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1、分子生物学实验 1 1、 每组同学做一份实验；每组同学做一份实验；2 2、 遵守实验室规则，穿白衣；遵守实验室规则，穿白衣；3 3、 同学们在听课时要作好记录同学们在听课时要作好记录; ; 4 4、 上课时间。上课时间。欢迎大家参加分生实验课的学习！欢迎大家参加分生实验课的学习！ 1. 1. 实验成绩考核占总成绩实验成绩考核占总成绩15%15%。 2. 2. 每次实验报告每次实验报告5 5分含随堂测试，共三次，合分含随堂测试，共三次，合1515分。分。 3. 3. 缺实验缺实验课课成绩者，本课程不予通过。成绩者，本课程不予通过。【每名同学的每名同学的3 3个实验报告放在一起，最后一次实验课交。
2、个实验报告放在一起，最后一次实验课交。学生交卷后签名。教师按学号排卷。学生交卷后签名。教师按学号排卷。】2013年 五年制 实验课考试形式1. 1. 加样器加样器2. 2. 离心机离心机 先介绍本轮实验中两种常用仪器的使用方法3 3、 根据取样量，根据取样量，选择合适量程的加样器选择合适量程的加样器。顶部标记加样器的顶部标记加样器的最大量程最大量程，分别为：，分别为：20 l: 0.5 20 l100 l: 20 100 l 1000 l: 200 1000 l 一、加样器的使用及注意事项一、加样器的使用及注意事项 1 1、 用途用途 微量吸取液体微量吸取液体 2 2、 每组每组3 3支加样器
3、支加样器 Q Q：如果要吸取如果要吸取5l5l、50l50l、150l150l、 500l500l的的液体，应选择哪个加样器液体，应选择哪个加样器? ?练习：加样器读数为练习：加样器读数为练习：加样器读数为练习：加样器读数为 100100，实际体积各为多少，实际体积各为多少，实际体积各为多少，实际体积各为多少? ?4 4、如何调节？、如何调节？(1)(1)首先观察目前的读数首先观察目前的读数, ,假设为假设为050:050: 最大量程为最大量程为2020 l l的加样器的加样器 5 5 l l 最大量程为最大量程为100100 l l的加样器的加样器 50 50 l l 最大量程为最大量程为1
4、0001000 l l的加样器的加样器 500 500 l l (2) (2) 顺时针调节顺时针调节- - 读数变小读数变小 逆时针调节逆时针调节- - 读数变大读数变大(3) (3) 注注意意：调调节节前前，加加样样器器读读数数正正处处于于最最大大量量程程或或最最小小量量程程时时，如如果果向向错错误误方方向向调调节节，马马上上会会超超出出量量程，将会损害加样器的精度。程，将会损害加样器的精度。 5 5、加样器使用步骤：、加样器使用步骤：1 1）选择选择加加样样器器, ,观观察察读读数数, ,调节读调节读数。数。 安装吸安装吸头头要要紧紧密密( (不要用手直接拿吸不要用手直接拿吸头头) )，安
5、装后旋，安装后旋转转固定一下。固定一下。2 2）在）在液面外液面外液面外液面外，先按到，先按到第一第一第一第一挡挡挡挡。3 3）将吸）将吸头头插入液面下的插入液面下的适当深度适当深度: : 过过深可能会腐深可能会腐蚀蚀加加样样器器, , 过过浅可能会吸入空气。浅可能会吸入空气。4 4）缓缓慢慢松开拇指松开拇指, ,吸取液体。吸取液体。 完全放开拇指后，完全放开拇指后，停留停留半秒半秒钟钟。急于离开液面，易吸入空气。急于离开液面，易吸入空气。5 5）抬起加）抬起加样样器器, ,估估计计体体积积是否正确是否正确, ,将外壁液体用容器口引流回去将外壁液体用容器口引流回去6 6）贴贴容器内壁，加容器内
6、壁，加样样器推到器推到第二挡第二挡第二挡第二挡将液体将液体匀速匀速打出。打出。( (吸吸头头内有液内有液体体时时，不能将加，不能将加样样器平放或倒置，液体会倒流器平放或倒置，液体会倒流损损坏加坏加样样器！器！) )7) 7) 观观察吸察吸头头内液体是否完全打出，将吸内液体是否完全打出，将吸头头弃于弃于废废物盒内。物盒内。第一挡为实际读数体积，第一挡为实际读数体积，第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。 1 1、打开电源、打开电源 2 2、离心管中的液体为、离心管中的液体为2/3,2/3,盖紧盖子盖紧盖子, ,防止离心机被腐蚀。防止离心机被腐
7、蚀。1 1代表转速盘上方的数据，代表转速盘上方的数据，2 2代表下方的数据。代表下方的数据。 3 3、将样品、将样品标记标记好并配平好并配平, , 对称对称放入离心机（管放入离心机（管的连接处朝外）。的连接处朝外）。 4 4、设定离心的转速和时、设定离心的转速和时间。间。 5 5、统一统一离心。离心。Team Work二、离心机的使用二、离心机的使用及注意事项及注意事项 实验一、实验一、 细胞总细胞总RNARNA的提取及逆的提取及逆转录转录实验内容：实验内容：1、小鼠肝脏组织、小鼠肝脏组织总总RNA的提取的提取 2、RNA的的变性变性琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳电泳 3、以总、以总RNA为模板的为
