对迁移率）Log Mr等电点聚焦（等电点聚焦（isoelectric isoelectric focusing focusing）原理原理: 在在一一定定抗抗对对流流介介质质（如如凝凝胶胶）中中加加入入两两性性电电解解质质载载体体(Ampholyte,是是一一种种多多氨氨基基多多羧羧基基的的混混合合物物，由由异异构构物物和和同同系系物物组组成成，其其pK和和pI值值各各自自相相异异却却又又相相近近），当当直直流流电电通通过过时时，便便形形成成一一

34、个个由由阳阳极极到到阴阴极极pH值值逐逐步步上上升升的的梯梯度度。两两性性化化合合物物在在此此电电泳泳过过程程中中，就就被被浓浓集集在在与与其其pI相相等等的的pH区区域域，从从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：应用： 高效率分离纯化蛋白质高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量pH10pH3pI1= pH8pI2= pH7pI3= pH5-+线线性性梯梯度度琼脂糖电泳琼脂糖电泳 琼琼脂脂糖糖是是由由D-D-半半乳乳糖糖和和3 3、6 6脱脱水水的的L-L-半半乳乳糖糖连连接接构构成成的的多多糖糖链链，这这种种多多糖糖链链在在1

35、001000 0C C左左右右时时呈呈液液态态，当当温温度度下下降降到到45450 0C C以以下下时时，它它们们之之间间以以氢氢键键方方式式相相互互连连接接就就成成了了线线性性双双链链单单环环的的琼琼脂脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶用用作作电电泳泳的的固固相相支支持持物物具具有有分分子子筛筛效效应应，其其对对生生物物分分子子的的分分离离作作用用不不仅仅与与其其分分子子的的构构象象及及其其相相对对分分子子质质量量大大小小有有关关，而而且且与与凝凝胶胶的的浓浓度度也也有有密密切切关关系系，故故可可根根据据分分离离对对象象分分子量大小选择子

36、量大小选择适当浓度的凝胶适当浓度的凝胶。 琼琼脂脂糖糖电电泳泳常常用用于于核核酸酸分分离离，用用各各种种浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶可可以以分离长度为分离长度为2 2OObPOObP至至5 5OkbOkb的的DNADNA， 琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。不同浓度琼脂糖凝胶分离不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围的范围琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度(%) (%) 可分辨的线性可分辨的线性DNADNA大小范围大小范围( (kb)kb) 0.3 60-50.3 60-5 0.6 20-1 0.6 20-1 0.7 10-0.8 0.7 10-0.8

37、0.9 7-0.5 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.2 6-0.4 1.5 4-0.2 1.5 4-0.2 2.0 3-0.1 2.0 3-0.1DNA相对分子质量相对分子质量标准物标准物水平型平板电泳槽水平型平板电泳槽 毛细管电泳毛细管电泳( (Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresis，CE)CE) 毛毛细细管管电电泳泳又又称称毛毛细细管管区区带带电电泳泳，它它是是在在毛毛细细管管（ 2-752-75mm）中中装装入入缓缓冲冲液液，从从其其一一端端注注入入样样品品，在在毛毛细细管管两两端端加加高高压压直直流流电电实实现现

38、对对样样品品的的分分离离，分分离离后后的的样样品品依依次次通通过过设设在在毛毛细细管管一一端端的的检检测测器器检检出出。该该法法克克服服了了传传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。 毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是9090年代最有影响年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、研究、分离合成的寡核苷酸、 DNADNA序列测定序列

39、测定及及PCRPCR产物的分析鉴定等。产物的分析鉴定等。 毛细管电泳原理示意图毛细管电泳原理示意图 毛细管电泳检测技术的发展毛细管电泳检测技术的发展 毛细管电泳分离模式的发展毛细管电泳分离模式的发展毛细管电泳装置示意图毛细管电泳装置示意图30KV高压电源高压电源光光源源光电倍光电倍增管增管数据采集数据采集石英玻璃石英玻璃毛细管毛细管缓冲液缓冲液-样品样品缓冲液缓冲液正极正极负极负极毛细管电泳检测技术的发展毛细管电泳检测技术的发展 （一）紫外可见光吸收（一）紫外可见光吸收 石石英英毛毛细细管管因因可可透透过过20nm波波长长以以下下的的紫紫外外光光，因因此此不不仅仅允允许许从从紫紫外外到到可可见

