植物离体繁殖

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1、22 22 第七章第七章 植物离体繁殖植物离体繁殖植物离体繁殖植物离体繁殖植物离体繁殖植物离体繁殖: : : : 利用组织培养技术对外植体进行离体培养，短期内获得遗传性利用组织培养技术对外植体进行离体培养，短期内获得遗传性一致的大量再生植株。也叫快繁或微繁（一致的大量再生植株。也叫快繁或微繁（propagation in propagation in vitro. Micropropagation)vitro. Micropropagation)。和传统方法突出和传统方法突出特点：特点： 1 1、繁殖效率高、繁殖效率高: :增值率高，生长速度快，可周年生产，增值率高，生长速度快，可周年生产，在

2、一个在一个短暂的时间，由单一个体开始，能产生出大量的遗传组成相短暂的时间，由单一个体开始，能产生出大量的遗传组成相同的植株。同的植株。 2 2、培养条件可控性强：人为提供培养基及小气候，便于对环境、培养条件可控性强：人为提供培养基及小气候，便于对环境进行控制，省去田间栽培繁杂劳动。进行控制，省去田间栽培繁杂劳动。3 3、便于管理、占地面积小：、便于管理、占地面积小：30m30m2 2可存放可存放1 1万多培养瓶，约万多培养瓶，约1010万多万多苗木。苗木。4 4、利于种质资源的保存及交换。、利于种质资源的保存及交换。 快速繁殖的应用快速繁殖的应用快速繁殖的应用快速繁殖的应用 （1 1）短期内获

3、得大量形状优良、整齐一致的种苗群体。加快）短期内获得大量形状优良、整齐一致的种苗群体。加快 引进新种、新育良种的繁殖，促进优良品种推广和应用。引进新种、新育良种的繁殖，促进优良品种推广和应用。（2 2）大量繁育原来常规方法不能进行无性繁殖、难繁殖和繁）大量繁育原来常规方法不能进行无性繁殖、难繁殖和繁 殖速度慢的一些植物，尤其对一些珍、稀、濒危的植物殖速度慢的一些植物，尤其对一些珍、稀、濒危的植物 的繁殖有更重要的意义。的繁殖有更重要的意义。（3 3）作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料。如）作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料。如 远缘杂种、多倍体、突变体。远缘杂种、多倍体、突

4、变体。（4 4）通过茎尖培养等技术脱毒，扩增脱毒苗，达到提纯复壮）通过茎尖培养等技术脱毒，扩增脱毒苗，达到提纯复壮 良种的目的。良种的目的。第一节第一节 植物快繁的器官形成方式植物快繁的器官形成方式由于植物种类不同，器官再生及快速繁殖的方式也不同。由于植物种类不同，器官再生及快速繁殖的方式也不同。1 1、短枝发生型短枝发生型短枝发生型短枝发生型：外植体为带叶单芽茎段，外植体为带叶单芽茎段， 培养为完整植株。特点：一次成苗，培养为完整植株。特点：一次成苗， 培养过程简单，容易移栽成活，遗传培养过程简单，容易移栽成活，遗传 形状稳定，如葡萄、红薯等试管苗繁殖。形状稳定，如葡萄、红薯等试管苗繁殖。2

5、 2、器官型（器官型（器官型（器官型（Organ typeOrgan typeOrgan typeOrgan type）：外植体带有：外植体带有 顶芽或腋芽。培养后形成顶芽或腋芽。培养后形成丛生芽丛生芽，转，转 入生根培养基，诱导生根成苗，扩大入生根培养基，诱导生根成苗，扩大 繁殖。特点：由单芽到丛芽，繁殖速繁殖。特点：由单芽到丛芽，繁殖速 度快，遗传形状稳定，多数花卉、苗木度快，遗传形状稳定，多数花卉、苗木 的快繁属于次类。的快繁属于次类。3 3、器官发生型器官发生型器官发生型器官发生型（OrganogenesisOrganogenesis）：）： 直接由外植体上或从愈伤组织产生直接由外植体