8、模板的逆转录逆转录反应反应一、真核细胞的总一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5鸟鸟嘌嘌呤呤7位甲基化位甲基化CH3修修饰饰。 1）免受核酸）免受核酸酶酶破坏，破坏， 2）起始、促）起始、促进进蛋白蛋白质质合成。合成。 3poly(A)尾巴尾巴结结构构 20-200个个A. 翻翻译译所必需。所必需。 起始密起始密码码：AUG 终终止密止密码码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大大亚亚基基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小小亚亚基基40S: 18S=1874nt第一步：第一步： 提取小鼠肝
9、脏组织的提取小鼠肝脏组织的RNA二、二、RNA提取的注意事项提取的注意事项 RNARNA酶酶酶酶：广泛存在：灰：广泛存在：灰尘尘、人体唾液、人体唾液、实验实验器材表面。器材表面。 生物活性非常生物活性非常稳稳定：耐定：耐热热、耐酸、耐碱。、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免尽量避免外外源性源性RNase 污污染染 A. 操作操作环环境空气境空气洁净洁净。带带手套、口罩。手套、口罩。 B. 用新开封的化学用新开封的化学试剂试剂。（。（试剂应该专试剂应该专用）用） C. 一次性塑料器材最好是新开封，一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水水处处理后）高理后）高压灭压灭菌。菌。 D. 玻璃器材、水都玻璃
10、器材、水都应该经过应该经过去去RNase 处处理。理。 对对玻璃器材玻璃器材还应该进还应该进行高温烘烤。行高温烘烤。 2、抑制、抑制内内源性源性RNase 活性：活性： RNase 抑制抑制剂剂。 RNA分离的关键因素：避免分离的关键因素：避免RNA酶的污染。酶的污染。1) 1) 发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。 将将1mL 1mL TrizolTrizol试剂移入试剂移入EppendorfEppendorf管中。管中。2) 2) 实实验验教教师师操操作作: : 取取新新鲜鲜小小鼠鼠肝肝脏脏组组织织，组组织织块块不不宜过大宜过大, ,放在玻片
11、上立即研磨放在玻片上立即研磨, ,研磨要彻底。研磨要彻底。3) 3) 将将研研磨磨后后的的组组织织( (小小米米粒粒大大小小) )转转移移至至1mL1mL的的TrizolTrizol 试试剂剂中中，盖盖紧紧盖盖，上上下下颠颠倒倒混混合合2min2min以以上上。使使组组织织细细胞胞充充充充分分分分裂裂裂裂解解解解。肉肉眼眼观观察察可可见见液液体体变变成成均均匀浑浊状。匀浑浊状。 4)4)室温孵育室温孵育10 min10 min。三、三、RNA提取的实验操作提取的实验操作 1 1、异硫氰酸胍法异硫氰酸胍法： GuSCNGuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同是一种强的蛋白质变性剂，裂解细
12、胞的同时，还能有效地抑制内源性时，还能有效地抑制内源性 RNaseRNase的活性，通过有机的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNARNA。 特点：需低温操作，但价格经济。特点：需低温操作，但价格经济。2 2 2 2、TrizolTrizolTrizolTrizol 试剂试剂试剂试剂（商品化产品）（商品化产品）（商品化产品）（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总RNARNARNARNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。简单、快速、提取量大、纯度高。
13、简单、快速、提取量大、纯度高。简单、快速、提取量大、纯度高。3 3、mRNAmRNA提取试剂盒提取试剂盒 真核细胞真核细胞mRNAmRNA的的3 3末端有末端有ploy(A)ploy(A)尾，利用寡聚尾，利用寡聚 dTdT纤维素结合纤维素结合mRNAmRNA，将其从细胞总将其从细胞总RNARNA中分离出来。中分离出来。课间课间介介绍绍 RNA提取的几种方法提取的几种方法RNase抑制抑制剂剂介介绍绍1、DEPCDEPC ( 二乙基焦炭酸二乙基焦炭酸盐盐) 最常用的最常用的RNase抑制抑制剂剂: 与蛋白与蛋白质质中的中的组组氨酸氨酸结结合，使蛋白合，使蛋白质质变变性。性。 有效有效浓浓度：度：
14、0.05%-0.1%(DEPC水水)，室温磁力，室温磁力搅搅拌拌20分分钟钟。用于浸泡各种器材。用于浸泡各种器材。 灭灭活条件：高活条件：高压压。 在在Tris溶液中半衰期溶液中半衰期为为1.25min。 试剂试剂的配制的配制:无无RNase的溶液的溶液(用用DEPC水配制水配制, 高高压压) 储储存方法：不能用聚苯乙存方法：不能用聚苯乙烯烯器皿。器皿。4 C ，或液氮中。或液氮中。2、肝素肝素肝素肝素： 使用使用浓浓度：度：0.110mg/ml 效效 果果: 37 C 时时，可抑制，可抑制95%的的RNase 活力。活力。 如果与如果与DEPC联联合合应应用，用， 具有极具有极强强的抑制的抑