40、见光光这这一一波波长长范范围围内内对对样样品品组组分分进进行行检检测测。而而且且可可将将透透光光窗窗口口直直接接开开在在毛毛细细管管上上，进进行行“在在柱柱”检测。检测。 （二）荧光检测法（二）荧光检测法 是是毛毛细细管管电电泳泳中中一一种种常常见见的的“在在柱柱”检检测测法法，尤尤其其是是激激光光诱诱导导荧荧光光检检测测法法(LIF)，其灵敏度可高达其灵敏度可高达10-1210-16mol/ /L-1，是目前毛细管电泳中最灵敏的一种检测方法。是目前毛细管电泳中最灵敏的一种检测方法。 （三）电化学检测方法（三）电化学检测方法电电导导检检测测、电电位位检检测测、安安培培检检测测是是电电化化学学检

41、检测测常常用用的的三三种种方方法法，对对电电活活性性组组分分的的检检测测具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好以及价格低廉等特点。具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好以及价格低廉等特点。 （四）集成毛细管电泳芯片（四）集成毛细管电泳芯片 该该项项技技术术以以晶晶体体硅硅、玻玻璃璃、塑塑料料(指指有有机机玻玻璃璃)、陶陶瓷瓷和和硅硅橡橡胶胶为为基基本本材材料料，借借助助毛毛细细管管电电泳泳技技术术，将将样样品品进进样样、反反应应、分分离离、检检测测等等过过程程集集成成到到一一起起的的多多功功能能化化的的技技术术，该该项项工工作作与与分分析析仪仪器器的的微微型型化化、小小型型化化和和集集成成化化紧紧密密

42、相相连连,使使得得其其能能符符合合现现代代生生物化学、制药工业的低成本和高产出的需求。物化学、制药工业的低成本和高产出的需求。毛细管电泳分离模式的发展毛细管电泳分离模式的发展 （一）毛细管区带电泳（一）毛细管区带电泳 又又称称毛毛细细管管自自由由电电泳泳，毛毛细细管管内内只只充充入入缓缓冲冲溶溶液液，在在直直流流高高压压驱驱动动下下，溶溶质质以以不不同同的的速速率率在在分分立立的的区区带带内内进进行行迁迁移移而而被被分分离离。可可用用于于氨氨基基酸酸、多多肽肽、离离子子、对对映映体体等等物质的分析。物质的分析。 （二）毛细管凝胶电泳（二）毛细管凝胶电泳 将将板板上上的的凝凝胶胶移移到到毛毛细细

43、管管中中作作支支持持物物而而进进行行的的电电泳泳。凝凝胶胶具具有有多多孔孔性性,起起类类似似分分子子筛筛的的作作用用，溶溶质质按按分分子子大大小小进进行行分分离离。常常用用聚聚丙丙烯烯酸酸胺胺在在毛毛细细管管内内交交联联制制成成凝凝胶胶柱柱，可用于分离测定蛋白质和可用于分离测定蛋白质和DNA等，但制备繁琐，使用寿命短。等，但制备繁琐，使用寿命短。 （三）毛细管等电聚焦（三）毛细管等电聚焦(CIEF) 将将普普通通等等电电聚聚焦焦电电泳泳转转移移到到毛毛细细管管中中进进行行，在在高高压压作作用用下下，毛毛细细管管内内部部建建立立pH梯梯度度，蛋蛋白白质质在在毛毛细细管管中中向向各各自自的的等等电

44、电点点聚聚焦焦，形形成成明明显显的的区区带带，再再通通过过检检测测器器分分别别加以确认，常用于分离离子型物质。加以确认，常用于分离离子型物质。 （四）亲和毛细管电泳（四）亲和毛细管电泳(ACE) 建建立立在在生生物物分分子子之之间间的的亲亲和和作作用用基基础础上上，利利用用亲亲和和分分子子（如如抗抗原原与与抗抗体体、酶酶与与底底物物、配配体体与与受受体体等等）相相互互选选择择性性，通通过过毛毛细细管管电电泳泳来来测测定定这这些些分分子子，从从而而具具有有高高选选择择性性和和灵灵敏敏性性。传传统统的的亲亲和和分分析析有有很很多多优优点点，但但在在技技术术上上操操作作繁繁琐琐，自自动动化化程程度度