6、上或从愈伤组织产生 不定芽不定芽，经过脱分化与再分化成苗。，经过脱分化与再分化成苗。 特点：繁殖速度快，有由愈伤组织特点：繁殖速度快，有由愈伤组织 再生植株，遗传不稳定。烟草、水再生植株，遗传不稳定。烟草、水 稻、小麦、番茄等。稻、小麦、番茄等。4 4、胚胎发生型胚胎发生型胚胎发生型胚胎发生型（EmbryogenesisEmbryogenesis）：）：外植体脱分化产生愈伤组织或细胞团，外植体脱分化产生愈伤组织或细胞团，再分化为胚状体产生小植株。一般胚再分化为胚状体产生小植株。一般胚状体发生经过：球形期、心形期、鱼状体发生经过：球形期、心形期、鱼雷期、子叶期。特点：发生数量大，雷期、子叶期。特

7、点：发生数量大，速度快，结构完整，人工种子繁殖，遗传变异。速度快，结构完整，人工种子繁殖，遗传变异。5 5、原球茎发生型原球茎发生型原球茎发生型原球茎发生型（ProtocormProtocorm）：兰科。）：兰科。 茎尖或腋芽外植体通过形成原球茎，茎尖或腋芽外植体通过形成原球茎， 而发育为完整植株。而发育为完整植株。唐菖蒲唐菖蒲第二节第二节第二节第二节 植物快繁的程序和关键技术植物快繁的程序和关键技术植物快繁的程序和关键技术植物快繁的程序和关键技术离体无性繁殖的程序包括：离体无性繁殖的程序包括：1 1、无菌母株的制备、无菌母株的制备 初代培养：初代培养： 在无菌条件下，制备无菌繁殖的材料称为无

8、菌母株，或繁殖在无菌条件下，制备无菌繁殖的材料称为无菌母株，或繁殖母株（母株（stock plant)stock plant)。培养基激素配比，取材的年龄、大小和生理状态。培养基激素配比，取材的年龄、大小和生理状态。初代培养的启动生长方式初代培养的启动生长方式: :腋芽被刺激后生长腋芽被刺激后生长; ;茎段、叶片、其它器官伤口茎段、叶片、其它器官伤口处产生不定芽；外植体切口产生愈伤组织。此阶段一般需要处产生不定芽；外植体切口产生愈伤组织。此阶段一般需要4-64-6周。周。茎尖培养茎段培养茎尖培养分化茎尖培养分化茎尖培养分化茎尖培养分化补血草的快速繁殖补血草的快速繁殖补血草的快速繁殖补血草的快速

9、繁殖2 2、继代芽的增殖、继代芽的增殖 无菌母株再次切割继代培养，芽分化增殖成丛无菌母株再次切割继代培养，芽分化增殖成丛芽，加快繁殖速度。在快速繁殖过程中，随培芽，加快繁殖速度。在快速繁殖过程中，随培养时间和继代次数增加，芽分化和生长速率降养时间和继代次数增加，芽分化和生长速率降低，称为低，称为驯化现象驯化现象，与内源激素和恒定培养条，与内源激素和恒定培养条件有关，故可以调节激素配比或变温处理，提件有关，故可以调节激素配比或变温处理，提高繁殖速度。高繁殖速度。3 3 3 3、芽苗生根培养芽苗生根培养芽苗生根培养芽苗生根培养 诱导无根苗生根的方法有两种：诱导无根苗生根的方法有两种：1 1）试管内

10、生根试管内生根： 将无菌小枝条转入生根培养基中进行培养。将无菌小枝条转入生根培养基中进行培养。 生根培养基中的营养元素含量往往降低、需要适当提高生长生根培养基中的营养元素含量往往降低、需要适当提高生长素类物质（素类物质（NAA,IBA)NAA,IBA)的浓度，降低细胞分裂素的浓度。降的浓度，降低细胞分裂素的浓度。降低无机盐和有机物含量，如一般低无机盐和有机物含量，如一般1/2MS1/2MS或或1/4MS1/4MS培养基。培养基。2 2）试管外生根试管外生根： 有些植物可以将离体条件下形成的枝条，有些植物可以将离体条件下形成的枝条，在基部切口处用生根粉或与滑石粉混合的在基部切口处用生根粉或与滑石