15、制 效果。效果。5)5)加入加入200 200 l l氯仿氯仿氯仿氯仿， 震荡混匀震荡混匀20-30s20-30s，室温放置室温放置5min5min（此期间液体开始（此期间液体开始分层分层分层分层，此时不要轻易搅动液体此时不要轻易搅动液体）。）。)10000 rpm)10000 rpm，离心，离心5min5min。RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein7) 7) 将清澈透明的将清澈透明的上上上上层水相层水相层水相层水相 转移至另一离心管中。转移至另一离心管中。三、三、RNA提取的实验操作提取的实验操作 8) 8) 沉淀沉淀RNARNA： 加入加入0.5ml0.5ml异丙醇异丙醇异丙醇
16、异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置，上下颠倒混匀，室温放置10min10min。 10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min。弃上清。弃上清。) ) 加加1ml1ml 75%75%75%75%乙醇乙醇乙醇乙醇洗涤管壁。洗涤管壁。 ( (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀) )10) 7500rpm10) 7500rpm离心离心1min1min，弃上清。弃上清。 再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。用用TriZol试剂提取总试剂提取总RNA时，全程均在时，全程均在室温室
17、温进行。进行。当当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在沉淀用水溶解后，应该注意在冰上冰上操作，操作要迅速。操作，操作要迅速。12)12)室温干燥室温干燥3 35min5min。 （干燥的时间由（干燥的时间由RNARNA沉淀大小决定）沉淀大小决定） （干干燥燥后后的的沉沉淀淀应应该该是是无无无无色色色色胶胶胶胶样样样样透透透透明明明明状状状状，沉沉淀淀要要充充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）注意事项注意事项：RNA:避免放在避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无孵箱中过度干燥以防无法溶解。法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，沉淀必须绝对干燥，微量乙醇
18、残留，容易造成容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因不溶解的主要原因 。判断判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。分干燥是逆转录成功的关键环节。RNA pellet：透明胶样：透明胶样干燥后应该无色透明干燥后应该无色透明1313） RNARNA的的溶溶解解：用用加加样样器器吸吸取取冰冰冷冷DEPC-HDEPC-H2 2O O 13.513.5 l l，加加到到RNARNA上，反复吹打溶解上，反复吹打溶解RNARNA沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNARNA应置冰上保存应置冰上保存。14) 14) 吸
19、出吸出 4.5 4.5 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用( (将用于将用于电泳电泳) )。15) 15) 剩余剩余 9 9 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用 （将用于（将用于RTRTPCRPCR）。）。v注意：注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充沉淀的溶解一定要耐心充分，分，一定一定要用加要用加样样器器反复反复多次吹打方可。多次吹打方可。但由于溶液体但由于溶液体积积非常小，要避免出非常小，要避免出现现气气泡影响泡影响RNA的溶解。的溶解。避免气泡的方法：避免气泡的方法：用加样器的第一挡用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：判断溶解程度：吹打时液体
20、流动不拐弯吹打时液体流动不拐弯为止。为止。逆逆转录转录酶酶： 存在于逆存在于逆转录转录病毒体内。病毒体内。 常常见见有哺乳有哺乳动动物型物型37oC，禽，禽类类型型42oC 。 以以mRNA为为模板的模板的DNA聚聚合合酶酶，形成与，形成与RNA碱基相互碱基相互补补DNA链链，后者称，后者称为为互互补补DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉的活性：切掉DNA和和RNA杂杂合合链链上的上的RNA。第二步：逆转录反应第二步：逆转录反应AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-