45、低低，测定周期长，因而亲和分析与毛细管电泳的联用正可弥补其局限性和缺点。测定周期长，因而亲和分析与毛细管电泳的联用正可弥补其局限性和缺点。电泳技术的拓展电泳技术的拓展1、免疫电泳、免疫电泳(immuno electrophoresis)2、单单细细胞胞凝凝胶胶电电泳泳技技术术(single cell gel electrophoresis assay，SCGE)，又称彗星试验又称彗星试验(Cometassay) 3、双向电泳双向电泳(two dimensional electrophoresis，2DE) 4、脉冲凝胶电泳脉冲凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresi

46、s，PFGE) 5、 连连 续续 型型 逆逆 向向 色色 谱谱 电电 泳泳 (continuous counteraction chromatographic electrophoresis，CACE) 6、介体电泳介体电泳 (preparative electrophoresis)7、 温温 度度 梯梯 度度 凝凝 胶胶 电电 泳泳 （ temperature gradient gel electrophoresis ）双向电泳图谱双向电泳图谱正常小鼠结肠组织蛋正常小鼠结肠组织蛋白质组的双向电泳白质组的双向电泳人胃癌人胃癌SGC7901细胞细胞蛋白质组的双向电泳蛋白质组的双向电泳第一向：第一

47、向：PAGE等电点聚焦（等电点聚焦（IEF），），第二向：第二向：SDS PAGE连续型逆向色谱电泳连续型逆向色谱电泳( (CACE)CACE)分离原理示意分离原理示意图图 载液载液色谱色谱阳极阳极阴极阴极目标产品富集区目标产品富集区填料填料（排阻区）（排阻区）填料填料（嵌入区）（嵌入区）净速度净速度电泳电泳色谱色谱净速度净速度电泳电泳目标蛋白的迁移情况目标蛋白的迁移情况三、三、 离心技术离心技术1离心机离心机类别类别 普通离心机普通离心机 1000转转/分分 高速离心机高速离心机 2-3万转万转/分分 超速离心机超速离心机 3万转万转/分分2沉降系数沉降系数（ sedimentation c

48、oefficient, s）3超离心法类别超离心法类别 密度梯度离心法密度梯度离心法（ density gradient ） 沉降速度法沉降速度法（sedimentation velocity） 沉降平恒法沉降平恒法（sedimentation eguilibrium）离离心心机机结结构构示示意意图图转头转头转头腔转头腔沉降样品沉降样品驱动马达驱动马达真空真空冷冻冷冻 沉降系数沉降系数（sedimentation coefficient） 生生物物大大分分子子在在单单位位离离心心力力场场作作用用下下的的沉沉降降速速度度称称为为沉沉降降系系数数。即即沉沉降降系系数数是是微微颗颗粒粒在在离离心心力

49、力场场的的作作用用下下，从从静静止止状状态态到达极限速度所需要的时间。到达极限速度所需要的时间。数学定义式为：数学定义式为： 沉降系数单位沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于于110110-13-13介于介于1010-13-13到到2001020010-13-13s s的范围，为方便起见，把的范围，为方便起见，把110110-13-13s s作为沉降系数的一个单位，用作为沉降系数的一个单位，用SvedbergSvedberg单位，用即单位，用即S S表示。表示。沉降系数（沉降系数（s s）与相对分子量（与相对分子量（MrMr）的关系的关系:

50、 :Mr =RTsD(1-)Svedberg方程方程:d /dt 2 s =s =密度梯度离心法（密度梯度离心法（density gradientdensity gradient） 生物大分子及颗粒的沉降不仅生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独最

51、后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有步收集。常用的介质有蔗糖蔗糖、氯氯化铯等。化铯等。滴加样品滴加样品离离心心管管蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖浓度蔗糖浓度1、核酸密度的测定、核酸密度的测定 = o + 4.2 2( 2- 02) 10-102、测定测定DNA中中G-C之含量之含量 Rolfe-Meselson公式：公式： = 0.100xG-C + 1.6583、溶液中核酸构象的研究溶液中核酸构象的研究 ：单链：单链DNA 双链双链DNA 蛋白质蛋白质 双链双链DNA RN