11、粉混合的IBAIBA涂抹，然后种植到温室或田间中。涂抹，然后种植到温室或田间中。 这样的方法可大大降低成本。这样的方法可大大降低成本。4 4 4 4、再生植株的锻炼和移栽、再生植株的锻炼和移栽、再生植株的锻炼和移栽、再生植株的锻炼和移栽A A A A、移栽前后培养条件发生改变：、移栽前后培养条件发生改变：、移栽前后培养条件发生改变：、移栽前后培养条件发生改变：试管苗：恒温、高湿、弱光、无菌、充足的营养。试管苗：恒温、高湿、弱光、无菌、充足的营养。试管苗：恒温、高湿、弱光、无菌、充足的营养。试管苗：恒温、高湿、弱光、无菌、充足的营养。自然条件下，变温、低湿、强光、有菌、缺乏营养。自然条件下，变温

12、、低湿、强光、有菌、缺乏营养。自然条件下，变温、低湿、强光、有菌、缺乏营养。自然条件下，变温、低湿、强光、有菌、缺乏营养。B B B B、移栽后植株死亡的原因、移栽后植株死亡的原因、移栽后植株死亡的原因、移栽后植株死亡的原因: : : :1 1 1 1）根系结构不完善）根系结构不完善）根系结构不完善）根系结构不完善: : : :不生根（木本植物）、根与芽的输导组织不生根（木本植物）、根与芽的输导组织不生根（木本植物）、根与芽的输导组织不生根（木本植物）、根与芽的输导组织不相通（愈伤组织）、再生根的吸收功能差。不相通（愈伤组织）、再生根的吸收功能差。不相通（愈伤组织）、再生根的吸收功能差。不相通

13、（愈伤组织）、再生根的吸收功能差。2 2 2 2）叶部结构不完善）叶部结构不完善）叶部结构不完善）叶部结构不完善：缺少角质层或蜡质层，保水性差；缺乏叶：缺少角质层或蜡质层，保水性差；缺乏叶：缺少角质层或蜡质层，保水性差；缺乏叶：缺少角质层或蜡质层，保水性差；缺乏叶表皮毛，保湿、反光性差；气孔开度过大，关闭能力差；表皮毛，保湿、反光性差；气孔开度过大，关闭能力差；表皮毛，保湿、反光性差；气孔开度过大，关闭能力差；表皮毛，保湿、反光性差；气孔开度过大，关闭能力差；叶片中栅栏组织发育不完善，光合能力低。叶片中栅栏组织发育不完善，光合能力低。叶片中栅栏组织发育不完善，光合能力低。叶片中栅栏组织发育不完

14、善，光合能力低。 C C、克服这些因素的方法：、克服这些因素的方法： 要在培养瓶中培育壮苗、开瓶后要练苗。要在培养瓶中培育壮苗、开瓶后要练苗。 壮苗的措施：壮苗的措施： 培养基中加入适宜的生长延缓剂（多效唑、矮壮素、培养基中加入适宜的生长延缓剂（多效唑、矮壮素、B9B9等）。等）。 练苗的措施：练苗的措施： 1 1）日光锻炼日光锻炼：恢复、提高叶片的光合作用的能力，使小苗由：恢复、提高叶片的光合作用的能力，使小苗由 异养向自养过渡。异养向自养过渡。 2 2）湿度锻炼湿度锻炼：移栽前，开瓶练苗，使小苗逐步适应周围的湿：移栽前，开瓶练苗，使小苗逐步适应周围的湿 度条件。度条件。DD、移栽过程要注意

15、的一些问题、移栽过程要注意的一些问题、移栽过程要注意的一些问题、移栽过程要注意的一些问题将小苗根系周围的培养基冲洗干净，以避免有害微生物的将小苗根系周围的培养基冲洗干净，以避免有害微生物的将小苗根系周围的培养基冲洗干净，以避免有害微生物的将小苗根系周围的培养基冲洗干净，以避免有害微生物的污染。污染。污染。污染。筛选适宜的移栽基质：砂、蛭石、腐叶土和土壤配置使用筛选适宜的移栽基质：砂、蛭石、腐叶土和土壤配置使用筛选适宜的移栽基质：砂、蛭石、腐叶土和土壤配置使用筛选适宜的移栽基质：砂、蛭石、腐叶土和土壤配置使用也可以单独使用。以保持良好的排水性与通气性。也可以单独使用。以保持良好的排水性与通气性。