21、42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h RT第一步：第一步：第一步：第一步：打开打开RNA链之间的二级结构，链之间的二级结构，使使Oligo dT 特异性地结合到特异性地结合到 PolyA 尾。尾。 总总RNA 9 l Oligo dT (0.05 g/ml) 1 l (终浓度：终浓度：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合，轻弹管底混合， 置置65水浴水浴10min， 然后然后立即冰浴立即冰浴2min（防止（防止RNA形成二级结构）。形成二级结构）。 在水浴在水浴10分钟时，开始分钟时，开始RNA电泳。电泳。按照下列方法进行按照下列方法进行RTRT反应：反应：RNA的
22、的变变性性（甲（甲醛变醛变性法）：性法）： 打开打开RNA分子二分子二级结级结构，其分子量和构，其分子量和电电泳距离相关。泳距离相关。 5甲甲醛变醛变性性缓缓冲液冲液 2 l 甲甲酰酰胺胺 10 l 37%甲甲醛醛 2 l RNA样样品品 4.5 l 上样缓冲液上样缓冲液 3 l 混匀后，混匀后， 21.5 l 直接直接电电泳上泳上样样（100伏，伏，1030分分钟钟） 上上样样前可先前可先预电预电泳泳5min。 注意注意: 电泳槽的清洁！电泳槽的清洁！所有试剂、器材、溶液需要灭所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。酶处理。 琼脂糖凝胶要新鲜配制！琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结
23、果紫外透射仪观察电泳结果第三步：第三步：RNA 的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳第二步：第二步：第二步：第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：向上述反应溶液中依次加入下列试剂： 5 RT-buffer 4 l RNasin (40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV 1 l 轻弹管底混合，置轻弹管底混合，置42水浴水浴1h。将上述反应移至将上述反应移至68水浴水浴10min（灭活（灭活RTase），），并冰浴，保存备用。并冰浴，保存备用。混匀后，可用离心机甩一下混匀后，可用离心机甩一下基本过程同基本过程同DNA电泳一样，但：电泳一样，但：1.
24、 必须用对必须用对RNA酶有抑制作用酶有抑制作用DEPC水来配置所有水来配置所有溶液，所有与溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以接触的仪器和装置都要严格处理以尽尽量减少量减少RNA酶对样品的降解酶对样品的降解；2. 因为因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行变性电泳以果，因此电泳时应在变性剂存在下进行变性电泳以打开打开其空间结构其空间结构，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 RNA电电泳泳 RNA电电泳泳结结果果 rRNArRNA可以作为内部可以作为内部MarkerMarker分子，通
25、过观察分子，通过观察rRNArRNA的两条带的两条带（28S28S和和和和18S18S）的比的比的比的比例例例例，可以判断所提取，可以判断所提取mRNAmRNA是是否存在降解。否存在降解。 RNARNA电泳并不能判断电泳并不能判断mRNAmRNA是否提取成功，也不作为鉴是否提取成功，也不作为鉴定定RNARNA提取质量的常规方法，提取质量的常规方法，因为因为在电泳过程中在电泳过程中RNARNA可能发可能发生降解生降解。 分析本次实验结果：分析本次实验结果：28S、 18S和和5S的比例。的比例。RNA电电泳泳结结果分析果分析RT引物的用量非常引物的用量非常少，因为模板量是固少，因为模板量是固定的
26、，而且只进行一定的，而且只进行一次反应。次反应。关键点：关键点：RNA是否充分溶解是否充分溶解根据组织或细胞的量确定逆转录反根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用应的体积，通常利用1ml Trizol试试剂提取出来的总剂提取出来的总RNA适合于适合于20 l体体积的逆转录反应体系。积的逆转录反应体系。引物的量是否合适引物的量是否合适高温退火避免高温退火避免Oligo dT锚锭点错误，锚锭点错误，同时，打开同时，打开RNA链之间的二级结构，链之间的二级结构，利于利于RT。 退火后一定迅速放在冰上退火后一定迅速放在冰上实验报告思考题：实验报告思考题：1.提取细胞内提取细胞内RNA时，如何防止时，如何防止RNA酶的酶的污染？污染？2.如何分析如何分析RNA变性电泳的结果，可以据变性电泳的结果，可以据此准确判断此准确判断RNA是否降解吗？为什么？是否降解吗？为什么？实验结束后：实验结束后：整理实验台；整理实验台；交实验报告；交实验报告；值日生值日。值日生值日。