52、A4、核酸的制备核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心氯化铯密度梯度超离心经染料经染料-氯化铯密度梯氯化铯密度梯度超离心后，质粒度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布及各种杂质的分布超螺旋超螺旋DNA闭环质粒闭环质粒DNA开环质及开环质及线型线型DNA蛋白质蛋白质石蜡油石蜡油密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用沉降速率法（沉降速率法（ sedimentation velocitysedimentation velocity） 在离心场的作用下，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方在离心场的作用下，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方向（径向）移动，并产生沉降界面，界面的移动速

53、度代表蛋向（径向）移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋白质的沉降速度。在界面处由于浓度差造成折射率不同，可白质的沉降速度。在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，如借助适当的光学系统，如schlieren光学系统光学系统（也称暗线光学（也称暗线光学照相系统），观察到这种界面的移动。在照相系统），观察到这种界面的移动。在schlieren光学系统光学系统中，利用溶液的折射率梯度（中，利用溶液的折射率梯度（d /d）和样品的浓度梯度和样品的浓度梯度（dc/d）成正比这一特点，巧妙地设计光路，使移动的界成正比这一特点，巧妙地设计光路，使移动的界面以峰形曲线呈现在照相图片上，峰顶

54、代表移动界面。离心面以峰形曲线呈现在照相图片上，峰顶代表移动界面。离心机的装置允许在离心机转头旋转时，对界面的移动进行观察机的装置允许在离心机转头旋转时，对界面的移动进行观察和拍照。和拍照。分分析析型型超超速速离离心心机机光源光源柔性驱动轴柔性驱动轴热敏温度计热敏温度计样品池样品池准直准直透镜透镜液面液面沉降界面沉降界面溶剂溶剂配衡池配衡池沉降界面沉降界面聚光透镜聚光透镜马达马达滤光片滤光片溶质溶质空气空气沉降方向沉降方向照相机透镜照相机透镜园柱型透镜园柱型透镜底板底板Schlieren光闸光闸真空真空冷冻冷冻12cd /d沉降平衡法（沉降平衡法（ sedimentation sediment

55、ation eguilibriumeguilibrium ） 在较低速度（在较低速度（8,000-20,000r/min）的离心场中，离心开始的离心场中，离心开始时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度。因而时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度。因而产生了扩散作用，扩散力的作用方向正与离心力相反，当净离产生了扩散作用，扩散力的作用方向正与离心力相反，当净离心力与扩散平衡时，在离心池内从液面到池低形成一个由低到心力与扩散平衡时，在离心池内从液面到池低形成一个由低到高的恒定浓度梯度。如果测得相关参数即可算出生物分子的分高的恒定浓度梯度。如果测得相关参数即可算出生物分子的分子量。

56、子量。离心力离心力x1轴心轴心液面液面离心轴离心轴扩散力扩散力x2Mr=(1-) 2( 22-12)2RTdln(c2-c1)计算公式如下：计算公式如下：透透 析（析（dialysisdialysis）半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：等分开。常用的半透膜： 玻璃纸（赛璐玢纸，玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） 火绵纸（赛璐玎纸火绵纸（赛璐玎纸,

57、celloidin paper） 其他改型纤维素材料其他改型纤维素材料超过滤超过滤（ultrafiltrationultrafiltration） 利用压力、抽滤（利用压力、抽滤（A）或离或离心力（心力（B）等多种形式，强行使等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。相对分子量不同的蛋白质。 为了避免被膜截留的蛋白质为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用在膜表面上堆积，现常用截向截

58、向流过滤流过滤的方法，即液体在泵驱的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。蛋白质分子冲走。滤膜滤膜抽气抽气滤膜滤膜离心离心AB蛋白质、核酸的定性定量检测蛋白质、核酸的定性定量检测1、蛋白质的测定、蛋白质的测定 凯氏定氮法（凯氏定氮法（含含N量量 6. 25） 双缩脲法、双缩脲法、Folin-酚法酚法 紫外光度法（紫外光度法（ max=280nm） 离心法、电泳法、层析法离心法、电泳法、层析法2、酶活力的测定酶活力的测定 终点法、动力学法终点法、动力学法3、氨基酸的测定、氨基酸的测定 茚三酮法茚三酮法 Sangerf法、法、Edmam法、法、DNS法法4、核酸的测定、核酸的测定 紫外光度法（紫外光度法（ max=260nm） 分子杂交法分子杂交法 离心法、电泳法离心法、电泳法