16、也可以单独使用。以保持良好的排水性与通气性。也可以单独使用。以保持良好的排水性与通气性。选择使用营养钵、苗床或塑料薄膜以及遮阳网，以调控光、选择使用营养钵、苗床或塑料薄膜以及遮阳网，以调控光、选择使用营养钵、苗床或塑料薄膜以及遮阳网，以调控光、选择使用营养钵、苗床或塑料薄膜以及遮阳网，以调控光、温、湿度等。温、湿度等。温、湿度等。温、湿度等。当移栽后的小苗能开始生长，说明已经能够在正常的环境当移栽后的小苗能开始生长，说明已经能够在正常的环境当移栽后的小苗能开始生长，说明已经能够在正常的环境当移栽后的小苗能开始生长，说明已经能够在正常的环境下生长。下生长。下生长。下生长。营养钵移栽营养钵移栽第三

17、节第三节 植物快繁过程中的关键问题植物快繁过程中的关键问题一、污染：一、污染：一、污染：一、污染： 原因：培养基器具灭菌不彻底，原因：培养基器具灭菌不彻底，原因：培养基器具灭菌不彻底，原因：培养基器具灭菌不彻底， 操作的人为带入，环境不清洁。操作的人为带入，环境不清洁。操作的人为带入，环境不清洁。操作的人为带入，环境不清洁。 控制：控制：控制：控制：二、遗传稳定性：二、遗传稳定性：二、遗传稳定性：二、遗传稳定性：基因型：变异频率不同；基因型：变异频率不同；基因型：变异频率不同；基因型：变异频率不同；继代次数：随着继代次数增加，变异系数增加。继代次数：随着继代次数增加，变异系数增加。继代次数：随

18、着继代次数增加，变异系数增加。继代次数：随着继代次数增加，变异系数增加。器官发生方式器官发生方式器官发生方式器官发生方式: : : :以茎段、不定芽的方式繁殖不宜变异，而通过以茎段、不定芽的方式繁殖不宜变异，而通过以茎段、不定芽的方式繁殖不宜变异，而通过以茎段、不定芽的方式繁殖不宜变异，而通过愈伤组织、生殖器官的培养易发生变异。愈伤组织、生殖器官的培养易发生变异。愈伤组织、生殖器官的培养易发生变异。愈伤组织、生殖器官的培养易发生变异。控制：减少培养基中容易诱导变异的物质、定期清除不正常控制：减少培养基中容易诱导变异的物质、定期清除不正常控制：减少培养基中容易诱导变异的物质、定期清除不正常控制：

19、减少培养基中容易诱导变异的物质、定期清除不正常 的组培苗。的组培苗。的组培苗。的组培苗。 三、玻璃化：三、玻璃化：三、玻璃化：三、玻璃化：玻璃化苗：玻璃化苗： 是由于试管苗发生生理失调，而形成的发育不正常是由于试管苗发生生理失调，而形成的发育不正常的组培苗。常常表现为叶片皱缩、易碎、嫩叶呈水浸透的组培苗。常常表现为叶片皱缩、易碎、嫩叶呈水浸透明状。移栽后常死亡。明状。移栽后常死亡。原因：原因：培养基中琼脂与蔗糖的浓度低；培养基中琼脂与蔗糖的浓度低；细胞分裂素与生长素比例失调；细胞分裂素与生长素比例失调；培养基中含氮量高；培养基中含氮量高；培养温度高；培养温度高；光照不足。光照不足。防止措施防止

20、措施: :加入琼脂提高培养基硬度；加入琼脂提高培养基硬度；提高蔗糖含量，降低培养基的渗透压；提高蔗糖含量，降低培养基的渗透压；减少含氮成分；减少含氮成分；降低温度或变温处理、提高光照。降低温度或变温处理、提高光照。添加抗玻璃化的化学物质：活性炭、聚乙烯醇、多效唑、添加抗玻璃化的化学物质：活性炭、聚乙烯醇、多效唑、青霉素等。青霉素等。表表表表9-1 9-1 组织培养中不同植物玻璃化的原因与对策组织培养中不同植物玻璃化的原因与对策组织培养中不同植物玻璃化的原因与对策组织培养中不同植物玻璃化的原因与对策四、褐化四、褐化四、褐化四、褐化 是指培养材料向培养基中释放褐色物质，使培养基和培养是指培养材料向

21、培养基中释放褐色物质，使培养基和培养是指培养材料向培养基中释放褐色物质，使培养基和培养是指培养材料向培养基中释放褐色物质，使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。材料逐渐变褐而死亡的现象。材料逐渐变褐而死亡的现象。材料逐渐变褐而死亡的现象。 本质：本质：本质：本质： 酚类酚类酚类酚类物质在多酚氧化酶的作用下，氧化形成褐色的物质在多酚氧化酶的作用下，氧化形成褐色的物质在多酚氧化酶的作用下，氧化形成褐色的物质在多酚氧化酶的作用下，氧化形成褐色的醌类醌类醌类醌类物物物物 质，导致植株中蛋白质变性、酶失活。质，导致植株中蛋白质变性、酶失活。质，导致植株中蛋白质变性、酶失活。质，导致植株中蛋白质变性、酶

22、失活。 原因：原因：原因：原因：植物的品种与种类；植物的品种与种类；植物的品种与种类；植物的品种与种类；外植体的生长发育时期；外植体的生长发育时期；外植体的生长发育时期；外植体的生长发育时期；外植体的切口；外植体的切口；外植体的切口；外植体的切口；培养温度；培养时间：培养温度；培养时间：培养温度；培养时间：培养温度；培养时间：培养基中成分：无机盐高、细胞分裂素高。培养基中成分：无机盐高、细胞分裂素高。培养基中成分：无机盐高、细胞分裂素高。培养基中成分：无机盐高、细胞分裂素高。防止措施：防止措施：外植体的选择：外植体的选择：培养基中激素的调整；培养基中激素的调整；培养基中添加抗氧化剂等。抗坏血酸

23、、柠檬酸、活性炭培养基中添加抗氧化剂等。抗坏血酸、柠檬酸、活性炭等。等。培养温度降低、光照减少；培养温度降低、光照减少；缩短继代培养时间。缩短继代培养时间。五、黄化五、黄化五、黄化五、黄化是指试管苗整株失绿、叶片全部或部分发生黄化现象。是指试管苗整株失绿、叶片全部或部分发生黄化现象。是指试管苗整株失绿、叶片全部或部分发生黄化现象。是指试管苗整株失绿、叶片全部或部分发生黄化现象。原因：原因：原因：原因：培养基成分：含铁量少、或矿质营养不平衡、激素配比培养基成分：含铁量少、或矿质营养不平衡、激素配比培养基成分：含铁量少、或矿质营养不平衡、激素配比培养基成分：含铁量少、或矿质营养不平衡、激素配比失衡

24、、糖分不足。失衡、糖分不足。失衡、糖分不足。失衡、糖分不足。培养条件：通气差、光温及酸碱度不适、抗生素的使用。培养条件：通气差、光温及酸碱度不适、抗生素的使用。培养条件：通气差、光温及酸碱度不适、抗生素的使用。培养条件：通气差、光温及酸碱度不适、抗生素的使用。控制：调节培养基成分，调节温度控制：调节培养基成分，调节温度控制：调节培养基成分，调节温度控制：调节培养基成分，调节温度实例：毛白杨的快速繁殖实例：毛白杨的快速繁殖实例：毛白杨的快速繁殖实例：毛白杨的快速繁殖 ( ( ( (Populus tomentosaPopulus tomentosaPopulus tomentosaPopulus

25、 tomentosa var.) var.) var.) var.) n n用休眠芽茎尖培养。用休眠芽茎尖培养。用休眠芽茎尖培养。用休眠芽茎尖培养。 取当年形成的直径约取当年形成的直径约取当年形成的直径约取当年形成的直径约0.50.50.50.5的枝条，切成的枝条，切成的枝条，切成的枝条，切成1.51.51.51.52.02.02.02.0带休眠芽茎段，用带休眠芽茎段，用带休眠芽茎段，用带休眠芽茎段，用70%70%70%70%酒精消毒酒精消毒酒精消毒酒精消毒30S30S30S30S，5%5%5%5%次氯酸钠消毒次氯酸钠消毒次氯酸钠消毒次氯酸钠消毒7 7 7 78min8min8min8min，

26、无菌水冲洗，于超净，无菌水冲洗，于超净，无菌水冲洗，于超净，无菌水冲洗，于超净台上剥取茎尖，将有台上剥取茎尖，将有台上剥取茎尖，将有台上剥取茎尖，将有2 2 2 23 3 3 3片幼叶的茎尖接种到片幼叶的茎尖接种到片幼叶的茎尖接种到片幼叶的茎尖接种到培养基上。培养基上。培养基上。培养基上。n n最适培养基为最适培养基为最适培养基为最适培养基为MSMSMSMS基本培养基。基本培养基。基本培养基。基本培养基。 BA 0.5 BA 0.5 BA 0.5 BA 0.5/L+NAA 0.02/L+NAA 0.02/L+NAA 0.02/L+NAA 0.02/L/L/L/L，赖氨酸，赖氨酸，赖氨酸，赖氨酸

27、100100100100/L/L/L/L，2%2%2%2%蔗糖，蔗糖，蔗糖，蔗糖，PH5.8PH5.8PH5.8PH5.8，温度，温度，温度，温度2525252527272727培养。连续光培养。连续光培养。连续光培养。连续光照，光强照，光强照，光强照，光强1000Lx1000Lx1000Lx1000Lx以上，以上，以上，以上，2 2 2 23 3 3 3月后，部分茎尖分月后，部分茎尖分月后，部分茎尖分月后，部分茎尖分化出嫩枝。化出嫩枝。化出嫩枝。化出嫩枝。n n诱导生根。诱导生根。诱导生根。诱导生根。 将茎尖长出的嫩枝，从基部切下，转移到配制的生根培将茎尖长出的嫩枝，从基部切下，转移到配制的

28、生根培将茎尖长出的嫩枝，从基部切下，转移到配制的生根培将茎尖长出的嫩枝，从基部切下，转移到配制的生根培养基上，养基上，养基上，养基上， MS+IBA 0.25 MS+IBA 0.25 MS+IBA 0.25 MS+IBA 0.25/L/L/L/L，VB1VB1VB1VB1提高到提高到提高到提高到100100100100/L/L/L/L，蔗糖，蔗糖，蔗糖，蔗糖1.5%1.5%1.5%1.5%，约有，约有，约有，约有10%10%10%10%的嫩枝可生根。的嫩枝可生根。的嫩枝可生根。的嫩枝可生根。 通过反复切段繁殖，可获得大量的植株。通过反复切段繁殖，可获得大量的植株。通过反复切段繁殖，可获得大量的

29、植株。通过反复切段繁殖，可获得大量的植株。n n试管苗的移栽。试管苗的移栽。试管苗的移栽。试管苗的移栽。 当根长当根长当根长当根长1.51.51.51.5时，从培养容器取出，洗净残留在植物上的时，从培养容器取出，洗净残留在植物上的时，从培养容器取出，洗净残留在植物上的时，从培养容器取出，洗净残留在植物上的琼脂，移到温室内，装有蛭石的苗床上，或细沙的化盆琼脂，移到温室内，装有蛭石的苗床上，或细沙的化盆琼脂，移到温室内，装有蛭石的苗床上，或细沙的化盆琼脂，移到温室内，装有蛭石的苗床上，或细沙的化盆中，如盖塑料膜。以保持温度，每天定时掀膜通气，中，如盖塑料膜。以保持温度，每天定时掀膜通气，中，如盖塑

30、料膜。以保持温度，每天定时掀膜通气，中，如盖塑料膜。以保持温度，每天定时掀膜通气，1010101015151515天后可去掉塑料膜，待植株长出天后可去掉塑料膜，待植株长出天后可去掉塑料膜，待植株长出天后可去掉塑料膜，待植株长出1 1 1 12 2 2 2片新叶，再移片新叶，再移片新叶，再移片新叶，再移到草木灰和沙土（到草木灰和沙土（到草木灰和沙土（到草木灰和沙土（3 3 3 3：1 1 1 1）土壤中，其成活率）土壤中，其成活率）土壤中，其成活率）土壤中，其成活率90%90%90%90%以上，春以上，春以上，春以上，春季移栽时，当年幼苗可长季移栽时，当年幼苗可长季移栽时，当年幼苗可长季移栽时，当年幼苗可长2m2m2m2m以上。以上。以上。以上。